趙娜萍，周 佳，譚 軍，鄧 敏，張 黎，王 卓*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200092)

咖啡因是一種中樞興奮藥，具有提高多巴胺受體的敏感性、阻斷腺苷受體和苯二氮受體等多種藥理學(xué)作用[1]，常被添加至飲料和食品中，許多藥品中含有咖啡因，大約有60多種天然植物中也有咖啡因成分[2]。藥效學(xué)研究證明，低、中攝入量的咖啡因?qū)Υ竽X有很多積極作用，包括興奮大腦、振奮精神、提高注意力、改善情緒等[3]。在高強度、高要求、高度緊張的作業(yè)環(huán)境下，咖啡因制劑可以提升人員的認(rèn)知作業(yè)和體力作業(yè)效率，并且可以在缺乏睡眠的情況下有效保持機體警覺.因其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼肌具有興奮作用，甚至在某些高強度極端環(huán)境下能提升人員的快速反應(yīng)力，有效提高工作效率[4]，因此具有較大的應(yīng)用前景。本研究的健康受試者服用咖啡因緩釋片，一天兩次口服給藥，減少用藥次數(shù)，提高用藥依從性，建立了簡單、快速、準(zhǔn)確的HPLC法測定血漿中的咖啡因濃度，計算藥動學(xué)參數(shù)，考察了咖啡因緩釋片的藥動學(xué)特性。

1 材料和方法

1.1 儀器和試藥 (1)儀器：LC-2010A型高效液相系統(tǒng)，包括ACE 5 C18-AR色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)由日本島津公司提供；5804R高速冷凍離心機和移液器(10～100 μl、20～200 μl、100～1000 μl)由Eppendorf公司提供；AG285十萬分之一電子分析天平(Mettler Toledo公司)。(2)試劑和藥品：受試制劑咖啡因緩釋片(規(guī)格300 mg/片，某大學(xué)自行研發(fā)，批號0807448)；參比制劑安鈉咖片(規(guī)格150 mg/片，四川錫成藥業(yè)有限公司，批號090401)；甲醇(色譜純，Tedia公司)；咖啡因?qū)φ掌?純度99.8%，批號100807)和二羥丙茶堿(純度99.5%，批號0902272)由某大學(xué)提供。空白人血漿來自健康受試者。

1.2 受試者選擇 入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～40歲，男性；(2)體重指數(shù)(BMI)為19～24 kg/m2；(3)實驗室檢查，包括血常規(guī)、尿常規(guī)、血液生化檢查、心電圖檢查、胸片檢查等，結(jié)果正?；虍惓o臨床意義；(4)無心、肝、腎、消化道和血液系統(tǒng)等疾病史；(5)不吸煙，不嗜酒。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)健康檢查不符合入選標(biāo)準(zhǔn)；(2)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)的明確病史或其他顯著疾病；(3)有明確的藥物過敏史或體位性低血壓史；(4)篩選前3個月內(nèi)參加過其他臨床藥物試驗或有獻血史；(5)篩選前2周內(nèi)服用過可能影響本試驗結(jié)果的藥物；(6)濫用毒品者。本試驗方案經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署書面知情同意書，按GCP要求實施試驗方案。共入組10例男性健康受試者，年齡21～27歲，平均年齡22歲，BMI 19.71～23.67 kg/m2，平均BMI為21.97 kg/m2。

1.3 試驗設(shè)計 采用兩制劑雙周期交叉試驗設(shè)計，兩個試驗周期之間的清洗期為1周。將10例男性健康受試者按體重從輕到重依次編號，若體重相同，則再按身高由低到高依次編號，然后采用隨機數(shù)字表法，隨機分為兩組，每組5例。受試者于給藥前1 d入選，在給藥前進行生命體征、體格、實驗室、心電圖和胸片檢查。首次給藥前一天晚餐后開始禁食(禁食至少10 h)，給藥當(dāng)日早晨7：00空腹，用200 ml溫開水送服規(guī)定劑量的試驗藥物。試驗組在第1個周期口服受試制劑(咖啡因緩釋片，300 mg)，對照組在第1個周期口服參比制劑(安鈉咖片，150 mg)，服藥后2 h可飲水，4 h后進食統(tǒng)一低脂膳食。首次給藥后第4天早晨7：00空腹再次給藥，2 h后進餐。之后，試驗組每12 h用藥一次，300 mg/次；對照組每6 h用藥一次，150 mg/次，連續(xù)給藥4 d。第7天咖啡因緩釋片僅早晨給藥一次，安鈉咖片給藥兩次。間隔1周的清洗期后再交叉給藥。受試者在第1、2個周期首次服藥當(dāng)天和第7天在Ⅰ期病房至少留觀12 h，由Ⅰ期病房的醫(yī)師和護士觀察受試者的心率、血壓及皮疹、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、眩暈、頭痛等藥品不良反應(yīng)(ADRs)發(fā)生情況。整個試驗期間受試者禁止飲用含柑橘、檸檬、葡萄、柚子、咖啡因、酒精或黃嘌呤的飲料，禁止劇烈運動及白天長時間躺臥。試驗結(jié)束時再次進行生命體征、體格、實驗室和心電圖檢查。

1.4 血樣采集 對照組在第1次給藥前及給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、14、24 h，第11～14次給藥前及第14次給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6 h，第15次給藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、14、24 h，分別于肘靜脈采血1.5 ml。試驗組在第1次給藥前及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、15、24、36、48 h，第5～8次給藥前及第8次給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、10、15、24、36、48 h，分別于肘靜脈采血1.5 ml。肝素抗凝，置一次性塑料離心管中，以相對離心力1.5×104×g離心10 min，分取血漿置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 咖啡因血漿濃度的測定 (1)溶液的配制：①精密稱取咖啡因?qū)φ掌?.025 0 g，置25 ml棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為1 mg/ml的咖啡因?qū)φ掌穬湟海瑢⒃搩湟褐? ℃冰箱保存?zhèn)溆?。②精密稱取二羥丙茶堿對照品0.025 0 g，置50 ml棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得濃度為500 μg/ml的二羥丙茶堿(內(nèi)標(biāo))儲備液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。取適量內(nèi)標(biāo)儲備液用50%甲醇水溶液稀釋，配置成0.5 μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作液。③取適量咖啡因?qū)φ掌穬湟?，?0%甲醇水溶液稀釋，配置成系列濃度為2、10、20、33.333、50、80、100 μg/ml的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。另外配置10、33.3、80 μg/ml的質(zhì)控工作液。(2)血漿樣品預(yù)處理：吸取血漿樣品0.3 ml，置1.5 ml離心管中，加濃度0.5 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液30 μl，渦旋混勻10 s，加入10%三氯乙酸水溶液120 μl，渦旋混勻3 min，以相對離心力4.5×103×g離心10 min，取上清液10 μl進樣分析。(3)HPLC法測定：用HPLC法測定人血漿中咖啡因的濃度，選擇ACE 5 C18-AR色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.2%乙酸溶液(17∶83)，流速1.0 ml/min；檢測波長274 nm；進樣體積10 μl；每個樣品的分析時間17 min。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 專屬性試驗 測定空白血漿、空白血漿+咖啡因?qū)φ掌?內(nèi)標(biāo)(咖啡因濃度2000 ng/ml)，以及用藥后血漿樣品+內(nèi)標(biāo)的色譜圖(見圖1)。由圖1可見，咖啡因和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為 9.0和15.6 min，兩者分離度>1.5，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾咖啡因和內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 咖啡因的HPLC譜圖

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取0.27 ml空白血漿，加入30 μl不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和30 μl內(nèi)標(biāo)溶液，使血漿中咖啡因濃度分別為200、1000、2000、3333.3、5000、8000、10 000 ng/ml。按1.5項下血漿樣品預(yù)處理方法處理后，進樣分析。以咖啡因峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，做加權(quán)直線回歸計算。得到線性回歸方程為：y=0.000 3x-0.002 2(r=0.999 9)，線性范圍為200～10 000 ng/ml。血漿中咖啡因定量下限為200 ng/ml(S/N>10)。

1.6.3 精密度試驗和準(zhǔn)確度試驗 取0.27 ml空白血漿，加入30 μl內(nèi)標(biāo)溶液和30 μl不同濃度的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，制備咖啡因濃度為1 000、3 333.3、8 000 ng/ml的含藥血漿，按1.5項下血漿樣品預(yù)處理方法處理。取3個批次的血漿樣品，每種濃度平行制備5份，連續(xù)3 d，用HPLC法測定濃度，計算日內(nèi)、日間RSD和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 咖啡因血漿濃度測定的精密度和準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

1.6.4 回收率試驗 取0.27 ml空白血漿，加入30 μl不同濃度的咖啡因質(zhì)控工作液及30 μl內(nèi)標(biāo)溶液，制備咖啡因濃度為1 000、3 333.3、8 000 ng/ml的含藥血漿，按1.5項下血漿樣品預(yù)處理方法處理，進樣測定。將空白血漿換成去離子水，同法操作，測定濃度，作為對照。最終得到低、中、高濃度咖啡因的提取回收率分別為(99.34±2.21)%、(103.56±4.78)%、(106.52±5.31)%(n=5)，符合生物樣品分析要求。

1.6.5 穩(wěn)定性試驗 配置低、中、高3種不同濃度的質(zhì)控樣品，按以下條件分別處理。(1)將質(zhì)控樣品按1.5項下血漿樣品預(yù)處理方法處理后，在自動進樣器中室溫放置24 h，進樣測定；(2)將質(zhì)控樣品在室溫與-20 ℃冰箱放置兩種條件之間反復(fù)凍融3個循環(huán)，第3次凍融后，按照血漿樣品預(yù)處理方法處理，進樣測定；(3)將質(zhì)控樣品在-20 ℃冰箱中放置30 d后，分別按照血漿樣品預(yù)處理方法處理，進樣測定。結(jié)果見表 2。結(jié)果表明，含藥血漿溶液在上述條件下放置均能夠保持穩(wěn)定。

表2 血漿中咖啡因的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 單次給藥的藥動學(xué)參數(shù) 10例健康受試者分別單次口服150 mg安鈉咖片或300 mg咖啡因緩釋片后，經(jīng)DAS 2.1.1軟件處理，分別計算出相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表3。

表3 單次口服安鈉咖片和咖啡因緩釋片后的藥動學(xué)參數(shù)

2.2 多次給藥的藥動學(xué)參數(shù) 10例健康受試者分別多次口服安鈉咖片或咖啡因緩釋片的藥-時曲線見圖2。經(jīng)DAS 2.1.1軟件處理，分別計算出咖啡因的藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。

圖2 多次口服安鈉咖片和咖啡因緩釋片后的咖啡因藥-時曲線

表4 多次口服安鈉咖片和咖啡因緩釋片后的藥動學(xué)參數(shù)

2.3 藥動學(xué)參數(shù)的比較 從藥動學(xué)參數(shù)上可以看出，與安鈉咖片相比，咖啡因緩釋片單次給藥和多次給藥的cmax稍有區(qū)別，但無統(tǒng)計學(xué)差異；tmax延長，多次給藥的波動系數(shù)(DF)減小(P<0.05)，表明咖啡因緩釋片具有明顯緩釋特性。多次口服安鈉咖片和咖啡因緩釋片的AUC0-t顯著高于單次口服給藥[(146.55±54.44) mg·h·L-1vs(29.69±8.34) mg·h·L-1,(172.28±83.63) mg·h·L-1vs(72.42±42.38) mg·h·L-1，P<0.05]，提示多次連續(xù)給藥后，咖啡因在體內(nèi)有一定的蓄積。

3 討 論

目前文獻報道的咖啡因含量測定方法中，也有使用HPLC-MS法，雖然靈敏度較高，但線性關(guān)系稍差，單次檢測存在偏差，并且檢測成本較高[5]。因此，本文建立了HPLC法測定咖啡因的血漿濃度，參考以往研究采用了蛋白沉淀法對血漿樣品做預(yù)處理[6]，從血漿中分離咖啡因，操作簡單；內(nèi)標(biāo)采用咖啡因類似物二羥丙茶堿[7]，保留時間適當(dāng)，分離度好，因此本研究采用的HPLC法能滿足測定需要，簡便、易操作、經(jīng)濟、快速。

在臨床應(yīng)用中，與普通片劑相比，緩釋制劑可較長時間保持有效血藥濃度，減少血藥濃度的波動，達到有效、長效、穩(wěn)定、安全用藥的目的，同時也能減少血藥濃度波動帶來的ADRs。在本次臨床試驗過程中，10例健康受試者均未發(fā)生明顯的ADRs。

咖啡因是臨床最常用的中樞神經(jīng)興奮劑[2]，能促進神經(jīng)系統(tǒng)激活，并加強骨骼肌收縮，從而有助于機體快速反應(yīng)。研究表明，在高度壓力和睡眠不足的情況下，服用較高劑量的咖啡因可以使受試者保持認(rèn)知功能，增強大腦警惕性和邏輯性，提高工作效率[7]。這可能與咖啡因是腺苷受體拮抗劑有關(guān)，咖啡因結(jié)合腺苷受體，主要作用于A1和A2A受體[2，7]，而這些受體又與睡眠相關(guān)的大腦功能有關(guān)[8]。基于咖啡因的藥理學(xué)特征及其與睡眠的關(guān)系，咖啡因在臨床和某些特殊要求的作業(yè)環(huán)境下具有良好的應(yīng)用前景。本研究所用的咖啡因緩釋片每日僅需服藥兩次，而普通片劑需要每日服藥4次，緩釋片減少了服藥次數(shù)，有助于提高用藥依從性，更方便、安全，且作用持久。本研究對于咖啡因緩釋制劑的研發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。