劉亞琪 ，王逸驍 ，胡作為 ，鄭承紅

作者單位：1 武漢市中心醫(yī)院中醫(yī)科，湖北 武漢 430065；2 襄陽市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，湖北 襄陽 441000；3 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065

胃腺癌是最具侵襲性的惡性腫瘤之一，被認為是全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因，胃腺癌預(yù)后不佳，目前手術(shù)治療仍是其主要治療手段，雖然放療、化療、免疫治療、靶向治療改善了胃腺癌病人的預(yù)后，但晚期胃腺癌病人的中位生存期仍不超過 12 個月，由于其治療手段的局限性，且部分病人難以耐受手術(shù)及放化療，西醫(yī)治療帶來的副反應(yīng)等一系列問題，越來越多的胃腺癌病人尋求中醫(yī)治療。六味地黃丸是以“三補三瀉”為特征的滋陰補腎的名方，胃腺癌病人由于手術(shù)耗氣傷陰或腫瘤在體內(nèi)長期消耗，或各種治療引起正氣虧損，陰血不足，最終導(dǎo)致胃陰不足，機體虛弱，無以耐受治療及腫瘤的消耗。腎之氣陰是一身元陰元陽的根本，滋陰補腎，從先天之本養(yǎng)后天消耗之氣陰，培本固元，可對胃腺癌病人起到積極的效果。臨床研究顯示，六味地黃丸可抑制多種腫瘤細胞的活性，且可改善晚期胃癌病人生存質(zhì)量 ，延長其生存期。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對選取的特點信號節(jié)點（Nodes）進行的多靶點藥物分子設(shè)計及分析的新學(xué)科。目前多數(shù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的是單藥或?qū)λ幊煞?，很少有針對中藥?fù)方的研究，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對六味地黃丸抗胃腺癌的主要有效成分、靶點及通路進行系統(tǒng)闡述，以期為后續(xù)實驗及臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物化學(xué)成分的構(gòu)建

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）檢索六味地黃丸中（熟地黃、牡丹皮、澤瀉、山茱萸、山藥、茯苓）所有化學(xué)成分信息，其中熟地黃有關(guān)的化學(xué)成分 76 個，丹皮有關(guān)的化學(xué)成分 55個，澤瀉有關(guān)的化學(xué)成分 46 個，山茱萸有關(guān)的化學(xué)成分 226 個，山藥有關(guān)的化學(xué)成分 71 個，茯苓有關(guān)的化學(xué)成分 34 個。

1.2 口服利用度（OB）和類藥性（DL）篩選

藥物化學(xué)成分篩選選擇 OB≥30%，DL≥0.18 作為有效成分的篩選條件，通過條件篩選，共有 69 個化學(xué)成分符合條件，其中熟地黃 2 個，牡丹皮 11 個，澤瀉 10個，山茱萸 20 個，山藥 16 個，茯苓 15 個，其中相同的化合物有 5 個，故共有 69 個有效成分。

1.3 藥物靶點及疾病靶點的建立

通過 TCMSP 平臺尋找 69 個有效成分對應(yīng)的靶點。并在 Genecard（https：∕∕www.genecards.org∕）、OMIM（https：∕∕omim.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、Drugbank（https：∕∕www.drugbank.com∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）數(shù)據(jù)庫中檢索胃腺癌相關(guān)靶點并進行整合，從而構(gòu)建胃腺癌相關(guān)靶點集合。

1.4 藥物靶點及疾病靶點的匹配

將篩選后的藥物有效成分所對應(yīng)的靶點與疾病相關(guān)靶點進行匹配 ，匹配所得靶點在 STRING 數(shù)據(jù)庫（https：∕∕string-db.org∕）中建立蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。同時運用 Cytoscape3.6.2（http：∕∕www.cytoscape.org∕）進行藥物成分、靶點之間的網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。

1.5 功能富集分析與通路分析

為了說明中藥有效成分對應(yīng)的預(yù)測靶點在基因功能和通路中的作用 ，依托生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫 Metascape（http：∕∕metascape.org），以

P

＜0.01 作為具有統(tǒng)計學(xué)差異的篩選條件，對獲取的靶點進行基因本體（GO）富集和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路注釋分析 。 并將藥物疾病靶點及 KEGG 通路導(dǎo)入 Cytoscape3.6.2 軟件中進行分析。

1.6 分子對接

通過 pubchem 網(wǎng)站（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）檢索獲取核心化合物的3D結(jié)構(gòu)，采用 AutoDock vina1.1.2 軟件對 PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值（degree）前 5 的靶點蛋白與其原配體及核心化合物進行分子對接。通過對接分?jǐn)?shù)值（docking score）對成分與靶點之間的結(jié)合活性進行評價。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

OB（口服生物利用度）使用 TCMSP 內(nèi)部軟件 OBioavail 1.1 計算，OB≥30% 是確定生物活性分子作為治療藥物的指標(biāo)。DL（類藥性）用于評估預(yù)期化合物的“類藥”程度，化合物的“類藥”水平為 0.18，這是傳統(tǒng)中草藥中“類藥”化合物的選擇標(biāo)準(zhǔn)。KEGG 及 GO 富集過程中的

P

值是基于超幾何分布計算的，以

P

＜0.01 作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的篩選條件。分子對接 AutoDock 軟件評價受體和配體之間的匹配情況，結(jié)合能≤-5.0 kcal∕mol 為分子與靶點結(jié)合性較好。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸有效成分

通過在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索 ，獲得全方中的藥物化學(xué)成分共 508 個，將508 個化學(xué)成分根據(jù) OB≥30%，DL≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)進行篩選后共得到 69 個有效成分，見表1。

表1 六味地黃丸有效成分列表

續(xù)表1 六味地黃丸有效成分列表

2.2 六味地黃丸作用靶點

根據(jù) TCMSP 數(shù)據(jù)庫中的有效成分靶點信息，共收集到六味地黃丸中有效成分的相關(guān)作用靶點共 506 個，其中丹皮 214 個、茯苓 23 個、山藥 122 個、山茱萸 108 個、熟地 30 個和澤瀉 9 個 。 從 Genecard、OMIM、TTD、Drugbank、Dis-GeNET 等數(shù)據(jù)庫中檢索胃腺癌相關(guān)靶點后 進行整合 ，共獲得 6198 個疾病相關(guān)靶點 。 將藥物相關(guān)靶點與疾病相關(guān)靶點進行對比分析，取交集可以得到156 個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在 STRING 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建上述 156 個靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。由于單獨孤立的蛋白與其他蛋白無相互作用，均不在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)，故此網(wǎng)絡(luò)中共包含 147 個節(jié)點，1 048 條邊。節(jié)點大小及顏色由 degree 的大小表示，節(jié)點越大對應(yīng)的 degree 越大，顏色由紅色到藍色，對應(yīng)的 degree 越大（圖1）。對 PPI 進行拓撲特征分析，選取在“ 度值 ”（degree），“ 中介中心性 ”（betweenness），“ 接近中心性 ”（closeness）3 個參數(shù)均大于中位數(shù)的點作為核心靶點，連續(xù)進行 3 次篩選后，得到20 個重要核心靶點 ，具體包括 JUN（degree=48，closeness=0.857） ，MAPK1 （degree=52，closeness=0.837），IL-6（degree=52，closeness=0.800），AKT1（degree=64，closeness=0.783），MAPK8（degree=53，closeness=0.783），VEGFA（degree=43，closeness=0.766），MYC（degree=40，closeness=0.735），ESR1（degree=33，closeness= 0.692），EGF（degree=39，closeness=0.692），HSP90AA1（degree=42，closeness=0.679），RELA（degree=34，closeness=0.679），F(xiàn)OS （degree=29，closeness=0.667），EGFR（degree=35，closeness=0.667），CCND1（degree=37，closeness=0.667），AR（degree=29，closeness=0.667），MMP9（degree=35，closeness=0.667） ， STAT1 （degree=29， closeness=0.667），IL1B（degree=35，closeness=0.655），PPARG（degree=25，closeness=0.655），PTGS2（degree=32，closeness=0.655）?；?20 個重要核心靶點，根據(jù)相關(guān)有效成分，進一步構(gòu)建藥物有效成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò) ，通 過 Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)圖分析可以發(fā)現(xiàn) ：丹皮通過quercetin（MOL000098）、kaempferol（MOL000422）、5-［［5-（4-Methoxyphenyl）-2-furyl］methylene］barbituric acid（MOL007374）作用于 20 個核心靶點發(fā)揮作用 ，山藥通過 diosgenin（MOL000546）、AIDS180907（MOL005465）、（-）-taxifolin（MOL001736）、Kadsurenone（MOL000322）、Stigmasterol（MOL000449）對PTGS2、RELA、VEGFA、AKT1、ESR1、HSP90AA1、AR 核心靶點發(fā)揮作用，山茱萸通過 Tetrahydroalstonine（MOL008457）、beta-sitosterol（MOL000358）、Hydroxygenkwanin （MOL005530） 、 Mandenol（MOL001494）、Cornudentanone（MOL005503）、2，6，10，14，18-pentamethylicosa-2，6，10，14，18-pentaene（MOL005481）對 AR、HSP90AA1、PPAGR、PTGS2、JUN 等核心靶點發(fā)揮作用 ，茯苓和熟地分別通過hederagenin （MOL000296） 及 Stigmasterol（MOL000449）對 PTGS2 發(fā)揮作用 。 這些藥物有效成分及靶點的相互作用，體現(xiàn)了六味地黃丸多成分多靶點抗胃腺癌的作用關(guān)系。見圖2。

2.4 GO 富集分析

將六味地黃丸活性成分預(yù)測出的 156 個作用靶點通過 Metascape 生物分子功能注釋系統(tǒng)進行 GO 富集分析 ，包括 GO BP 生物過程分析（biological process）、GO MF 分子功能（molecular function）分析 和 GO CC 細胞組分分析（cellular component）。在其中每項排名前 10 的條目，見表2。

其中 GO BP 中 response to inorganic substance，response to toxic substance，cytokine-mediated signaling pathway 靶點富集較集中 ；GO MF 中 protein kinase binding，transcription factor binding，protein domain specific binding 靶點相對集中富集；在 GO CC中與 membrane raft，transcription factor complex，perinuclear region of cytoplasm 相關(guān)性最大。

2.5 KEGG 通路富集分析

為了進一步揭示六味地黃丸抗胃腺癌的潛在作用機制，通過對 156 個候選靶點進行 KEGG 通路富集分析，依據(jù)

P

＜0.01 進行篩選共獲得 36 條相關(guān)通路，涉及腫瘤、代謝、免疫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡等多個方面，將 36 個通路根據(jù) P值由小到大進行排序 。 排在前5位的依次是hsa05200：Pathways in cancer 信號通路、hsa04933：晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGERAGE） in diabetic complications 信號通路 、hsa04668：腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、hsa04066：缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路 、hsa01524：Platinum drug resistance 信號通路，將獲得的靶點及前 20項信號通路導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.2 進行分析 ，構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò) ，根據(jù) degree 排序 ，發(fā)現(xiàn) KEGG 通路富集前 5 位的依次是腫瘤信號通路（hsa05200，degree=49）、AGE-RAGE 信號通路（hsa04933，degree=27）、TNF 信號通路（hsa04668，degree=22），HIF-1 信號通路 （hsa04066，degree=20） 、鉑耐藥信號通路（hsa01524，degree=16），提示六味地黃丸越可能通過這些通路發(fā)揮作用。

2.6 分子對接

將 PPI 網(wǎng)絡(luò)中排名前 5 的靶點蛋白分別與槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、薯蕷皂苷（Diosgenin）和四氫鴨腳木堿（Tetrahydroalstonine）進行分子對接驗證，以對接分?jǐn)?shù)來評價核心成分與靶點之間的相互作用，若結(jié)合能＜0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能＜-5.0 kcal∕mol，表明其結(jié)合性好，結(jié)合能越小對接越好。然后將 5 個靶點蛋白與其原配體進行對接，得到的對接分?jǐn)?shù)作為參照，用于評價 4 個核心成分與靶點蛋白的對接結(jié)果，見表3。從結(jié)果可以看到，4 個核心成分與靶點蛋白均能較好的對接，JUN 與山柰酚的結(jié)合優(yōu)于原配體，MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 與薯蕷皂苷結(jié)合優(yōu)于原配體。

表2 六味地黃丸活性成分預(yù)測出的 156 個作用靶點 GO 富集分析

表3 靶點蛋白與六味地黃丸中 4 個核心成分及原配體的對接分?jǐn)?shù)∕（kcal∕mol）

將前五個靶標(biāo)基因結(jié)合最好的化合物進行分子對接展示 ，詳見圖3。 其中山柰酚（kaempferol）與JUN 結(jié)合最好，薯蕷皂苷（diosgenin）與 MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8 結(jié)合最優(yōu) 。 圖3A 為 kaempferol 和JUN 之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基 Ser155、Asn156、Lys55 與 kaempferol 配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基 Val158、Ala113、Met111、Asp112、Ile32、Ala53、Val40、Gly35、Leu168 與 kaempferol 配體小分子形成疏水相互作用 ，圖3B 為 diosgenin 和 MAPK1之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基 Thr110、Glu109、

Ile31、Gly32、Val39、Glu33、Gly34、Tyr36、Asp167、Asn154、Leu156、Ser153、Met108、Asp111、Lys114 與diosgenin 配體小分子形成疏水相互作用，圖3C 為diosgenin 和 IL-6 之間的結(jié)合模式 ，氨基酸殘基Asn63、Pro65、Glu93、Tyr97、Thr143、Leu147、Lys150與 diosgenin 配體小分子形成疏水相互作用，圖3D 為diosgenin 和 AKT1之間的結(jié)合模式 ，氨基酸殘基Gly311 與 diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基 Phe161、Tyr160、Gly162、Gly159、Val164、Asp292、Lys276、Leu295、Thr312 與 diosgenin配體小分子形成疏水相互作用，圖3E 為 diosgenin 和MAPK8 之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基 Lys153 與 diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用，基酸殘基Asp169、Ser155、Asn114、Leu168、Ser34、Ile32、Gly33、Val40、Lys55、Gly35、Gln37、Ala36、Asp151 與diosgenin 配體小分子形成氫鍵相互作用。

圖1 156個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 圖2 六味地黃丸有效成分-抗胃腺癌核心靶點網(wǎng)絡(luò) 圖3 六味地黃丸活性化合物成分和抗胃腺癌活性蛋白質(zhì)相互作用分析：3A為山柰酚和JUN之間的結(jié)合模式；3B為薯蕷皂苷和MAPK1之間的結(jié)合模式；3C為薯蕷皂苷和IL-6之間的結(jié)合模式；3D為薯蕷皂苷和AKT1之間的結(jié)合模式；3E為薯蕷皂苷和MAPK8之間的結(jié)合模式

3 討論

六味地黃丸源于宋代醫(yī)學(xué)家錢乙的《小兒藥證直訣》，由熟地黃、丹皮、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓 6味藥組成，是滋補腎陰的名方。近代研究表明，六味地黃丸具有防治胃癌的作用。如石金鳳研究發(fā)現(xiàn)中、高劑量六味地黃丸聯(lián)合 5-氟尿嘧啶（5-Fu）可顯著抑制胃癌細胞的生長，且可減輕 5-Fu 注射液對胃癌荷瘤鼠的毒副作用。江良縣通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，六味地黃丸聯(lián)合 FOLFOX6 方案可延長晚期胃癌病人的生存期，降低化療毒副反應(yīng)，提高化療療效。簡詠梅等報道六味地黃丸可顯著降低胃癌相關(guān)炎性因子的表達而降低糖尿病小鼠胃癌的發(fā)生風(fēng)險。但六味地黃丸治療胃癌的作用機制及有效成分尚不明確。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討六味地黃丸抗胃腺癌的作用機制，從全方六味中藥獲得 508 個成分，按 OB≥30%，DL≥0.18 篩選，共獲取 69 個有效成分，將有效成分靶點與疾病相關(guān)靶點進行比對后，得到 156 個六味地黃丸抗胃腺癌的可能作用靶點。對其進行拓撲分析發(fā)現(xiàn) 20 個重要核心靶點 ，依次是 JUN、MAPK1、IL-6、AKT1、MAPK8、VEGFA、MYC、ESR1、EGF、HSP90AA1、RELA、FOS、EGFR、CCND1、AR，MMP9、STAT1、IL1B、PPARG、PTGS2。在藥物有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中對 20個核心靶點再分析，根據(jù) degree 降序可發(fā)現(xiàn)其中槲皮 素（quercetin，MOL000098）與18個核心靶點相關(guān)，山柰酚（kaempferol，MOL000422）與 9 個核心靶點相關(guān)，薯蕷皂苷（diosgenin，MOL000546）與4個核心靶點有關(guān) ，四氫鴨腳木堿（Tetrahydroalstonine，MOL008457）與 4 個核心靶點有關(guān)。推測槲皮素及山柰酚是六味地黃丸抗胃腺癌的主要成分，其次是薯蕷皂苷及四氫鴨腳木堿。

進一步通過 GO 功能富集分析，可以發(fā)現(xiàn)六味地黃丸的作用涉及多個生物學(xué)過程，并更可能通過細胞毒性、氧化應(yīng)激、代謝及凋亡功能發(fā)揮其抗胃腺癌的作用。通過 KEGG 通路富集分析，我們共發(fā)現(xiàn) 36 條相關(guān)信號通路，其中 Cancer 信號通路、AGERAGE 信號通路、TNF 信號通路富集較集中，其次是HIF-1信號通路及 Platinum drug resistance 信號通路，推測這些通路可能是六味地黃丸發(fā)揮作用的主要信號通路。進一步通過有效成分-靶點-通路富集分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷和四氫鴨腳木堿主要通過 AGE-RAGE 信號通路和 TNF 信號通路發(fā)揮作用。AGE-RAGE 信號通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，研究表明，槲皮素能通過抑制 RAGE 基因的表達，提升細胞凋亡與自噬作用 ，增加腫瘤細胞的死亡率達到抗癌的功效。TNF 信號通路中的多個蛋白在胃癌細胞的增殖、生存等過程中起著重要作用，研究表明槲皮素和山柰酚均可通過調(diào)節(jié) TNF 等凋亡基因的表達抑制腫瘤的增殖，薯蕷皂苷可通過上調(diào) TNFR1∕TNF-α 的 mRNA 的表達顯著抑制胃癌細胞 HGC-27的增殖。以上的結(jié)果表明，熟地、丹皮、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉可通過多個成分對胃腺癌多個靶點及多條通路作用，不局限于單一成分、單一靶點及單一通路。槲皮素、山柰酚、薯蕷皂苷及四氫鴨腳木堿可能是六味地黃丸的主要有效成分，可通過多個靶點對 Cancer 信號通路 、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路發(fā)揮作用。六味地黃丸的其他有效成分也參與調(diào)控了多個靶點及通路，體現(xiàn)了六味地黃丸多成分、多靶點、多通路協(xié)同作用抗胃腺癌的機制。根據(jù)以上結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在鉑耐藥通路中同樣有多個靶點富集，這與目前臨床研究六味地黃丸聯(lián)合化療治療晚期胃癌可抑制腫瘤生長，提高化療療效，改善病人生存質(zhì)量不謀而合，值得今后根據(jù)有效成分、作用靶點及信號通路進一步研究。

綜上所述。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對六味地黃丸治療胃腺癌的有效成分、核心靶點、作用通路進行了分析，并基于分子對接技術(shù)模擬其可能分子作用機制，為下一步實驗研究六味地黃丸治療胃腺癌提供了理論依據(jù)和線索。當(dāng)然，由于本研究是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行的理論推測，其中可能存在假陰性或者假陽性的結(jié)論。均有待于進一步的實驗驗證。