陳靜 羅高權(quán) 陳藝

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院眼科（廣州510150）；2中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州510010）

青光眼是一種不可逆的致盲性眼病，其致盲率僅次于白內(nèi)障［1］，目前醫(yī)治青光眼最常用的手術(shù)方案仍是濾過性手術(shù)，但術(shù)后濾過通道的瘢痕化是導(dǎo)致手術(shù)失敗的重要原因。根據(jù)報道青光眼濾過性手術(shù)最常用的小梁切除術(shù)5年內(nèi)手術(shù)失敗率高達30%［2］。目前，抗代謝藥如絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），仍是臨床上最常用的抗術(shù)后濾過通道瘢痕化的藥物。雖然MMC 和5-FU 有一定療效，但它們所導(dǎo)致的角膜和結(jié)膜上皮損害、前房延遲形成、脈絡(luò)膜損傷、濾過泡滲漏、術(shù)后感染等嚴重不良反應(yīng)及并發(fā)癥不容忽視。因此尋找安全有效的抗青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化的新藥，一直是青光眼醫(yī)師的研究熱點。青蒿琥酯（artesunate，Art）是青蒿素的衍生物，隨著對青蒿素及其衍生物研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其除傳統(tǒng)的抗瘧作用外，還具有抗瘢痕等作用［3］。本課題組前期研究證實，Art 能抑制體外培養(yǎng)的人Tenon 囊成纖維細胞（human tenon′s capsule fibroblasts，HTFs）的增生，誘導(dǎo)其凋亡［4］。自噬是一個吞噬自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器并通過溶酶體降解的過程，以實現(xiàn)細胞自身的代謝需要和細胞器的更新，機體的生理和病理過程中都存在自噬。自噬可通過清除受損的細胞器對細胞存活起保護作用，而過度自噬將導(dǎo)致細胞程序性凋亡［5］，因此，自噬所起的作用是正面還是負面尚待研究。研究證實在淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌中，Art可以通過誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬性死亡，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用［6-8］。本研究通過觀察不同濃度Art 處理HTFs，利用分子生物學(xué)手段探討Art 對HTFs 自噬的影響，從而為其在青光眼濾過性手術(shù)中的應(yīng)用提供新的思路和線索。

1 材料與方法

1.1 材料來源 HTFs 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心。Art（中國桂林南藥股份公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclon 公司）；胰蛋白酶、二甲亞砜（美國Sigma 公司）；噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium，MTT）試劑盒（中國南京凱基生物有限公司）；ECL 顯色試劑盒（美國Thermo 公司）；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑（中國北京康為世紀生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（quantitative reverse transcriptase PCR，qRT-PCR）檢測試劑盒（美國ABI 公司）；兔抗人Beclin-1 抗體、β-actin 鼠抗人單克隆抗體、小鼠抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）-Ⅱ抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔及抗鼠IgG 二抗（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；Cyto-ID?Green 自噬檢測試劑盒（美國Enzo Life Sciences 公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美國Invitrogen 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HTFs 細胞，置于5%二氧化碳37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。及時換液，當(dāng)細胞生長至培養(yǎng)基底的80% 時給予0.25%胰酶消化細胞傳代處理。取3 ～6 代細胞用于本實驗。

1.3 MTT 法檢測HTFs 增殖 消化計數(shù)處于對數(shù)生長期的HTFs 細胞，接種于96 孔板，置于5%二氧化碳37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實驗分為空白對照組、Art 實驗組（50，100，150，200 μg/mL）?？瞻讓φ战M和Art 實驗組HTFs 細胞分別加入到含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，Art 實驗組按規(guī)定加入不同濃度（50，100，150，200 μg/mL）Art。再分別設(shè)置（24 和48 h）不同時間組。每組均鋪3 復(fù)孔，置入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時觀察量效和時效關(guān)系。每孔加入5 g/L 的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用酶標儀測定各孔于570 nm 波長下吸光度（A）值，取5 次測量的平均值。計算Art 對HTFs 的抑制率。生長抑制率=（1-處理組A/對照組A）×100%。

1.4 qRT-PCR 法檢測HTFs 中LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表達 分組方法同上。加藥48 h 后，PBS 緩沖液輕輕沖洗，反復(fù)兩至三次，1 mL Trizol 輕輕吹打細胞，收集液體。根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。紫外分光光度儀測量RNA 濃度及純度。按照qRT-PCR 試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：42 ℃，60 min，70 ℃，5 min，4 ℃靜置。β-actin為內(nèi)參對照。引物序列設(shè)計：β-actin 上游引物：CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC；下游引物：TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT。LC3-Ⅱ上游引物：GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG；下游引物：ACTCTCATACACCTCTGAGATTG。Beclin-1 上游引物：TGGATCACCCACTCTGTGAG；下游引物：TTATTGGCCAGAGCATGGAG。進行各組mRNA 的相對表達量的分析。

1.5 Western blot法檢測HTFs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達 空白對照組和Art 實驗組處理方法同上。處理48 h 后，收集各組細胞，置冰上裂解并提取總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。制備質(zhì)量分數(shù)10% SDS 分離膠，取等量的上樣蛋白加入SDS 凝膠中，電泳跑膠，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，待脫脂奶粉液封閉漂洗后，加入相應(yīng)一抗（小鼠抗人LC3-Ⅱ抗體、兔抗人Beclin-1 抗體，β-actin 鼠抗人單克隆抗體），4 ℃孵育過夜，次日漂洗后用山羊抗兔及抗鼠辣根過氧化物抗體37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，ImagJ 軟件測量蛋白條帶灰度值，以β-actin 作為內(nèi)參，進行目的蛋白的相對含量分析。

1.6 Cyto-ID 染色法鑒定HTFs 自噬水平 選用150 μg/mL Art 處理的細胞作為實驗組，空白對照組不加Art。實驗組加入150 μg/mL Art 后，兩組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用緩沖液漂洗2 次，加入適量染色試劑（自噬體染色劑Cyto-ID 與細胞核染色劑DAPI），置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min，棄多余的染料，用緩沖液清洗細胞3 次，在熒光顯微鏡下觀察，Cyto-ID 染色陽性細胞即自噬細胞呈現(xiàn)綠色熒光，綠色熒光為核周圍和細胞質(zhì)的自噬小體及自噬溶酶體。隨機選取200個細胞，計算Cyto-ID染色陽性細胞數(shù)，以Cyto-ID染色陽性細胞數(shù)所占的百分比來表示HTFs的自噬水平，重復(fù)3次，取平均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，計量資料采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Art 對HTFs 增殖的影響 實驗結(jié)果顯示：24 h 和48 h 后，Art 實驗組與空白對照組比較，細胞增殖均受到抑制，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。作用時間相同（24、48 h），隨著Art 濃度增高，抑制率分別由4.7%增至59.1%，由13.3%增至68.6%。 Art 濃度相同（50，100，150，200 μg/mL），隨作用時間增加，抑制率分別由4.7%增至13.3%，由8.7%增至31.4%，由36.2%增至50.0%，由59.1%增至68.6%。見表1。隨著Art 濃度升高、作用時間延長，Art 對細胞抑制作用越明顯，表現(xiàn)為濃度-效應(yīng)及時間-效應(yīng)依賴關(guān)系。

表1 Art 對HTFs 的細胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

表1 Art 對HTFs 的細胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

注：與空白對照組比較，aP ＜0.05，bP ＜0.01

分組空白對照組Art 實驗組（μg/mL）50 100 150 200 24 h A 值0.127±0.002 0.121±0.004a 0.116±0.002b 0.081±0.003b 0.052±0.001b抑制率（%）－4.7±0.4 8.7±0.9 36.2±1.2 59.1±1.3 48 h A 值0.188±0.005 0.163±0.003b 0.129±0.002b 0.094±0.004b 0.059±0.002b抑制率（%）－13.3±0.6 31.4±1.1 50.0±1.0 68.6±1.3

2.2 不同濃度Art 對HTFs LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表達的影響 qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示：50、100、150、200 μg/mL Art 實驗組LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 的相對表達水平較空白對照組均有明顯升高，不同濃度Art 實驗組LC3-ⅡmRNA 的相對表達量分別是空白對照組的（1.367±0.214）、（1.950±0.116）、（3.120±0.521）、（4.765 ± 0.371）倍；Beclin-1 mRNA 的相對表達量分別是空白對照組的（1.235 ± 0.164）、（1.746 ± 0.320）、（2.854 ± 0.244）、（3.487 ± 0.356）倍。各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FL= 20.920，P＜0.01；FB= 26.370，P＜0.01）?？傮w上隨著Art濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相對表達量均明顯提高，呈現(xiàn)濃度依賴的關(guān)系，見圖1。

圖1 qRT-PCR 檢測空白對照組與Art 實驗組HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 的相對表達量Fig.1 LC3-Ⅱand beclin-l mRNA relative expression in control group and Art groups by qRT-PCR

2.3 不同濃度Art 對HTFs LC3-II 和Beclin-1 蛋白表達的影響 Western blot 檢測結(jié)果顯示：50、100、150、200 μg/mL Art 組LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白表達量較空白對照組均有明顯升高，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FL= 32.852，P＜0.01；FB= 29.874，P＜0.01）?？傮w上隨Art 濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白的表達量均明顯提高，呈現(xiàn)濃度依賴的關(guān)系。見圖2 及表2。

表2 Western blot 檢測HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相對表達量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

表2 Western blot 檢測HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相對表達量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

注：與空白對照組比較，aP ＜0.01

分組空白對照組Art 實驗組（μg/mL）50 100 150 200 LC3-II 0.101±0.025 0.186±0.021a 0.302±0.082a 0.462±0.070a 0.808±0.102a Beclin-1 0.098±0.036 0.236±0.049a 0.441±0.101a 0.588±0.090a 0.784±0.064a

圖2 空白對照組與Art 實驗組HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表達Fig.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups

2.4 Art 作用后HTFs 自噬水平的變化 選用150 μg/mL Art 處理的細胞作為實驗組，不加Art 的細胞作為空白對照組。Cyto-ID染色結(jié)果顯示：實驗組HTFs 的核周和細胞質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)的綠色熒光較空白對照組明顯濃聚，見圖3。對照組和150 μg/mL Art 實驗組的Cyto-ID 染色陽性細胞百分比分別為（13.302±2.301）%和（53.274±7.851）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.804，P＜0.01）。

圖3 熒光顯微鏡下觀察HTFs 經(jīng)Art 作用后自噬情況（×200）Fig.3 The autophagy activity of HTFs was evaluated by fluorescence microscope（×200）

3 討論

細胞自噬是真核生物界一種普遍存在的生命現(xiàn)象，它具有重要的生理意義。正常情況下，自噬充當(dāng)了垃圾處理和回收系統(tǒng)的功能，功能失常的自噬，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。研究顯示，自噬參與了多種細胞功能的調(diào)控，并與癌癥、衰老、創(chuàng)傷等多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在抑制心肌、肺、腎臟等器官纖維化及疤痕的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［12-14］。研究證實肺纖維化以成纖維細胞過度增生、膠原蛋白過度沉積為特點，細胞自噬活化可以促進膠原的降解，抑制膠原的大量堆積［12］。KIM 等［14］研究表明誘導(dǎo)自噬能明顯降低Ⅰ型膠原蛋白表達，降低腎纖維化。自噬與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展亦密不可分［15］。有研究發(fā)現(xiàn)心臟成纖維細胞受腎上腺素刺激繼發(fā)細胞自噬，該反應(yīng)可能減少病理條件下高腎上腺素對心臟成纖維細胞造成的有害影響如心肌纖維化［14］。增生性疤痕的發(fā)生可能與自噬不足有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)在增生性疤痕組織自噬表達水平較正常組織明顯降低［16］。有報道提示，自噬是傷口愈合過程中重要的“參與者”，可能參與了病理性瘢痕纖維過度增殖與膠原無序沉積的病理生理過程。成纖維細胞的自噬在傷口愈合過程中起一定的調(diào)節(jié)作用，能夠減少細胞外基質(zhì)中膠原蛋白的沉積，還可以通過調(diào)控細胞產(chǎn)生TGF-β和將“異?！奔毎饣|(zhì)排出細胞，減少瘢痕的產(chǎn)生［17-20］。以上研究為進一步探討自噬與抗青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕化的關(guān)系提供了有益的啟示。前期研究證實，Art 能抑制HTFs 的增生，誘導(dǎo)其凋亡［4］，因此Art 在誘導(dǎo)HTFs 凋亡的同時，很可能對另一種細胞程序性死亡方式（自噬）也產(chǎn)生一定的影響。

LC3 是公認的自噬標志物，與酵母蛋白Atg8具有較高的相似性。LC3 具有2 種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ存在一個生成-降解的動態(tài)過程。LC3 被具有蛋白內(nèi)切酶活性的Atg4 在羧基端剪切，生成胞質(zhì)LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ通過Atg7和Atg3 參與的泛素樣反應(yīng)，與自噬體雙層膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ。在降解過程中，位于外膜的LC3-Ⅱ被半胱氨酸蛋白酶Atg4B 移除后回收，位于內(nèi)膜的LC3-Ⅱ則被溶酶體降解。由于LC3-Ⅱ存在于自噬體膜上，其表達量與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)。所以LC3-Ⅱ的表達量，可以作為一項衡量細胞內(nèi)自噬活性的一個客觀指標［21］。Beclin-1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。Beclin-1 與自噬前體的結(jié)合啟動自噬體的形成。Beclin-1 也是自噬的正調(diào)控因子，其表達水平與自噬體的形成密切相關(guān)［22］。本實驗通過檢測LC3-Ⅱ、Beclin-1 的mRNA 和蛋白的表達來觀察Art 對HTFs 自噬的影響。

本實驗應(yīng)用MTT 法檢測不同濃度Art 作用24及48 h 對HTFs 的增殖抑制率，結(jié)果顯示，Art 濃度越高、作用時間越長，對HTFs 增殖的抑制作用越明顯，呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)和時間-效應(yīng)依賴關(guān)系，其抑制率由4.7%增至68.6%。本研究應(yīng)用qRT-PCR和Western Blot 檢測LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的相對表達。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：Art作用48 h后，隨著Art 濃度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相對表達量較空白對照組明顯提高。Western Blot 檢測結(jié)果顯示：Art 作用48 h 后，隨著Art 濃度的增加，LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白的表達量較空白對照組亦明顯提高。本實驗表明Art 可以增加HTFs LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的表達，并且均具有濃度-效應(yīng)依賴性，證實Art 可誘導(dǎo)HTFs 發(fā)生自噬。

綜上所述，Art 可明顯上調(diào)HTFs 自噬水平，誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬性死亡，抑制HTFs 增殖。關(guān)于自噬的激活和Art 抑制HTFs 的增生效應(yīng)之間的關(guān)系及機制尚有待進一步研究，而在Art 處理后，凋亡與自噬在誘導(dǎo)HTFs 死亡過程中的相互作用方式尚需進一步研究。自噬性細胞死亡是Art 對HTFs增殖抑制的重要機制之一，為研究Art 的作用機制及Art 在臨床上應(yīng)用于抑制抗青光眼術(shù)后濾過通道瘢痕形成提供了新的思路。