楊廷芳，王麗，張勇

0 引言

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，死亡率達(dá)8.3%，位于全球癌癥死因第三位[1]。從1990年到2017，肝癌在我國前25位死因中排第五位[2]。手術(shù)、放化療及靶向治療是主要治療手段，但其死亡率和復(fù)發(fā)率仍然很高[3]。肝癌的發(fā)生涉及基因異常表達(dá)并且存在腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性[4-6]，從基因水平探討肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及其與預(yù)后的相關(guān)性，有利于發(fā)現(xiàn)新的分子診斷和治療靶點(diǎn)。

FOXO1（叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1），也稱FKHR，在細(xì)胞增殖和癌癥生物學(xué)中起著重要作用[7]。FOXO1基因異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]，如過表達(dá)與橫紋肌肉瘤[9]、乳腺癌[10]及卵巢癌[11]等有關(guān)，低表達(dá)與結(jié)腸癌[12]和前列腺癌[13]有關(guān)。目前多數(shù)研究是關(guān)于FOXO1與肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的機(jī)制和預(yù)后關(guān)系的小樣本研究，而關(guān)于FOXO1與肝膽管癌（hepatocholangiocarcinoma,HCC-CC）及肝纖維板層癌（fibrolamellar carcinoma,FL-Ca）的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及預(yù)后關(guān)系的研究未見報(bào)道。因此，本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)合HPA數(shù)據(jù)庫從大樣本層面分析FOXO1在三種主要病理類型的肝癌中的轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料獲取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲得407例肝癌和58例癌旁組織的mRNA表達(dá)水平及患者臨床信息。肝癌患者相關(guān)臨床信息包括年齡、性別、生存時(shí)間、死亡狀態(tài)、病理組織類型、腫瘤分級及TNM分期。

1.2 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)差異

采用非參秩檢驗(yàn)（Wilcox Test）和R軟件（4.0.2版）Beeswarm包分析從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的FOXO1 mRNA在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 臨床相關(guān)性分析

采用R包ggpubr分析FOXO1基因與肝癌的臨床病理特征的相關(guān)性。

1.4 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1表達(dá)與肝癌患者預(yù)后關(guān)系

根據(jù)病理組織類型，從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取到3類肝癌，分別為HCC、FL-Ca及HCC-CC。按FOXO1 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將所有肝癌病例分為高、低表達(dá)組，R包survival和survminer利用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析。首先，分析FOXO1基因表達(dá)與所有肝癌病例預(yù)后的關(guān)系，得到截尾數(shù)據(jù)為OS的Kaplan-Meier生存曲線。進(jìn)一步按病理組織類型進(jìn)行3個(gè)亞組（HCC、FL-Ca和HCCCC）的生存分析，Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行不同組間生存率的比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 與生存相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后分析

分別采用單因素和多因素Cox分析，評估FOXO1基因、患者年齡、腫瘤組織學(xué)類型、性別、腫瘤分級和TNM分期與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果以森林圖顯示。

1.6 FOXO1與肝癌腫瘤微環(huán)境中腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（tumor-infiltrating immune cells,TIICs）的關(guān)系

通過CIBERSORT分析工具（https://cibersort.stanford.edu/）分析TIICs在肝癌FOXO1高表達(dá)組和低表達(dá)組的表達(dá)差異，以小提琴圖顯示，并分析TIICs與FOXO1表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.7 KEGG信號通路富集分析

下載C2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt數(shù)據(jù)，利用GSEA軟件（4.1.0版）對FOXO1基因在肝癌中的潛在功能進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，尋找顯著富集在FOXO1高表達(dá)組和低表達(dá)組的相關(guān)通路。設(shè)置過濾條件為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率＜0.25且P＜0.05。

1.8 FOXO1在人類不同正常組織及不同腫瘤組織中的蛋白表達(dá)差異

從HPA數(shù)據(jù)庫（www.proteinatlas.org）分別 獲取FOXO1基因在人類不同正常組織和不同癌組織中的表達(dá)差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

肝癌和癌旁組織之間FOXO1基因表達(dá)差異采用非參秩檢驗(yàn)（Wilcox Test）。FOXO1基因表達(dá)與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier曲線表示，組間生存率比較采用Log rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中FOXO1在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異及臨床相關(guān)性分析

TCGA 數(shù)據(jù)庫中，與癌旁組織相比較，F(xiàn)OXO1在肝癌組織中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.321E-15）。

FOXO1表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤分級和TNM分期等臨床特征無明顯相關(guān)性，見圖1。

圖1 FOXO1在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)差異(A)及與臨床病理特征(B～I(xiàn))的關(guān)系Figure 1 Difference of FOXO1 expression between tumor and adjacent tissues(A) and its correlation with clinical features(B-I)

2.2 FOXO1與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

與FOXO1低表達(dá)組相比，高表達(dá)組肝癌患者的總生存時(shí)間顯著延長（P=0.014）。進(jìn)一步亞組分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1表達(dá)水平對肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后有顯著影響（P=0.019），而在肝纖維板層癌（P=0.713）及肝膽管癌（P=0.811）中，其表達(dá)水平對預(yù)后無顯著影響，見圖2A～D。

2.3 與生存相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后分析

單因素Cox分析顯示臨床分期、T、M分期可作為預(yù)后分析指標(biāo)，見圖2E；多因素Cox分析顯示FOXO1不能作為肝癌獨(dú)立預(yù)后影響因子，見圖2F。

圖2 FOXO1與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系及肝癌預(yù)后因子Figure 2 Correlation between FOXO1 and survival of liver cancer patients and prognostic factors of liver cancer

2.4 FOXO1與肝癌TME中TIICs的關(guān)系

與肝癌FOXO1低表達(dá)組相比，在肝癌FOXO1高表達(dá)組中：幼稚B細(xì)胞（P=0.005）密度增加，巨噬細(xì)胞M2密度降低（P=0.026），見圖3A。肝癌TME中有4種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞與FOXO1表達(dá)水平有關(guān)：幼稚B細(xì)胞（P＜0.001）和靜息CD4記憶性T細(xì)胞（P=0.030）與其正相關(guān)；巨噬細(xì)胞M2型（P=0.018）和活化的CD4記憶性T細(xì)胞（P=0.028）與其負(fù)相關(guān)，見圖3B～E。

圖3 肝癌FOXO1高和低表達(dá)組腫瘤浸潤免疫表達(dá)差異(A)及其與FOXO1表達(dá)的相關(guān)性(B-E)Figure 3 Distribution of TIICs in liver cancer patients with high and low FOXO1 expression(A) and relation between TIICs and FOXO1 expression(B-E)

2.5 KEGG信號通路富集分析

分析了18條最顯著富集在FOXO1高表達(dá)組及8條最顯著富集在FOXO1低表達(dá)組的KEGG信號通路，見表1；發(fā)現(xiàn)10條腫瘤相關(guān)信號通路，見圖4，數(shù)條與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期及內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的KEGG信號通路顯著富集在FOXO1高表達(dá)組。

圖4 10條腫瘤相關(guān)KEGG通路富集圖Figure 4 Enrichment plots of 10 tumor-related KEGG pathways

表1 FOXO1高表達(dá)和低表達(dá)組相關(guān)KEGG信號通路Table 1 KEGG pathways enriched in high and low FOXO1 expression groups

2.6 FOXO1在人類不同正常組織及腫瘤組織中的蛋白表達(dá)差異

從HPA數(shù)據(jù)庫獲取FOXO1基因在人體不同的正常組織和不同腫瘤組織中的蛋白水平表達(dá)差異，見圖5。FOXO1蛋白在肝臟等多數(shù)組織中低表達(dá)，在約60%的肝癌患者中可檢測到其表達(dá)。

圖5 FOXO1在人體正常組織及腫瘤組織中的蛋白表達(dá)水平Figure 5 Protein expression of FOXO1 in normal and cancer tissues

3 討論

肝癌近十多年來呈現(xiàn)出年輕化趨勢[14]，手術(shù)和系統(tǒng)性化療仍是目前主要的治療手段。盡管作為里程碑式的靶向治療藥物索拉菲尼極大地改善了晚期肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后，但是僅約25%的腫瘤含有驅(qū)動(dòng)基因[15]，高死亡率和復(fù)發(fā)率是亟待解決的問題[3]。肝癌基因異常表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性提示，尋找相關(guān)的重要基因不僅利于肝癌的早期診斷和預(yù)后判斷，而且有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，加深對其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識。

FOXO1編碼的蛋白質(zhì)是重要的細(xì)胞增殖[16]和細(xì)胞死亡的調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移、代謝和癌癥生物學(xué)中也起著重要作用[7]，且促進(jìn)肝細(xì)胞糖異生[17]，尤其是在長期進(jìn)食或饑餓及氧化應(yīng)激時(shí)靶向胰島素信號通路以維持內(nèi)環(huán)境平衡。研究[8]表明FOXO1表達(dá)上調(diào)抑制HCC進(jìn)展；其表達(dá)下調(diào)促進(jìn)HCC發(fā)生和進(jìn)展，導(dǎo)致不良預(yù)后。此外，Chi等[18]發(fā)現(xiàn)FOXO1介導(dǎo)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)導(dǎo)致HCC化療耐藥及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Calvisi等[19]發(fā)現(xiàn)FOXO1泛素化可促進(jìn)HCC進(jìn)展，且FOXO1表達(dá)高的HCC患者預(yù)后更好。Jiang等[20]發(fā)現(xiàn)抑癌基因PTEN（phosphate and tensin homology）促進(jìn)FOXO1核轉(zhuǎn)位，PTEN-蛋白酶體軸是治療PTEN缺陷型膽管癌的潛在靶點(diǎn)。Frampton等[21]發(fā)現(xiàn)原顆粒蛋白PGRN在膽管癌中過表達(dá)，導(dǎo)致FOXO1在膽管細(xì)胞內(nèi)積聚，刺激小鼠膽管癌細(xì)胞增殖。肝癌具有高度異質(zhì)性及不同的病理組織類型，發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜。

我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘FOXO1基因在肝癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)FOXO1在肝癌組織中低表達(dá)。按FOXO1 mRNA表達(dá)水平將肝癌病例分為高、低表達(dá)組后，生存分析顯示：高表達(dá)FOXO1的肝癌患者總生存率高于低表達(dá)者。按肝癌病理組織類型進(jìn)行亞組分析顯示，高表達(dá)FOXO1的HCC患者預(yù)后更好，與已有研究結(jié)果一致[8,19]。FOXO1的表達(dá)與肝纖維板層癌及肝膽管癌預(yù)后無關(guān)。多因素Cox分析顯示FOXO1不能作為獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。我們采用HPA數(shù)據(jù)庫評估FOXO1基因在人體不同正常組織及不同腫瘤組織中的蛋白表達(dá)差異，60%的肝癌患者中（包括肝細(xì)胞肝癌、肝纖維板層癌及肝膽管癌）可檢測到FOXO1蛋白低到中等程度表達(dá)。

FOXO1蛋白對調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌至關(guān)重要[22]。隨著免疫治療的應(yīng)用，一系列研究正在揭示FOXO1在腫瘤微環(huán)境中的功能。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌TME中，巨噬細(xì)胞M2浸潤的FOXO1依賴性機(jī)制，即FOXO1上調(diào)并通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控趨化因子配體20和集落刺激因子-1，促進(jìn)TME中巨噬細(xì)胞M0向巨噬細(xì)胞M2極化并募集巨噬細(xì)胞M2，導(dǎo)致ESCC患者預(yù)后較差；且發(fā)現(xiàn)FOXO1（+）腫瘤誘導(dǎo)的M2巨噬細(xì)胞通過FAK-PI3K-AKT途徑促進(jìn)腫瘤增殖，PI3K抑制劑能有效地抑制腫瘤的進(jìn)展。Zheng等[23]對肝癌患者的腫瘤、癌旁及外周血進(jìn)行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞與肝癌免疫有關(guān)。Zhang等[24]證實(shí)腫瘤微環(huán)境中高密度腫瘤浸潤幼稚B細(xì)胞肝癌患者預(yù)后更好，且幼稚B細(xì)胞可作為其獨(dú)立預(yù)后因子。有研究表明腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及其分級是黑色素瘤患者生存期和前哨淋巴結(jié)狀態(tài)的獨(dú)立預(yù)測因子，且腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞密度高的患者預(yù)后更好[25]。為探索FOXO1相關(guān)的肝癌病理進(jìn)展機(jī)制，本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫從免疫細(xì)胞與肝癌微環(huán)境的關(guān)系，利用CIBERSORT進(jìn)行22種TIICs在肝癌TME的表達(dá)差異分析及TIICs與FOXO1表達(dá)水平相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)幼稚B細(xì)胞在肝癌FOXO1高表達(dá)組中浸潤密度增加，且其與FOXO1表達(dá)水平成正相關(guān)關(guān)系；巨噬細(xì)胞M2在肝癌FOXO1高表達(dá)組中浸潤密度降低，且其與FOXO1表達(dá)水平成負(fù)相關(guān)關(guān)系。結(jié)合本研究的生存分析結(jié)果：在預(yù)后更好的FOXO1高表達(dá)組中，F(xiàn)OXO1表達(dá)水平越高，幼稚B細(xì)胞浸潤密度越大而巨噬細(xì)胞M2浸潤密度越低，分別與Zhang[24]及Wang[22]等研究結(jié)果一致。因此，我們推測高表達(dá)FOXO1的肝癌患者預(yù)后更好的可能原因：一方面FOXO1促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中幼稚B細(xì)胞浸潤調(diào)節(jié)免疫；另一方面FOXO1抑制巨噬細(xì)胞M2浸潤從而抑制血管生成和腫瘤侵襲。此外，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤微環(huán)境中，靜息CD4記憶性T細(xì)胞也與FOXO1表達(dá)水平成正相關(guān)關(guān)系；活化的CD4記憶性T細(xì)胞與其呈負(fù)相關(guān)。在肝癌高和低FOXO1表達(dá)組中，具有免疫調(diào)控作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞無表達(dá)差異，且與FOXO1表達(dá)水平無相關(guān)性。Rohr-Udilova等[26]發(fā)現(xiàn)與正常肝組織比較，肝細(xì)胞肝癌中幼稚B細(xì)胞及靜息CD4記憶性T細(xì)胞增加，但并未進(jìn)一步研究其與預(yù)后的關(guān)系。靜息CD4 T細(xì)胞是HIV-1感染的重要早期靶標(biāo)，Trinité等[27]推測HIV-1抑制FOXO1活性可能促進(jìn)靜息CD4 T細(xì)胞復(fù)制。該研究證實(shí)靜息CD4 T細(xì)胞與FOXO1相關(guān)。Cafri等[28]的研究表明在上皮源性癌癥患者外周血中可檢測到靶向KRASG12D突變的CD4記憶性T細(xì)胞。上述研究雖未明確揭示CD4 T細(xì)胞在腫瘤發(fā)展機(jī)制中的作用，但提示CD4 T細(xì)胞確實(shí)跟FOXO1活性有關(guān)，CD4記憶性T細(xì)胞存在于腫瘤微環(huán)境中。為了進(jìn)一步探索FOXO1與肝癌微環(huán)境的關(guān)系，本研究分析了18條最顯著富集在FOXO1高表達(dá)組及8條最顯著富集在FOXO1低表達(dá)組的KEGG信號通路，發(fā)現(xiàn)10條腫瘤相關(guān)通路，但未發(fā)現(xiàn)重要的免疫相關(guān)通路。

綜上所述，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫，挖掘肝癌組織中FOXO1mRNA表達(dá)水平的信息，發(fā)現(xiàn)FOXO1基因在肝癌中低表達(dá)，且與肝癌總體生存期有關(guān)。FOXO1高表達(dá)的肝癌患者較低表達(dá)者總體生存期延長，進(jìn)一步就肝癌組織病理類型進(jìn)行亞組分析發(fā)現(xiàn)，與FOXO1基因低表達(dá)組相比，F(xiàn)OXO1高表達(dá)的肝細(xì)胞肝癌的總生存期延長。本研究為深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。本研究存在一定的缺陷和局限性在于單純地利用TCGA數(shù)據(jù)庫，未來需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明FOXO1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。