方毅,宋光捷*,陳黎,馮建青

(1.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院,湖北 襄陽 441000;2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九九一醫(yī)院,骨科,湖北 襄陽 441003;3.中國人民解放軍96608部隊(duì)醫(yī)院,內(nèi)一科,陜西 漢中 723100)

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)是老年癡呆癥中最為常見的類型,可發(fā)生于老年期和老年前期,病理表現(xiàn)為腦內(nèi)淀粉樣蛋白斑沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失,這種神經(jīng)和血管損傷會(huì)引起記憶功能受損和認(rèn)知障礙,嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量[1-2]。隨著世界各國人口結(jié)構(gòu)進(jìn)入老齡化階段,AD患者的發(fā)病率也逐漸升高[3]。目前,關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制尚未闡明,可能是生活習(xí)慣、激素水平、腦血管疾病、炎癥反應(yīng)、遺傳等多種因素相互作用的結(jié)果[4]。現(xiàn)有針對AD的治療藥物僅能緩解初期病癥,還無法達(dá)到令人滿意的治療效果[5]。中藥是我國傳統(tǒng)藥物,具有多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)、多途徑的特點(diǎn),在AD的治療方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢,也是藥物研究的重要來源[5]。丹參酮IIA(Tanshinone IIA,Tan IIA)是經(jīng)典中藥材丹參中的主要活性成分,已被證實(shí)可改善AD小鼠癥狀[6],但Tan IIA的藥理活性豐富多樣,在AD小鼠模型中是否還有其他的作用途徑仍不清楚。本研究為明確Tan IIA在AD中的神經(jīng)保護(hù)作用,以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)AD小鼠模型,觀察Tan IIA對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能損傷的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只6周齡雄性清潔級(jí)ICR小鼠,18~22 g,購自中科院上海動(dòng)物中心【SCXK(滬)2019-0050】,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展于湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房【SYXK(鄂)2017-0005】,各項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合醫(yī)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)倫理審查批號(hào)(20180601247)。動(dòng)物房飼養(yǎng)條件為:溫度20~24℃,相對濕度40%~60%,自然光線,每12 h晝夜交替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),自由攝食飲水。

1.1.2 主要試劑與儀器

Tan IIA、LPS(美國Sigma);ELISA試劑盒、ECL發(fā)光劑(武漢博士德生物工程有限公司);蛋白一抗(美國Abcam);蛋白二抗(美國Abbkine);Morris水迷宮、Y迷宮、自主活動(dòng)能力測試小室(上海軟隆科技發(fā)展有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、建模與給藥

60只ICR小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、Tan IIA低、中及高劑量組,各12只。模型組、Tan IIA處理組建立AD小鼠模型,麻醉,根據(jù)腦立體定位圖譜確定側(cè)腦室進(jìn)針位置[7]:兩眼連線中點(diǎn)偏右1 mm與后眼角連線后2 mm處,消毒后針頭垂直于顱骨進(jìn)針2 mm注射0.5 g/L LPS溶液,空白組小鼠以生理鹽水替代。LPS注射后次日,Tan IIA處理組分別給予1、5、10 mg/kg Tan IIA腹腔注射,每天1次,連續(xù)給藥7周,空白組、模型組以等量生理鹽水替代。

1.2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為學(xué)習(xí)階段和測試階段,學(xué)習(xí)期訓(xùn)練頻率為每天2次,連續(xù)訓(xùn)練4 d,將小鼠面朝水池壁從3個(gè)入水點(diǎn)放入水池,通過攝像儀記錄小鼠第3次從平臺(tái)對位象限(第三象限)入水到站立于隱匿平臺(tái)的所需時(shí)間,記為潛伏期。第5天開始測試,撤去平臺(tái),從第三象限同一入水位置放入小鼠,檢測90 s內(nèi)穿過原平臺(tái)象限的時(shí)間。

(2)Y迷宮實(shí)驗(yàn),將Y迷宮的3個(gè)支臂分別標(biāo)記為A、B、C,隨機(jī)將小鼠放入1個(gè)臂的末端,使其自由探索,記錄8 min內(nèi)小鼠進(jìn)臂的總次數(shù)(除尾部外的全部身體進(jìn)入即為進(jìn)臂)、進(jìn)臂的順序,其中連續(xù)進(jìn)入3個(gè)不同臂為1次正確交替反應(yīng),計(jì)算自發(fā)交替反應(yīng)率[正確交替反應(yīng)次數(shù)/(進(jìn)臂的總次數(shù)-2)×100%]。

(3)自主活動(dòng)能力測試,將小鼠放入測試小室,通過光電傳感器記錄5 min內(nèi)小鼠的水平運(yùn)動(dòng)總距離。

1.2.3 腦組織病理染色

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)完成后,處死小鼠,快速分離腦組織,制成石蠟切片,進(jìn)行常規(guī)HE染色,光鏡下觀察小鼠腦組織海馬區(qū)形態(tài)變化。

1.2.4 ELISA檢測

取腦組織制備10%勻漿液,12 000 r/min離心10 min取上清液,參照ELISA試劑盒說明書操作,檢測腦組織勻漿上清液中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、膽堿系統(tǒng)(Ach、AchE)和白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。

1.2.5 免疫組化檢測

取腦組織石蠟切片,脫水、脫蠟、復(fù)水處理后,置于通透液中18 min,抗原修復(fù)后滴加過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,室溫下靜置10 min,再滴加正常山羊血清,室溫下封閉30 min,先滴加一抗(1∶200),4℃下孵育過夜,再加入信號(hào)增強(qiáng)劑,室溫下反應(yīng)1 h,然后進(jìn)行二抗孵育,室溫下孵育1 h,最后加入DAB試劑進(jìn)行顯色,封片后光鏡下觀察腦組織中IBA-1和GFAP的表達(dá)。

1.2.6 Western Blot檢測

取適量腦組織提取蛋白,經(jīng)SDS-PAGE凝膠分離蛋白,再采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h后,分別孵育蛋白一抗、二抗,在添加ECL發(fā)光劑顯色。以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算核因子κB(NF-κB)、p-NF-κB、Toll樣受體4(TLR4)、PI3K、p-PI3K、AKT及p-AKT的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對AD小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響

各組小鼠在水迷宮的逃避潛伏期時(shí)間均隨著訓(xùn)練的增加而縮短;與空白組比較,模型組小鼠逃避潛伏期增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Tan IIA處理組逃避潛伏期減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以高劑量組變化最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 Tan IIA對AD小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的影響(s)Table 1 Effects of Tan IIA on escaping latency of Morris water maze test in AD mice(s)

2.2 對AD小鼠自由交替反應(yīng)率和自主活動(dòng)能力的影響

與空白組比較,模型組小鼠自由交替反應(yīng)率降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Tan IIA中、高劑量組自由交替反應(yīng)率升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以高劑量組變化最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但各組小鼠自主活動(dòng)距離比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 Tan IIA對AD小鼠自由交替反應(yīng)率和自主活動(dòng)能力的影響Table 2 Effects of Tan IIA on response rate of free alternation and autonomous activity ability in AD mice

2.3 對AD小鼠腦組織海馬區(qū)病理損傷的影響

如圖1,空白組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常完整、排列緊密、胞核深染且形狀規(guī)則;模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂、胞核與胞質(zhì)界限模糊、神經(jīng)元細(xì)胞縮小、且伴有大量的神經(jīng)元細(xì)胞變性與壞死;Tan IIA中、高劑量組神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)介于空白組和模型組之間,且隨著給藥濃度的增加,細(xì)胞狀態(tài)越接近空白組。

圖1 Tan IIA對AD小鼠腦組織海馬區(qū)病理損傷的影響Figure 1 Effects of Tan IIA on hippocampal pathological damage of brain tissues in AD mice

2.4 對AD小鼠腦組織勻漿液中相關(guān)因子的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦組織勻漿液中BDNF、Ach水平降低,AchE、IL-6、TNF-α水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Tan IIA中、高劑量組BDNF、Ach水平升高,AchE、IL-6、TNF-α水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以高劑量組變化最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 Tan IIA對AD小鼠腦組織勻漿液中相關(guān)因子的影響Table 3 Effects of Tan IIA on the related factors in brain tissue homogenate of AD mice

2.5 對AD小鼠腦組織中IBA-1和GFAP表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦組織中IBA-1和GFAP表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Tan IIA中、高劑量組IBA-1和GFAP表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以高劑量組變化最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表4,圖2)。

圖2 Tan IIA對AD小鼠腦組織中IBA-1和GFAP表達(dá)的影響Figure 2 Effects of Tan IIA on the expression of IBA-1 and GFAP in brain tissue of AD mice

表4 Tan IIA對AD小鼠腦組織中IBA-1和GFAP表達(dá)的影響Table 4 Effects of Tan IIA on the expression of IBA-1 and GFAP in brain tissue of AD mice

2.6 對AD小鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較,模型組小鼠腦組織勻漿液中p-NF-κB/NF-κB、TLR4水 平 升 高,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,Tan IIA中、高劑量組p-NF-κB/NF-κB、TLR4水平降低,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),以高劑量組變化最為顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表5,圖3)。

圖3 Tan IIA對AD小鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note.A.Blank group.B.Model group.C ~ E.Low-dose,medium-dose and high-dose Tan IIA groups.Figure 3 Effects of Tan IIA on the expression ofrelated proteins in brain tissues of AD mice

表5 Tan IIA對AD小鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effects of Tan IIA on the expression of related proteins in brain tissues of AD mice

3 討論

理想的AD動(dòng)物模型應(yīng)具備以下特征[8]:(1)表現(xiàn)出認(rèn)知和記憶功能障礙;(2)具備AD主要的神經(jīng)病理學(xué)表現(xiàn)。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分,可刺激多種炎性因子IL-6、TNF-α等的合成和分泌,誘導(dǎo)級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)。據(jù)報(bào)道,向腦室注射或慢性輸入LPS均可誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能損傷,建立神經(jīng)炎性AD模型[9]。本研究通過將LPS注入小鼠側(cè)腦室構(gòu)建AD小鼠動(dòng)物模型,行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,模型小鼠出現(xiàn)明顯的空間學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙和記憶障礙,但并未影響小鼠自發(fā)活動(dòng)能力,同時(shí)HE染色顯示,模型小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯改變,排列雜亂,且伴有神經(jīng)元丟失,這一定程度上模擬了AD神經(jīng)炎癥發(fā)病的特點(diǎn)。

現(xiàn)代藥理研究表明,Tan IIA可介導(dǎo)多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、神經(jīng)元保護(hù)等作用,廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病、腫瘤、更年期綜合征等多種疾病的治療[10]。本研究結(jié)果顯示,Tan IIA處理后可改善LPS引起的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常,減輕神經(jīng)元損傷,這與文獻(xiàn)報(bào)道Tan IIA的神經(jīng)元保護(hù)作用相符[11]。同時(shí),Tan IIA各濃度處理組小鼠逃避潛伏期減少,自由交替反應(yīng)率升高,這種行為學(xué)變化提示Tan IIA可減輕LPS誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶能力損傷。IL-6、TNF-α是強(qiáng)效的促炎細(xì)胞因子,在AD患者腦中高表達(dá),誘發(fā)神經(jīng)元過度炎癥反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡,加劇小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化[12]。ELISA和免疫組化實(shí)驗(yàn)表明,Tan IIA處理組小鼠與模型組比,腦組織中IL-6、TNF-α、IBA-1及GFAP表達(dá)明顯降低,提示Tan IIA在AD小鼠中具有抗炎作用,減少小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子,具有多種轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)作用,當(dāng)受到LPS刺激時(shí),TLR4可特異性識(shí)別LPS,將細(xì)胞外信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi),激活NF-κB的核轉(zhuǎn)移,進(jìn)一步上調(diào)下游TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá),參與炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示,Tan IIA明顯抑制AD小鼠腦組織中NF-κB的磷酸化和TLR4的表達(dá),提示Tan IIA可能通過抑制TLR4-NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。Li等[14]研究指出,Tan IIA可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。PI3K/AKT信號(hào)通路也是機(jī)體重要的信號(hào)通路,研究表明,PI3K/AKT信號(hào)通路可參與神經(jīng)元細(xì)胞的分化、生長、增殖及修復(fù)等過程,與AD有密切聯(lián)系[15]。Zhang等[16]研究還顯示,隱丹參酮可通過PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在神經(jīng)病理性疼痛大鼠中發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果表明,AD小鼠腦組織PI3K/AKT磷酸化水平降低,給予不同劑量Tan IIA處理后,可上調(diào)PI3K/AKT磷酸化水平,提示Tan IIA對AD小鼠神經(jīng)保護(hù)作用,可能與上調(diào)PI3K/AKT通路有關(guān)。

綜上所述,Tan IIA可保護(hù)AD小鼠神經(jīng)受損,提高學(xué)習(xí)記憶能力,可能與激活PI3K/AKT通路、降低腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度激活有關(guān)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了Tan IIA輔助治療AD的可能,為Tan IIA的臨床應(yīng)用提供分子理論基礎(chǔ)。