彭契六，韋尚謀，張磊 ，甘麗英，謝珍，陳巧佩，韋邦寧，張智

0 引言

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其惡性程度和病死率極高[1]。目前，手術(shù)切除仍然是肝癌患者獲得長(zhǎng)期生存最有效的方法，但大部分肝癌患者就診時(shí)已屬中晚期，且多伴有嚴(yán)重的肝硬化，最終能夠接受手術(shù)治療的肝癌患者不到15%[2]。因此，探索肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找治療肝癌的新靶點(diǎn)具有重要臨床意義。

微小RNA（micro ribonucleic acid,miRNA）是真核生物中一類長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或直接降解目標(biāo)mRNA，在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平對(duì)下游靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[3]，從而參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝和胚胎發(fā)育等重要生命過(guò)程[4]。miRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已經(jīng)引起廣泛關(guān)注[5]。miR-152是一種重要的miRNA，已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[6-8]，但其在肝癌組織中的表達(dá)和功能至今鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在檢測(cè)肝癌組織中miR-152的表達(dá)水平，分析miR-152異常表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2019年6月在廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院肝膽外科和南寧市第一人民醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的肝癌患者共56例，切除后收集肝癌組織和癌旁組織（距離切緣至少3 cm），組織標(biāo)本置于液氮中，轉(zhuǎn)于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。全部病例均?jīng)病理確診為肝細(xì)胞肝癌。所有入選的患者均為原發(fā)病灶的首次手術(shù)切除，術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或者激素治療。其中男37例，女19例；年齡32～71歲，中位年齡46歲；臨床病理按TNM分期（美國(guó)腫瘤聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）2018）：Ⅰ期10例、Ⅱ期7例、Ⅲ期37例、Ⅳ期2例；乙肝表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性為乙型肝炎病毒陽(yáng)性；乙型肝炎病毒DNA（HBV-DNA）＞103拷貝/毫升為HBV-DNAb陽(yáng)性；血管侵犯是指微血管侵犯（MVI）。本研究經(jīng)本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。本研究所使用的TRIzol RNA提取試劑盒（貨號(hào)：9108-1）、Prime-Script miRNA cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：D350A）、SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒（貨號(hào)：RR420L）均購(gòu)自日本TaKaRa公司，病理切片機(jī)（RM2245型）購(gòu)自德國(guó)Leica公司，熒光定量PCR儀（ABI 7500型）購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 組織總RNA提取

取200 mg組織剪成小塊，置于研缽內(nèi)，加入液氮研磨成粉末。研磨好的粉末加入1 ml RNAiso并立即混勻，然后加入200 ml三氯甲烷，充分混勻后4℃ 12 000g離心15 min。取上清液350 μl，加500 μl異丙醇，混勻后靜置10 min，4℃ 12 000g離心15 min，再加入750 μl無(wú)水乙醇，渦旋混勻后4℃12 000g離心10 min。棄上清液，靜置風(fēng)干。加入30 μl的DEPC水溶解RNA沉淀，采用Nanodrop檢測(cè)RNA純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)組織miR-152的表達(dá)

采用U6 snRNA作為內(nèi)參。根據(jù)GenBank中miR-152基因序列號(hào)（MIMAT0000438），用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送北京博奧生物有限公司合成。U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；miR-152上游引物：5'-ACGGTACCGTAAGGGACTCGGGAAGGAG-3'，下游引物：5'-TCAAGCTTGCCTCCTTCTTCCAGCTGAT-3'。熒光定量PCR反應(yīng)總體積25 μl：SYBR Green MIX 12.5 μl、ddH2O 9.5 μl，上下游引物各0.5μl，cDNA模板2.0 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-152的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 miR-152表達(dá)水平與肝癌患者病理參數(shù)的相關(guān)分析

根據(jù)miR-152在肝癌組織中相對(duì)表達(dá)水平的中位數(shù)（0.561），將56例肝癌患者分為miR-152高表達(dá)組和低表達(dá)組，并將每例患者肝癌組織miR-152的表達(dá)水平與癌旁組織進(jìn)行比較，采用χ2檢驗(yàn)分析肝癌患者的臨床病理參數(shù)如年齡、性別、AFP水平、腫瘤大小、病理分化、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式等與其miR-152的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，并通過(guò)隨訪的方式分析患者癌組織中miR-152的表達(dá)水平及其預(yù)后的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。患者臨床病理參數(shù)分析采用χ2檢驗(yàn)，患者生存率分析采用Kaplan-Meier曲線，組間的生存率和復(fù)發(fā)率的比較采用Log rank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用單因素Cox回歸對(duì)所有臨床病理指標(biāo)進(jìn)行分析，再取P＜0.05的因素進(jìn)行多因素回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-152在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌（0.616±0.041）與癌旁組織（0.768±0.042）中miR-152的相對(duì)表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.595,P=0.011），表明miR-152在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平顯著下降，見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌和癌旁組織中miR-152相對(duì)表達(dá)水平Figure 1 Relative miR-152 expressions in cancerous tissues and non-cancerous tissues

2.2 miR-152在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

結(jié)果顯示，miR-152低表達(dá)組中，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者人數(shù)明顯多于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.042）、低分化患者人數(shù)明顯多于中高分化組（P=0.035）、有轉(zhuǎn)移患者人數(shù)明顯多于無(wú)轉(zhuǎn)移（P=0.048），有血管侵犯患者人數(shù)明顯多于無(wú)血管侵犯（P=0.042）。而與患者的性別（P=0.397）、年齡（P=0.752）、AFP水平（P=0.365）、腫瘤數(shù)量（P=0.584）、腫瘤直徑（P=0.397）、手術(shù)方式（P=0.274）和乙型肝炎病毒攜帶狀態(tài)（P=0.554）等無(wú)顯著相關(guān)，見(jiàn)表1。提示肝癌組織中miR-152的相對(duì)表達(dá)水平與肝癌患者腫瘤TNM分期、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移及血管侵犯相關(guān)。

表1 miR-152表達(dá)水平與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relation between miR-52 expression and clinicopathologic features of HCC patients

2.3 Kaplan-Meier生存分析

通過(guò)分析56例肝癌患者術(shù)后生存資料，結(jié)果顯示miR-152低表達(dá)組中位生存時(shí)間為18.5月，miR-152高表達(dá)組中位生存時(shí)間為36.0月，miR-152低表達(dá)組生存時(shí)間低于miR-152高表達(dá)組（P=0.035）；miR-152低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展中位生存時(shí)間為13.0月，miR-152高表達(dá)組無(wú)進(jìn)展中位生存時(shí)間為25.0月，miR-152低表達(dá)組無(wú)進(jìn)展中位生存時(shí)間低于miR-152高表達(dá)組（P=0.012），見(jiàn)圖2。

圖2 miR-152表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系Figure 2 Relation between miR-52 expression and prognosis of HCC patients

2.4 Cox回歸分析

單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示：AFP水平、TNM分期、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、血管侵犯及miR-152低表達(dá)均是影響肝癌患者總體生存的風(fēng)險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示：miR-152表達(dá)、腫瘤復(fù)發(fā)、病理分化可以作為預(yù)測(cè)HCC患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表2 單因素分析miR-152表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系Table 2 Univariate analysis of relation between miR-152 expression and prognosis of HCC patients

表3 多因素分析miR-152表達(dá)與HCC患者預(yù)后的關(guān)系Table 3 Multivariate analysis of relation between miR-152 expression and prognosis of HCC patients

3 討論

miRNA已被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且能夠作為惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物，以及腫瘤靶向治療的靶點(diǎn)[9]。miR-152是miRNA中miR-148/miR-152家族的成員，位于17號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)32帶[10]。有研究表明，miR-152在結(jié)直腸癌、宮頸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[11-13]。汪毅等[14]對(duì)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中miR-152的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-152在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平低于相應(yīng)癌旁組織，且miR-152表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，miR-152表達(dá)越低的結(jié)直腸癌患者預(yù)后越差，miR-152可以作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物；張紅森等[15]研究也發(fā)現(xiàn)miR-152在膀胱癌組織中的表達(dá)水平低于相應(yīng)癌旁組織，miR-152可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERBB3/AKT2信號(hào)通路發(fā)揮抑制膀胱癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的功能。

在肝細(xì)胞癌中，miR-152表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系亦有少量報(bào)道。Wang等[16]利用RT-PCR檢測(cè)肝癌患者和對(duì)照組血清miR-152表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-152表達(dá)水平在肝癌患者血清中明顯下調(diào)，血清miR-152水平可以作為肝癌的診斷標(biāo)志物。Dang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-152主要通過(guò)靶向TNFRSF6B調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡在肝癌中發(fā)揮抑癌功能。Yin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，miR-152主要通過(guò)靶向CDK8發(fā)揮抑制腫瘤的作用，miR-152可能是治療肝癌的潛在靶標(biāo)。但miR-152表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系如何未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，miR-152在肝癌組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織，提示miR-152在肝癌中表達(dá)下調(diào)，在生物體內(nèi)可能發(fā)揮抑癌基因的功能。本研究對(duì)miR-152高表達(dá)組和miR-152低表達(dá)組與患者相關(guān)臨床病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，miR-152表達(dá)與患者的性別、年齡、AFP水平、腫瘤數(shù)量、腫瘤直徑、手術(shù)方式和乙型肝炎病毒攜帶狀態(tài)無(wú)顯著相關(guān)，而與患者的腫瘤TNM分期、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移及血管侵犯明顯相關(guān)，miR-152低表達(dá)組肝癌TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、病理分化低分化、有腫瘤轉(zhuǎn)移及有血管侵犯人數(shù)明顯高于miR-152高表達(dá)組，提示miR-152表達(dá)水平與肝癌的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。為進(jìn)一步探討miR-152在肝癌患者預(yù)后判斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值，我們采用Kaplan-Meier生存曲線法分析肝癌患者的預(yù)后與miR-152表達(dá)水平之間關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-152低表達(dá)組的生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間均顯著低于miR-152高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-152表達(dá)水平越低的肝癌患者，生存周期越短，存活率越低。多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，肝癌組織miR-152低表達(dá)是肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以上結(jié)果表明，miR-152在肝癌中異常表達(dá)，且參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展，miR-152的表達(dá)水平還與肝癌患者的腫瘤進(jìn)展嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-152在肝癌組織中低表達(dá)，且其異常表達(dá)與肝癌患者TNM分期、病理分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管侵犯及預(yù)后相關(guān)，miR-152在肝癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起抑制作用，但miR-152在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化及其潛在的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明。