崔曉博，李明春，劉 旭，程艷芹

(海軍第九七一醫(yī)院藥劑科，山東青島 266071)

復(fù)方參芪片為海軍第九七一醫(yī)院的自制制劑[批準(zhǔn)文號(hào)：總制字(2016)F405002]，由補(bǔ)骨脂(君藥，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、固精縮尿、溫脾止瀉、納氣平喘等功效)、黃芪(君藥，具有益衛(wèi)固表、利尿消腫、托毒生肌等功效)、丹參、降香等十五味藥材制成，具有疏風(fēng)祛濕、通絡(luò)達(dá)表、滋補(bǔ)肝腎的功效，主治白癜風(fēng)。該制劑經(jīng)臨床使用多年，療效確切。為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，保證其臨床用藥的安全性和有效性，本研究對(duì)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的薄層鑒別法進(jìn)行修訂和增補(bǔ)，并增加了制劑中主要成分補(bǔ)骨脂的含量測(cè)定項(xiàng)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 JM-B2102型百分之一電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司)；FA1604型萬(wàn)分之一電子分析天平(上海衡平儀表廠)；DV215CD型十萬(wàn)分之一電子天平(美國(guó)OHAUS公司)；SY2200-T型超聲波清洗器(上海聲源超聲儀器設(shè)備有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；WD-9340C型紫外分析儀(北京六一儀器廠)；電熱恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)。

1.2 試藥 以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)；補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110739-201115，含量為99.9%)、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110738-201313，含量為100%)、黃芪甲苷(批號(hào)110781-201314，含量為96.9%)、柴胡皂苷對(duì)照品(批號(hào)110778-201310，含量為97.3%)，補(bǔ)骨脂(批號(hào)121056-200904)、丹參(批號(hào)120923-201414)、柴胡(批號(hào)120992-201108)、黃芪(批號(hào)121462-201304)、當(dāng)歸(批號(hào)120927-201516)對(duì)照藥材均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈及甲醇均為一級(jí)色譜純(天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；復(fù)方參芪片樣品(批號(hào)20140421、20140910、20150317)、陰性樣品及蒸餾水均為海軍第九七一醫(yī)院自制；其他試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 補(bǔ)骨脂的薄層鑒別[1-2]取復(fù)方參芪片，研細(xì)，稱取粉末10 g，加入甲醇40 ml，超聲20 min后過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml溶解，用乙酸乙酯30 ml分兩次振搖提取，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。取缺補(bǔ)骨脂的復(fù)方參芪片陰性樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。取補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加入甲醇，制成濃度各為1 mg/ml的對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶液5 μl、對(duì)照藥材溶液7 μl、對(duì)照品溶液3 μl、陰性對(duì)照溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)(上層黃綠色斑點(diǎn)為異補(bǔ)骨脂素，下層淡黃色斑點(diǎn)為補(bǔ)骨脂素)，而陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置上顯示藍(lán)色斑點(diǎn)，無(wú)干擾。見圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂的薄層色譜圖

2.1.2 丹參的薄層鑒別[2-3]取復(fù)方參芪片，研細(xì)，稱取粉末2 g，加水10 ml溶解，以相對(duì)離心力8.05×g離心5 min，取上清液，加稀鹽酸調(diào)pH至2，加乙酸乙酯20 ml，振搖提取，提取液置水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。取缺丹參的復(fù)方參芪片陰性對(duì)照樣品2 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。取丹參對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-丙酮-甲酸(25∶10∶4)為展開劑，展開，取出，晾干后，置氨蒸汽中熏后，在空氣中放置10 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯黃綠色斑點(diǎn)，而缺丹參的復(fù)方參芪片陰性對(duì)照溶液在相應(yīng)位置上顯藍(lán)色斑點(diǎn)，無(wú)干擾。見圖2。

圖2 丹參的薄層色譜圖

2.1.3 柴胡的薄層鑒別[2，4]取復(fù)方參芪片，研細(xì)，稱取粉末10 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，加水飽和的正丁醇提取2 次(30 ml/次)，合并正丁醇液，加氨試液(40 ml濃氨水加水稀釋到100 ml)40 ml洗滌，棄去氨試液，蒸干正丁醇，殘?jiān)蛹状? ml溶解，作為供試品溶液。取缺柴胡的復(fù)方參芪片陰性對(duì)照樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。取柴胡對(duì)照藥材1 g，加水50 ml，煮沸30 min，放冷，過(guò)濾，濾液加水飽和正丁醇振搖提取2次，同法制成對(duì)照藥材溶液。取柴胡皂苷對(duì)照品，加甲醇，制成濃度為1 mg/ml的對(duì)照品溶液。吸取復(fù)方參芪片供試品溶液5 μl、對(duì)照藥材溶液5 μl、對(duì)照品溶液5 μl、陰性對(duì)照溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-乙酸乙酯-稀氨水(1→10，即將濃氨水體積稀釋10倍)(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑[4]，展開，取出，晾干，噴以2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液(1→10)，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，均顯相同的粉紅色斑點(diǎn)，同時(shí)陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見圖3。

圖3 柴胡的薄層色譜圖

2.1.4 黃芪的薄層鑒別[5-6]取復(fù)方參芪片，研細(xì)，稱取粉末10 g，加水飽和正丁醇60 ml，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液用1% NaOH溶液洗滌3次，每次15 ml，棄去NaOH溶液，用水飽和的正丁醇洗至中性，棄去水液，置水浴蒸干正丁醇，殘?jiān)眉状? ml溶解，作為供試品溶液。取缺黃芪的復(fù)方參芪片陰性對(duì)照樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成濃度為1 mg/ml的對(duì)照品溶液。吸取上述4種溶液各3 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)的下層溶液為展開劑[5]，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖4。

圖4 黃芪的薄層色譜圖

2.1.5 當(dāng)歸的薄層鑒別[2]取復(fù)方參芪片，研細(xì)，稱取粉末10 g，加乙酸乙酯40 ml，超聲30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，加乙醇1 ml溶解，作為供試品溶液。取缺當(dāng)歸的復(fù)方參芪片陰性對(duì)照樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的白色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見圖5。

圖5 當(dāng)歸的薄層色譜圖

2.2 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜 條 件

Agilent XDB-C18 色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(34∶66)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm，柱溫25 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。理論塔板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計(jì)算均≥3000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品11.32 mg和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品10.04 mg，分別置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，分別作為對(duì)照品儲(chǔ)備液1(補(bǔ)骨脂素濃度為113.1 μg/ml )和對(duì)照品儲(chǔ)備液2(異補(bǔ)骨脂素濃度為100.4 μg/ml)。精密量取兩種對(duì)照品儲(chǔ)備液各10 ml，用甲醇定容至50 ml容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液(補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度分別為22.62和20.08 μg/ml)。

2.2.3 供試品溶液的制備 取復(fù)方參芪片樣品適量，研細(xì)，精密稱定0.2 g，置于具塞玻璃錐形瓶中，精密加入20 ml甲醇，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足缺失重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺補(bǔ)骨脂的陰性樣品粉末，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備缺補(bǔ)骨脂的陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μl，分別按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰。結(jié)果樣品中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素峰與其他組分色譜峰分離良好，陰性對(duì)照對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。見圖6。

圖6 復(fù)方參芪片的HPLC譜圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1(補(bǔ)骨脂素濃度為113.1 μg/ml)和對(duì)照品儲(chǔ)備液2(異補(bǔ)骨脂素濃度為100.4 μg/ml)2.5、5.0、10.0、12.5、17.5、20.0、25.0 ml，分別用甲醇定容至50 ml容量瓶中，得濃度為5.65、11.31、22.62、28.27、39.58、45.23、56.54 μg/ml的系列補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液和濃度為5.02、10.04、20.08、25.10、35.14、40.16、50.20 μg/ml的系列異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液。將上述不同濃度的補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液和異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液分別注入色譜儀，進(jìn)樣量為10 μl，記錄色譜峰。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得補(bǔ)骨脂素回歸方程為：Y=65.51X-6.817(r=0.999 9，n=7)。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素在5.65～56.54 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。異補(bǔ)骨脂素回歸方程為：Y=70.27X+11.33(r=0.999 9，n=7)。結(jié)果表明，異補(bǔ)骨脂在5.02～50.20 μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度分別為22.62和20.08 μg/ml的對(duì)照品溶液，精密吸取10 μl，注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.8%(n=6)，異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.9%(n=6)，表明儀器精密度良好。取復(fù)方參芪片(批號(hào)20140421)供試品溶液，精密吸取10 μl，注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.8%(n=6)，異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.8%(n=6)，表明該方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方參芪片(批號(hào)20140421)供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h各進(jìn)樣1次，每次10 μl，測(cè)定其峰面積，結(jié)果補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.8%(n=6)，異補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD=0.8%(n=6)，表明復(fù)方參芪片供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素濃度分別為22.62和20.08 μg/ml的對(duì)照品溶液備用，取復(fù)方參芪片(批號(hào)20140421)適量，研細(xì)，精密稱取9份粉末，每份0.100 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別按照供試品中含補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素量的0.8倍、1倍、1.2倍加入對(duì)照品溶液，各平行做3份，并按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，根據(jù)測(cè)得量和加入量，計(jì)算各待測(cè)成分的加樣回收率。結(jié)果補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的平均加樣回收率分別為(99.80±1.8)%和(100.8±2.5)%(n=9)。

2.2.10 含量測(cè)定結(jié)果 分別取3個(gè)批次的復(fù)方參芪片適量，研細(xì)，每批次取粉末3份，每份0.2 g，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，結(jié)果批號(hào)為20140421、20140910、20150317的復(fù)方參芪片中，補(bǔ)骨脂素的含量分別為(1.94±0.025)、(1.45±0.032)、(1.47±0.016) mg/g，異補(bǔ)骨脂素的含量分別為(1.65±0.020)、(1.35±0.022)、(1.38±0.015) mg/g(n=3)。

3 討 論

3.1 薄層鑒別的改進(jìn) 本研究改進(jìn)了原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中補(bǔ)骨脂和丹參的鑒別方法，將補(bǔ)骨脂的鑒別方法改為TLC法，使得方法簡(jiǎn)單易操作，并通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，調(diào)整展開劑的比例，使薄層色譜顯色清晰。在丹參的薄層鑒別中，用二氯甲烷替代三氯甲烷作為展開劑，使得試劑的毒性降低。增加了原標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有的柴胡、黃芪、當(dāng)歸的薄層鑒別項(xiàng)，分別通過(guò)反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)調(diào)整展開劑的組成及比例，使得新增加的鑒別項(xiàng)專屬性強(qiáng)，所用試劑毒性小、配制簡(jiǎn)單，且鑒別方法簡(jiǎn)便易操作。

3.2 HPLC法吸收波長(zhǎng)和流動(dòng)相的選擇 根據(jù)參考文獻(xiàn)[2，7-9]，選擇246 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)嘗試了不同的流動(dòng)相，如甲醇-水(45∶55、50∶50、55∶45、52∶48、47∶53)、乙腈-水(47∶53)，使用這些流動(dòng)相時(shí)，待測(cè)成分與雜質(zhì)峰均有干擾。當(dāng)流動(dòng)相為乙腈-水(34∶66)時(shí)，未有雜質(zhì)峰干擾且出峰時(shí)間較短。

3.3 HPLC法提取溶劑用量的選擇 在供試品溶液的制備中，本研究分別考察了選用10、20、30 ml的甲醇作為提取溶劑量，并對(duì)所得結(jié)果使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果提取溶劑為10 ml 組與20 ml組的數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(P<0.05)，20 ml 組與30 ml組之間不存在顯著性差異(P>0.05)，為保證提取效果且節(jié)約溶劑用量，故選擇20 ml作為提取溶劑的用量。

3.4 HPLC法提取時(shí)間的選擇 在供試品溶液的制備時(shí)，本研究同時(shí)考察了3種不同提取時(shí)間的效果，分別為超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)20、30、40 min，同樣對(duì)3組結(jié)果使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果提取20 min組與提取30 min組的數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異(P<0.05)，提取30 min組與提取40 min組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，為節(jié)約實(shí)驗(yàn)時(shí)間，故選擇30 min作為提取時(shí)間。

本研究確立了復(fù)方參芪片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測(cè)定方法，本方法簡(jiǎn)便、有效、易操作，能夠有效地控制復(fù)方參芪片的質(zhì)量，使本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到完善，并進(jìn)一步保障了臨床的用藥安全性。