李靜，劉芳

作者單位：棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 棗莊 277000

食管鱗癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其占食管癌的 90% 以上，其特征是脂肪和骨骼肌質(zhì)量減少、營養(yǎng)不良。據(jù)最新調(diào)查顯示，食管鱗癌的發(fā)病率正逐年升高，盡管近期食管癌 的預(yù)后有所改善，但仍不能令人滿意。因此，開發(fā)新的抗癌藥物對(duì)病人具有重要的治療價(jià)值。甲氟喹是氯喹的衍生物，是治療瘧疾的常用藥物之一。甲氟奎在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌中均具有抑制腫瘤進(jìn)一步惡化的作用，甲氟喹的主要優(yōu)點(diǎn)是其具有良好的劑量耐受性。于是，我們推測(cè)其對(duì)食管鱗癌的治療可能也具有一定的療效。β 連環(huán)素（β-catenin）是 Wnt通路中的關(guān)鍵核心因子，也是 β-catenin 信號(hào)通路的組成部分，其在人類的多種疾病，包括食管鱗癌中均出現(xiàn)活性異常升高，但其是否在甲氟奎對(duì)食管鱗癌的影響中發(fā)揮作用尚未清楚 。 本研究于2018年8月至2019年4月擬以食管鱗癌細(xì)胞KYSE140為研究對(duì)象，觀察甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，揭示其機(jī)制與甲氟奎失活 β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)，將為甲氟奎抗癌應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

食管鱗癌細(xì)胞 KYSE140 購自 ATCC；甲氟奎由 Unistin?韓國聯(lián)合制藥提供 ；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶均購自美國 Sellect 公司；Lipofectamine2000、BCA 蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連 Takara 公司 ；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）購自德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、ECL 發(fā)光液和 RIPA 蛋白裂解液均購自碧云天生物技術(shù)公司；Matrigel 基質(zhì)膠、Transwell 小室購自美國Coming 公司；凝膠成像分析儀購自柯達(dá)公司；半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國 BIO-RAD 公司；Genesys 10 紫外分光光度計(jì)購自美國 Thermo 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國 Forma Scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將食管鱗癌細(xì)胞 KYSE140 用含10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，置于 37 ℃，5% 二氧化碳的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度 75% 左右，用胰蛋白酶消化約 1 min，按照 1∶3 的比例更換培養(yǎng)基，每 2 天傳代 1 次。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 將甲氟奎（5、10、15、30 μmol∕L）用二甲基亞砜（DMSO）溶解然后用培養(yǎng)基稀釋為 5、10、15、30 μmol∕L，分別處理 KYSE140 細(xì)胞 24、48 、72 h，標(biāo)記為 5 μmol∕L 甲氟奎組、10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組，篩選最適濃度和作用時(shí)間，即 15 μmol∕L 甲氟奎處理 KYSE140 細(xì)胞 48 h，標(biāo)記為甲氟奎組；以 DMSO處理 KYSE140 細(xì)胞 48 h，標(biāo)記為對(duì)照組 ；將 β -catenin 信號(hào)通路激活劑 Wnt3a 用 DMSO 稀釋至 25 mg∕L，處理甲氟奎組細(xì)胞 24 h，標(biāo)記為甲氟奎 +Wnt3a 組，其陰性對(duì)照用等量的 DMSO 處理甲氟奎組細(xì)胞 24 h，標(biāo)記為甲氟奎+DMSO 組。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率對(duì)數(shù)期的KYSE140 細(xì)胞以 10∕mL 的密度種植于 96 孔板，按照上述“1.2.2”方法處理，分別于 24、48 和 72 h 時(shí)每孔細(xì)胞中加濃度為 5 mg∕mL MTT 溶液 20 μL，孵育 4 h，然后添加 150 μL DMSO，待結(jié)晶充分融解，在 490 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度（A）。細(xì)胞抑制率=（1-A∕A）×100%。

1.2.4 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：將 Transwell 小室置于 24 孔板上，平衡 30 min。胰酶消化收集各組 KYSE140 細(xì)胞，用不含血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成 5×10∕mL 的單細(xì)胞懸液。取約為 1×10個(gè)細(xì)胞加入 24 孔板各孔，于 37 ℃培養(yǎng)箱孵育 24 h，棉簽擦去上室細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染液染色。晾干，于倒置顯微鏡下觀察拍照（400 倍），計(jì)數(shù) 5 個(gè)不同視野細(xì)胞數(shù)。

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠和 DMEM 培養(yǎng)基按 1∶8 稀釋后（60 μL）鋪于培養(yǎng)小室上，風(fēng)干后備用，其他步驟同 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中 β-catenin、周期素依賴激酶抑制劑 p21、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、上皮鈣黏素（E-cadherin）的蛋白表達(dá) 各組 KYSE140 細(xì)胞以 RIPA 裂解液于冰上裂解提取總蛋白，BCA 法對(duì)蛋白定量。并采用沸水浴致蛋白變性，目的蛋白采用 SDS-PAGE 電泳分離。濕轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1 h，4 ℃下，將封閉后的 PVDF 膜放入倍比稀釋的一抗中反應(yīng)過夜，洗膜，再在 37 ℃下將 PVDF 膜轉(zhuǎn)入倍比稀釋的二抗中反應(yīng) 2 h。于暗室內(nèi) ECL 試劑盒顯影曝光，以凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。Quantity One 4.62 圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以 GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)細(xì)胞中 β-catenin 的表達(dá) 各組 KYSE140細(xì)胞按 RNA 抽提試劑盒說明書提取 RNA，定量后使用逆轉(zhuǎn)錄 試 劑盒合 成 互補(bǔ) DNA（cDNA）。按 qRTPCR 試劑盒說明書操作檢測(cè) miR-550a 表達(dá)量。以甘油醛 -3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，用 ΔΔCt=(Ct－Ct)－ (Ct－Ct)計(jì)算 β-catenin的表達(dá) 。 引物信息 ：β -catenin，正向引物 5'-CGCTTCTCGGCTTGCT-3′，反向引物 5'-TCCTCCCTCACAGACTCAT-3′；GAPDH，正向引物 5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3 ′，反向引物 5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'。

2 結(jié)果

2.1 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的抑制作用

結(jié)果如表1 所示，與對(duì)照組相比，5 μmol∕L 甲氟奎組 、10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組細(xì)胞的增殖均顯著降低；與 5 μmol∕L 甲氟奎組相比，10 μmol∕L 甲氟奎組、15 μmol∕L 甲氟奎組、30 μmol∕L 甲氟奎組細(xì)胞的增殖均顯著降低；與 10 μmol∕L 甲氟奎組相比 ，15 μmol∕L 甲氟奎組 、30 μmol∕L 甲氟奎組細(xì)胞的增殖均顯著降低（

P

＜0.05）?？梢?，甲氟奎可呈濃度依賴性抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖，且最適濃度為 15 μmol∕L，故選用該濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用

Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，對(duì)照組遷移 和 侵襲細(xì) 胞 數(shù)分別為（120±8）個(gè)、（80±6）個(gè)，甲氟奎組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)分別為（62±5）個(gè)、（45±4）個(gè)，與對(duì)照組相比，甲氟奎組細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低（

t

=15.059、11.889，

P

＜0.05）。

2.3 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖1 和表2 所示，與對(duì)照組相比 ，甲氟奎組細(xì)胞中 p21、E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高，PCNA、N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低（

P

＜0.05）。

2.4 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中 β-catenin 信號(hào)通路的影響

qRT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中 β-catenin 的表達(dá)，結(jié)果如圖2 所示，對(duì)照組 β-catenin mRNA 和蛋白表達(dá)水平分別為（1.00±0.04）、（1.01±0.07），甲氟奎組β -catenin mRNA 和蛋白表達(dá)水平分別為（0.51±0.05）、（0.34±0.03），與對(duì)照組相比，甲氟奎組細(xì)胞中β -catenin 的 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著降低（

t

=18.745、21.550，

P

＜0.05）。

2.5 激活 β-catenin 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)了甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)控

結(jié)果如圖3、表3，表4 所示 ，與甲氟奎 +DMSO 組 相比 ，甲氟奎 +Wnt3a 組細(xì)胞中 β-catenin 蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞的增殖顯著升高，遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高 ，細(xì)胞中 p21、E-cadherin 蛋白表達(dá)顯著降低 ，PCNA、N-cadherin 蛋白表達(dá)顯著升高（

P

＜0.05）。

圖1 甲氟奎處理的食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖2 甲氟奎處理的食管鱗癌細(xì)胞中 β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

圖3 食管癌細(xì)胞中的 β-catenin 信號(hào)通路增殖、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖的影響∕

3 討論

盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，食管鱗癌的發(fā)病率和病死率仍然很高，因此，尋找高效、低毒的腫瘤治療藥物仍然十分重要。甲氟奎在臨床上對(duì)耐氯奎惡性瘧疾的治療效果較好，除此之外其在人類的多種腫瘤中也具有抗癌的功效，但是其在食管鱗癌中的功能及機(jī)制研究甚少。Xu 等研究報(bào)道，甲氟奎可通過阻斷結(jié)直腸癌細(xì)胞中 NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，這說明抗瘧疾藥甲氟奎可單獨(dú)作為抗癌藥在結(jié)直腸癌中應(yīng)用。Xie 等在食管鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)，甲氟奎處理食管鱗癌后，線粒體呼吸鏈中的必需酶 SDHC、SDHD、MTCO3 和 NDUFV3 的表達(dá)均顯著下調(diào)，并通過電鏡觀察到細(xì)胞發(fā)生自噬，揭示甲氟奎可通過誘導(dǎo)線粒體發(fā)生自噬來抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和異種移植小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究通過 MTT 法、Transwell 小室檢測(cè)了甲氟奎處理的食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲發(fā)現(xiàn)，甲氟奎可抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其在食管鱗癌中發(fā)揮抑制癌癥進(jìn)一步惡化的作用，這與 Xie 的研究結(jié)果相呼應(yīng)，再次驗(yàn)證了甲氟奎的抑癌功能，為甲氟奎在癌癥中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。我們又通過 qRT-PCR 法、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了甲氟奎處理的食管鱗癌細(xì)胞中β-catenin 信號(hào)通路關(guān)鍵因子 β-catenin 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，甲氟奎可明顯的抑制食管鱗癌細(xì)胞中 β-catenin 的表達(dá)，失活 β-catenin 信號(hào)通路的活性。Li 等在肝癌的研究中報(bào)道，甲氟奎可抑制小鼠體內(nèi)肝腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制與抑制 β-catenin 信號(hào)通路的活性相關(guān)。我們推測(cè)甲氟奎在食管鱗癌中的功能可能與β -catenin 信號(hào)通路的活化程度也具有一定的相關(guān)性。

表4 激活 β-catenin 信號(hào)通路對(duì)甲氟奎調(diào)控食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響∕

β-catenin 信號(hào)通路涉及腫瘤的免疫逃避、免疫抑制、免疫監(jiān)視。 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)過程中最重要的是 β-catenin 的穩(wěn)定，導(dǎo)致其核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄因子的激活。大部分腫瘤在 Wnt ∕β-catenin 信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子中發(fā)生突變。大量研究證實(shí)，β-catenin信號(hào)通路在食管癌的惡性化進(jìn)展中具有重要 作用。本研究檢測(cè)了甲氟奎處理的食管鱗癌細(xì)胞中 β-catenin 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，甲氟奎可抑制食管鱗癌細(xì)胞中 β-catenin 信號(hào)通路的活性，這說明甲氟奎可抑制 β-catenin 信號(hào)通路的活性在食管鱗癌中發(fā)揮抗癌功能；進(jìn)一步研究通過 β-catenin 信號(hào)通路激活劑和 甲氟奎聯(lián)合處理食管鱗癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn) ，激活 β -catenin 信號(hào)通路可逆轉(zhuǎn)甲氟奎對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲抑制作用，這更充分的說明不僅甲氟奎可抑制 β-catenin 信號(hào)通路的活性，相反，激活 β-catenin 信號(hào)通路也可逆轉(zhuǎn)甲氟奎對(duì)食管鱗癌的抗癌功能。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為甲氟奎在食管鱗癌的治療中的應(yīng)用價(jià)值提供了充分的理論參考，不足的是，我們沒有在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)甲氟奎的功能機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證，這也是本課題下一步的研究計(jì)劃。

綜上所述，甲氟奎可抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制與失活 β-catenin 信號(hào)通路密切相關(guān)，為甲氟奎作為抗癌藥物治療食管鱗癌提供理論參考。