李冰晶，羅麗平，趙景芳，王代波，劉國華，文光琴

(1貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009；2貴州省植物園，貴州 貴陽 550009)

藍莓(Vacciniumuliginosum)，又稱越桔或藍漿果，屬杜鵑花科越桔屬落葉灌木植物，藍莓中含有非常豐富的營養(yǎng)成分，被譽為“漿果之王”[1]，果實中含有豐富的維生素、膳食纖維、蛋白質和礦物質等營養(yǎng)元素，其中藍莓中花青素含量較高。藍莓果實中含有的活性物質具有抗衰老、緩解視疲勞、改善記憶力、抗氧化、抗癌癥等功效[2]。

藍莓中含有多種活性物質，花青素為其中含量較高的一種[3]。為了更好地研究藍莓粗提物中成分，利用高效液相色譜(HPLC)對藍莓提取物進行分析[4-10]，通過單因素分析法，考察流動相組成、流速、柱溫、進樣量和時間梯度等對藍莓粗提物分離的影響，從而確定出HPLC測定藍莓粗提物的最佳條件。

1 實驗材料

1.1 實驗原料與試劑

藍莓，由麻江羊蓋藍莓基地提供；乙醇(食品級)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；乙酸(分析純)；蒸餾水；AB-8型大孔樹脂，購于上海藍季。

1.2 實驗儀器

Agilent1260高效液相色譜；BUCHI R114旋轉蒸發(fā)儀；DZF-6021真空干燥箱；722S型可見光分光光度計；GTR16-2型離心機；DKS-28型電熱恒溫水浴鍋；電子天平A2004；PHSJ-4A型PH計；DW-4OL262型醫(yī)用低溫保存箱；BCD-206SM型海爾冰箱。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

將新鮮藍莓稱重置于燒瓶中，加入75 %的乙醇密封避光浸泡15 d。過濾，濃縮提取液，用大孔樹脂對濃縮液進行初步分離，得到水洗脫的蒸餾水流份和乙醇洗脫的藍莓提取物流份，濃縮藍莓提取物流份，得到藍莓粗提物。

2.2 HPLC色譜條件考察

影響高效液相色譜分離藍莓粗提物的條件有柱選擇、流動相、流速、柱溫、時間梯度和進樣量等，本試驗通過單因素分析法考察流動相、流速、柱溫、進樣量和梯度洗脫條件五個方面，從中選擇出最佳的測試條件進行藍莓粗提物液相色譜測定[11-17]。

2.3 波長及流動相篩選

以藍莓粗提物作為考察對象，通過全波長掃描，得出目標產物在529 nm處有最大吸收，因此以529 nm波長最為主要波長。

常用的HPLC流動相有：水、磷酸水、甲醇、乙醇、乙腈等，以Agilent C18柱為色譜柱，分別以水-甲醇、乙酸-甲醇、磷酸水-甲醇、水-乙腈、磷酸水-乙腈、乙腈-乙酸為流動相，進行梯度洗脫，考察色譜峰的分離效果，選出最佳流動相。

2.4 流速篩選

高效液相色譜流速的改變會影響圖譜的出峰時間和峰形，本試驗通過比較在0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三個流速下藍莓花青素的分離情況，比較各組流速的HPLC圖譜，根據圖譜選擇出能分離藍莓花青素的HPLC流速。

2.5 柱溫篩選

溫度會影響溶劑的密度、粘度等物理性質，所以高效液相色譜柱溫的改變會對譜圖中峰的分離效果、峰形及出峰時間產生影響。本試驗通過對20 ℃、25 ℃、30 ℃三個柱溫下藍莓粗提物的HPLC圖譜進行比較，根據圖譜篩選出能最好分離藍莓粗提物的HPLC柱溫。

2.6 進樣量篩選

高效液相色譜的進樣量不同，會對樣品的峰形和峰面積產生較大影響，本試驗通過對5 μL、10 μL、20 μL 三個體積進行考察，對HPLC圖譜進行比較，篩選出能最好分離藍莓粗提物的HPLC進樣量。

2.7 梯度洗脫條件篩選

高效液相色譜的梯度洗脫條件不同，會影響其樣品出峰時間和分離程度，本試驗對洗脫時間和梯度的調整，對HPLC圖譜進行比較，根據圖譜篩選出能最好分離藍莓粗提物的HPLC梯度洗脫條件。

3 實驗結果

3.1 流動相考察結果

通過對水-甲醇、水-乙腈、0.3%磷酸-甲醇、0.3%磷酸-乙腈、0.5%乙酸-甲醇、0.5%乙酸-乙腈這6種流動相的考察，得出分離效果最好的圖譜，見圖1。通過分析比較圖譜，當以0.3%磷酸-乙腈作為流動相時分離效果明顯優(yōu)于其他流動相條件下的分離效果。因此最終確定了乙腈(A)-0.3%磷酸(B)為花青素HPLC實驗流動相。

圖1 流動相為乙腈(A)-0.3%磷酸(B)液相圖譜Fig.1 Chromatogram with mobile phase of acetonitrile(A)and0.3% phosphoric acid (B)

3.2 流速考察結果

通過對0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.5 mL/min三個流速的比較，得出圖2-圖4，從圖中可以看出，流速對花青素的峰分離效果和保留時間沒有太大影響，但是流速過快，會導致基線不穩(wěn)，流速過慢，會拉長分離時間，加大能耗。綜合考慮，選擇1 mL/min作為花青素HPLC實驗流速。

圖2 流速0.8 mL/min液相圖譜Fig.2 Chromatogram with flow rate of 0.8 mL/min

圖3 流速1 mL/min液相圖譜Fig.3 Chromatogram with flow rate of 1 mL/min

圖4 流速1.5 mL/min液相圖譜Fig.4 Chromatogram with flow rate of 1.5 mL/min

3.3 柱溫篩選結果

經對20 ℃、25 ℃、30 ℃3個柱溫進行考察，得出圖5-圖7。從圖中可看出，隨著柱溫的升高，峰的分離效果和保留時間基本沒有變化，但是峰形逐漸變得更完整，因此選擇30 ℃為花青素HPLC法測定的柱溫。

圖5 柱溫20℃液相圖譜Fig.5 Chromatogram with column temperature of 20 ℃

圖6 柱溫25℃液相圖譜Fig.6 Chromatogram with column temperature of 25℃

圖7 柱溫30℃液相圖譜Fig.7 Chromatogram with column temperature of 30℃

3.4 進樣量篩選結果

根據藍莓粗提物的濃度，本試驗對5 μL、10 μL、20 μL 3個進樣量進行考察，如圖8-圖10所示： 5 μL時響應值較低，約為10 mAU；而20 μL時響應值較高，約為180 mAU；應選擇峰值在100 mAU較為合適，故選擇10 μL作為進樣量。

圖8 進樣量5 μL液相圖譜Fig.8 Chromatogram with injection volume of 5 μL

圖9 進樣量10 μL液相圖譜Fig.9 Chromatogram with injection volume of 10 μL

圖10 進樣量20 μL液相圖譜Fig.10 Chromatogram with injection volume of 20 μL

3.5 梯度洗脫條件篩選結果

先選擇0～100 min，A：0%～30%，B：100%～70%，觀察出峰情況和保留時間。從圖11可知前10 min出峰為溶劑峰，10～50 min出峰多且密集，后40 min基本不出峰。將時間調整為0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%，觀察出峰情況和保留時間，從圖12可知，40～70 min出峰多且密集。將時間調整為0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，觀察出峰情況和保留時間，從圖13可知，出峰基本分開，峰形較好。綜上所述，選擇時間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%為花青素HPLC梯度洗脫條件。

圖11 洗脫梯度為0-100 min，A：0%-30%，B：100%-70%液相圖譜Fig.11 Chromatogram with gradient elution program of0-100 min，A：0 %-30 %，B：100 %-70 %

圖12 洗脫梯度為0-50-70 min，A：5%-15%-30%，B：95%-85%-70%液相圖譜Fig.12 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70 min，A：5 %-15 %-30 %，B：95 %-85 %-70 %

圖13 洗脫梯度為0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%液相圖譜Fig.13 Chromatogram with gradient elution program of0-50-70-100 min，A：8 %-10 %-15 %-30 %，B：92 %-90 %-85 %-70 %

4 結論與分析

本試驗考察了在用HPLC的測定藍莓粗提物時影響其分離和保留時間的5個因素(流動相、流速、柱溫、進樣量和梯度洗脫條件)，通過單因素分析法，逐一控制影響因素，根據所得圖譜逐一分析出用HPLC的測定藍莓粗提物最佳測試條件。由于所探究的目標產物在529 nm處有最大吸收，因此以529 nm波長最為主要波長。在流動相選擇時，當流動相為：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)藍莓粗提物分離最好。流速和柱溫對圖譜的出峰和保留時間影響都較小，但是流速越快，會導致基線不穩(wěn)，而流速越慢，溫度越高峰形越趨于完美。但也不宜速度過慢和柱溫過高，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃時，效果最好。進樣量對峰面積影響較大，應選擇峰值在100 mAU較為合適，所以選擇10 μL作為進樣量。根據時間和濃度確定梯度洗脫條件，經過調整時間和濃度，最終確定梯度洗脫條件為時間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%時，藍莓粗提物的分離效果最好。

綜上所述，在色譜條件篩選中所確定的各項最佳條件的基礎上對色譜條件進一步優(yōu)化，確定了最終實驗的色譜條件為：當流動相為：乙腈(A)-0.3%磷酸溶液(B)；波長為529 nm；流速1 mL/min；柱溫 30 ℃；進樣量10 μL；梯度洗脫條件為：時間：0-50-70-100 min，A：8%-10%-15%-30%，B：92%-90%-85%-70%，此條件下藍莓粗提物的HPLC圖譜分離效果較好。