鄧淑文 楊艷 夏紅星

南華大學衡陽醫(yī)學院，附屬南華醫(yī)院，1疼痛科，2胃腸外科（湖南衡陽421002）

多西他賽（DTX）是紫杉烷類抗腫瘤藥物中應用較為廣泛的一種化療藥物，對多種實體腫瘤具有治療作用。然而，化療引起的神經(jīng)病理性疼痛（CINP）是DTX 化療引起的常見副作用，且具有可持續(xù)性和劑量限制性［1-2］。如何有效控制神經(jīng)病理性疼痛一直是疼痛醫(yī)學領域的熱點和難點，特別是CINP。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶A（PKA）信號通路是由G 蛋白偶聯(lián)受體介導的細胞內(nèi)經(jīng)典信號通路之一，廣泛參與細胞分化、增殖、凋亡、基因轉錄等眾多生物學過程的調(diào)控［3-4］。賀端端等［5］研究表明，cAMP/PKA 信號通路在骨癌痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓組織中異常活化，在骨癌痛的產(chǎn)生和維持中起著重要作用。ZHANG 等［6］研究報道抑制大腦伏隔核中cAMP/PKA 信號通路的活化對坐骨神經(jīng)損傷致單神經(jīng)病變引發(fā)的神經(jīng)病理學疼痛具有鎮(zhèn)痛效果。cAMP/PKA 信號通路在外周痛覺過敏的形成及神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)過程扮演重要作用，然而cAMP/PKA 信號通路是否參與CINP尚未明確。為此本研究擬建立DTX化療誘導的神經(jīng)病理性疼痛模型大鼠，探討cAMP/PKA 信號通路抑制或激活對模型大鼠痛覺變化的影響，以明確該信號通路在CINP 發(fā)生發(fā)展中的作用，為治療化療痛尋找潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，鼠齡6周齡，體質量200 ～220 g，由湖南嘉泰實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（湘）2019-0003。大鼠飼養(yǎng)于12/12 h 明暗交替的環(huán)境中，其中溫度為22 ～24 ℃、相對濕度為45%～60%，且自由飲水攝食。

1.2 主要試劑及儀器 多西他賽注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；PKA 抑制劑H-89 和PKA激動劑SP-CAMP 購自美國MedChemExpress 公司；大鼠cAMP ELISA 試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α測試盒均購自南京建成生物工程研究所；膠質纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、蛋白激酶A（PKA）C 亞基（PKAc）抗體、環(huán)磷酸腺苷效應元件結合蛋白（CREB）抗體、磷酸化CREB（p-CREB）（Ser133）抗體、GAPDH 抗體購自美國CST 公司；Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG（H+L）和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；辣酸根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG 購自武漢博士德生物工程有限公司；VonFrey 電子測痛儀（BIO-EVF3）購自法國Bioseb 公司；熱板測痛儀（PL-200）購自四川科儀誠科技有限公司；酶標儀（ELx8000）購自美國Bio-Tek公司；熒光顯微鏡（Ti2）購自日本尼康株式社。

1.3 模型構建及分組 采用隨機數(shù)字表法將60只SD 大鼠分成正常對照組、模型組、PKA 抑制劑H-89 組（H-89 組）和PKA 激動劑SP-CAMP 組（SPCAMP組），每組15只。除正常對照組外，其他各組大鼠均于每日上午9：00 時通過尾靜脈注射10 mg/kg多西他賽注射液，每天1 次，連續(xù)10 d，構建化療所致神經(jīng)病理疼痛大鼠模型［7］。大鼠第1 次給予多西他賽注射液注射當天視為第1 天，H-89 組和SPCAMP 組大鼠于第1 天下午3：00 時分別鞘內(nèi)注射PKA 抑制劑H-89（10 μmol/5μL）和PKA 激動劑SPCAMP（40 nmol/5μL），正常對照組和模型組給予等量生理鹽水注射，每日1 次，連續(xù)10 d。

1.4 行為學測試 將所有大鼠提前置于測試籠連續(xù)適應3 d，每次2 h。于第11 天分別使用電子Von Frey 測痛儀和熱板測痛儀測定大鼠機械縮足反射閾值（MWT）和熱縮足反射潛伏期（TWL）。測試過程中出現(xiàn)抬足反射時視為陽性反應，并記錄出現(xiàn)抬足反射時測痛儀顯示的示數(shù)。左右足各測3 次，每次間隔5 min，最后取6 次測定的平均值，分別作為最終的MWT 值和TWL 值。行為學測試結束后處死大鼠，分別取大鼠L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)和脊髓組織用于后續(xù)實驗檢測。

1.5 ELISA 檢測 取大鼠背根神經(jīng)節(jié)或脊髓部分組織，制備成組織勻漿，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，用酶標儀測定450 nm 波長處吸光值（A450 值），再根據(jù)標準曲線計算背根神經(jīng)節(jié)中cAMP含量以及脊髓組織中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.6 免疫熒光實驗 取大鼠脊髓組織，放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h，再置于30%蔗糖溶液中脫水48 h。將背根神經(jīng)節(jié)組織制作成冰凍切片，切片厚度8 μm。取出冰凍切片，滴加1.2%H2O2室溫避光作用10 min，1×PBS 洗滌3 次，0.3% Triton X-100 處理30 min，1×PBS 洗滌3 次，滴加2% BSA 室溫封閉1 h，1×PBS 洗滌3 次，滴加GFAP 抗體（1∶300），4℃孵育過夜，1×PBS 洗滌3 次，滴加Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔IgG（H+L）避光孵育1 h，1×PBS 洗滌3 次，滴加防淬滅劑，中性樹脂封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。每張切片隨機取5 個視野，采用Image J 軟件測量GFAP 平均熒光強度。

1.7 Western blot 實驗 取大鼠背根神經(jīng)節(jié)部分組織，按照每50 mg 組織加入0.5 mL RIPA 裂解液，冰上勻漿，超聲破碎。4 ℃條件下15 000×g 離心30 min，取上清液即為所抽提的蛋白溶液，采用BCA 法測定蛋白濃度。取等量蛋白置于沸水浴變性后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離目的蛋白，并轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST 洗滌3 次，分別加入PKAc、CREB、p-CREB、GAPDH 等抗體，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加入HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，滴加ECL 超敏發(fā)光液，顯影，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經(jīng)病理性疼痛變化 見表1，與正常對照組比較，模型組大鼠MWT 和TWL 值均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，H-89 組大鼠MWT和TWL 值均顯著增加（P＜0.05），而SP-CAMP 組大鼠MWT和TWL值均顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠機械痛覺和熱痛覺閾值比較Tab.1 Comparison of mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group ±s

表1 各組大鼠機械痛覺和熱痛覺閾值比較Tab.1 Comparison of mechanical pain threshold and thermal pain threshold of rats in each group ±s

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對照組模型組H-89 組SP-CAMP 組MWT（g）18.69±1.37 8.87±1.09*14.36±2.07#4.25±0.86#TWL（s）13.06±1.07 7.44±2.11*11.85±1.68#5.07±1.19#

2.2 各組大鼠脊髓中星形膠質細胞活化情況 4組大鼠脊髓組織中均存在星形膠質細胞活化標志物GFAP蛋白的表達。與正常對照組比較，模型組大鼠脊髓組織中GFAP平均熒光強度顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，H-89 組大鼠脊髓組織中GFAP 平均熒光強度顯著降低（P＜0.05），而SP-CAMP組大鼠脊髓組織中GFAP平均熒光強度顯著增加（P＜0.05）。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測脊髓組織中GFAP 蛋白表達（100×）Fig.1 Expression of GFAP in spinal cond detected by immunofluorescence（100×）

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α水平 見表2，與正常對照組比較，模型組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，H-89組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.05），而SP-CAMP 組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of IL-1β、IL-6 and TNF-α Level in spinal cord tissue of rats in each group ±s，pg/mg

表2 各組大鼠脊髓組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of IL-1β、IL-6 and TNF-α Level in spinal cord tissue of rats in each group ±s，pg/mg

注：與正常對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05

組別正常對照組模型組H-89 組SP-CAMP 組IL-1β 47.24±7.53 176.58±14.22*82.22±8.02#236.66±21.06#IL-6 13.07±3.38 67.15±7.57*31.27±5.68#90.47±10.44#TNF-α 87.69±8.65 207.95±18.36*140.25±11.02#281.21±37.35#

2.4 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織中cAMP/PKA 信號通路蛋白表達情況 見圖2，與正常對照組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，H-89 組和SP-CAMP 組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP 含量無顯著性變化（P＞0.05）。如圖3 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc 和p-CREB 蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，H-89 組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc 和p-CREB 蛋白表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），而SP-CAMP 組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc和p-CREB蛋白表達水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；4 組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中CREB 蛋白表達水平相互比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 ELISA 檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP 含量Fig.2 Detection of camp in rat dorsal root ganglion by ELISA

圖3 Western blot 檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc、CREB、p-CREB 蛋白表達水平Fig.3 PKAc，CREB and p-CREB expression levels were detected by Western blot

3 討論

根據(jù)最新調(diào)查研究［8］顯示，2018年中國癌癥發(fā)病率及死亡率均已位列全球第一，分別占全球新增癌癥病例的21.02%和新增癌癥死亡病例的23.92%。隨著癌癥發(fā)病率的逐年上升，化療藥物的使用也日益廣泛，然而CINP 問題一直困擾著患者和醫(yī)務人員。有研究［9-10］顯示，近四成化療患者會出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛，主要表現(xiàn)為四肢遠端麻木、燒灼痛或刺痛，具有濃度依賴性。CINP 不僅增加了癌癥患者的痛苦，還極大限制了化療藥物的使用，并且其具體病理機制目前還不清楚。本研究結果顯示，cAMP/PKA 信號通路在多西他賽誘導的CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中異?；罨种圃撏返幕罨娠@著提高CINP 大鼠機械痛閾值和熱痛閾值，并抑制脊髓星形膠質細胞的活化以及炎癥因子的釋放，若激活該信號通路則表現(xiàn)出完全相反的作用，提示cAMP/PKA 信號通路可能在多西他賽誘導的CINP 過程中發(fā)揮重要作用。

cAMP/PKA 信號通路的活化過程由胞外信號通過與細胞膜上G 蛋白偶聯(lián)受體結合，將胞外信號傳遞至細胞內(nèi)，并上調(diào)胞內(nèi)第二信使cAMP 水平，從而激活PKA，導致PKA 催化亞基（PKAc）的解離并進入細胞核，使下游靶蛋白CREB 的Ser133位點發(fā)生磷酸化修飾，激活相關靶基因的轉錄［11］。眾多研究［12-13］顯示，cAMP/PKA 信號通路參與多種病理狀態(tài)下外周痛覺過敏的形成與維持以及神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)。本研究結果顯示，CINP 大鼠L4-L6 背根神經(jīng)節(jié)中cAMP 含量以及PKAc 蛋白和p-CREB 水平顯著升高，說明CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP/PKA 信號通路異?；罨?。為了進一步探討cAMP/PKA 信號通路異常活化是否參與CINP過程，本研究采用PKA 抑制劑H-89 和激動劑SPCAMP 對該信號通路進行干預。結果顯示，H-89干預可顯著抑制CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc 蛋白的表達并降低p-CREB 水平，而SP-CAMP 干預可顯著上調(diào)CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中PKAc 蛋白的表達及p-CREB 水平，證實H-89 和SP-CAMP 對cAMP/PKA 信號通路發(fā)揮了阻斷或激活作用。此外，由于H-89 和SP-CAMP 的干預靶點是PKA，因此其對cAMP 水平無影響，本研究結果也證實H-89 和SPCAMP 干預對CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP 含量無顯著影響。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，H-89 干預可顯著提高CINP 大鼠機械痛閾值和熱痛閾值，而SPCAMP 干預后CINP 大鼠機械痛閾值和熱痛閾值進一步降低。ZHU 等［14］研究也證實，cAMP/PKA 信號通路在骨癌疼大鼠背根神經(jīng)節(jié)中異?；罨捎肞KA 抑制劑Rp-cAMPS 可顯著延遲或逆轉骨癌誘導的熱痛覺過敏和機械性痛覺過敏，說明cAMP/PKA信號通路的激活可能參與CINP的維持。

星形膠質細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量較多、分布較廣的神經(jīng)膠質細胞，其常響應神經(jīng)損傷刺激而活化，在周圍神經(jīng)損傷引起的慢性神經(jīng)病理性疼痛中起關鍵作用［15］。脊髓星形膠質細胞活化可釋放活性介質，包括炎性介質IL-1β、IL-6 和TNF-α，再通過旁分泌途徑增強脊髓傷害性突觸傳遞的興奮性及疼痛信號傳導，參與調(diào)控疼痛的發(fā)生，與痛覺過敏的產(chǎn)生和維持密切相關［16］。李立等［17］研究顯示，在脊髓神經(jīng)損傷致神經(jīng)病理性疼痛模型誘導過程中，脊髓星形膠質細胞持續(xù)活化。多項研究［18-19］顯示，抑制脊髓星形膠質細胞活化可減輕疼痛感。本研究結果顯示，CINP 大鼠脊髓中星形膠質細胞活化標志物GFAP 蛋白表達增加，說明在CINP 中脊髓星形膠質細胞也處于較高水平的活化狀態(tài)。同時，CINP 大鼠脊髓組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α水平也顯著提高，表明星形膠質細胞活化介導的炎癥因子釋放參與CINP 過程。有研究［15］顯示，cAMP/PKA 信號通路的激活可促進星形膠質細胞的活化。為此，推測cAMP/PKA 信號通路參與調(diào)控的CINP 可能與脊髓星形膠質細胞活化有關。本研究結果進一步顯示，H-89 干預可顯著抑制CINP 大鼠脊髓中GFAP 蛋白的表達并降低脊髓中IL-1β、IL-6 和TNF-α水平，而SP-CAMP干預后CINP 大鼠脊髓中GFAP 蛋白的表達及IL-1β、IL-6 和TNF-α水平顯著增加，說明CINP 大鼠背根神經(jīng)節(jié)中cAMP/PKA 信號通路的活化促進了脊髓星形膠質細胞的活化，并釋放炎癥因子，進而介導神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所述，cAMP/PKA 信號通路在CINP 模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中被激活，該通路的激活進一步介導脊髓星形膠質細胞的活化并釋放炎癥因子，進而介導CINP的發(fā)生發(fā)展。因此，靶向抑制cAMP/PKA 信號通路或許為臨床解決CINP 提供理論依據(jù)。