朱瑞敏,李寶亮,路亞嵐,詹相文,劉益豪,韓云林,秦川,高苒*

(1.中國醫(yī)學科科學院醫(yī)學實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,國家人類疾病動物模型資源庫 國家衛(wèi)生健康委員會

人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室 北京市人類重大疾病實驗動物模型工程技術研究中心,北京 100021;2.首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院,北京 100015)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一,最新研究表明其發(fā)病率和死亡率分別為第三和第二[1]。我國肝癌的發(fā)病率和死亡率約占全球的46.6%和47.1%[2]。該病患者發(fā)病隱匿,早期癥狀不明顯,確診時一般為中晚期,需接受放療和化療在內(nèi)的綜合治療方案。肝癌與其他腫瘤相似,化療以經(jīng)驗性用藥為主。由于腫瘤患者的異質(zhì)性,個體差異較大,相同的病理診斷適用藥物不盡相同,對部分患者可能出現(xiàn)耐藥性延誤治療的最佳時機[3]。因此,為患者選擇個體化的治療方案是目前亟需解決的重要問題。

人源腫瘤異種移植(patient-derived xenografts,PDX)模型是通過手術或穿刺樣本植入免疫缺陷小鼠建立的個體化腫瘤模型[4]。該模型能夠高度維持原發(fā)瘤的組織病理學、遺傳異質(zhì)性和生長特征,在腫瘤藥物篩選以及實現(xiàn)個體化治療方面具有極大優(yōu)勢[5-7]。根據(jù)PDX模型的移植部位主要包括皮下移植和原位移植[8]。皮下接種是目前最常用的植入方式,具有操作簡單、便于觀察等多種優(yōu)勢,但皮下不能提供腫瘤生長的適宜微環(huán)境,因此成瘤率相對較低,培養(yǎng)時間長[9];原位模型與原發(fā)性腫瘤生長環(huán)境相似,能夠模擬生長、浸潤和轉移在內(nèi)的多種生物學行為,充分體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性,再者肝是一個造血器官之一,血供營養(yǎng)豐富,是理想的腫瘤移植模型[10]。目前國內(nèi)還未報道HCC的原位PDX模型,原位與皮下PDX模型的方法學比較更是一個空白。因此,本研究旨在探索一種HCC的原位PDX模型的構建方法,并將原位移植模型與皮下模型進行比較。

本文從北京地壇醫(yī)院收集新鮮的肝癌腫瘤組織,選擇NCG免疫缺陷小鼠構建肝癌患者的原位和皮下PDX模型并進行鑒定,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

21只5~6周齡SPF級雄性NCG小鼠,體重18~22 g,用于構建肝癌PDX模型,購自江蘇集萃藥康科技有限公司【SCXK(蘇)2018-0008】;NCG小鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所屏障環(huán)境動物房【SYXK(京)2019-0014】,環(huán)境溫度24~26℃,光照12 h,黑暗12 h,小鼠均自由飲水取食,所有動物實驗均獲得了中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所倫理委員會的批準(GR18001)。

1.1.2 實驗患者標本

本實驗所涉及的16例肝細胞癌標本均收集自首都醫(yī)科大學附屬地壇醫(yī)院,腫瘤患者標本取材使用均通過了倫理審查委員會的批準(京地倫科字[2019]第(071)-02號)。

1.1.3 主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自以色列Biological Industries公司,PBS緩沖液購自美國Gibco公司,戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司,青霉素購自AMRESCO公司,10%中性多聚甲醛購自北京索萊寶生物科技有限公司,75%乙醇溶液購自山東安捷高科消毒科技有限公司;縫合線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司,1 mL注射器購自中國雙鴿集團聚民生物科技有限公司,腰椎穿刺針購自揚州市江州醫(yī)療器械有限公司,備皮刀購自吉康醫(yī)療器械有限公司,壓敏膠帶購自北京陽光益康科技發(fā)展有限責任公司,眼科鑷購自上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術器械廠,眼用剪購自上海三友外科器材有限公司,持針器購自上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術器械廠;生物安全柜購自美國Thermofisher-Scientific公司,核磁掃描儀購自美國Agilent公司,呼吸麻醉機購自美國Matrx公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌PDX模型原位接種方法

臨床肝癌患者手術切除組織標本離體后立即放入含20%FBS的4℃RPMI-1640培養(yǎng)基中,24 h內(nèi)轉移至生物安全柜內(nèi)操作。取適量組織切成小塊作為接種組織,并從剩余組織中,取適量放入10%中性甲醛溶液中固定,其余組織凍存?zhèn)溆?接種編號見表1)。每個標本接種一只NCG小鼠,具體操作如下:NCG小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液,麻醉劑量為60 mg/kg,腹部備皮,碘伏消毒,沿腹中線稍偏右,開5~10 mm豎切口,用高溫滅菌后的棉簽,輕輕擠壓肝部,使其肝部曝露出體外,RPMI-1640培養(yǎng)基浸洗組織,去除結締組織和壞死組織,并將組織剪碎成小塊備用;選取合適的腫瘤組織1~2塊,吸入穿刺針;將穿刺針直接穿入肝小葉中,緩慢推出腫瘤組織塊,用棉簽輕微按住針口,緩慢拔出,完成接種。使用可吸收線縫合切口處1~2針,并在切口處滴一滴青霉素防止傷口感染,用經(jīng)高壓滅菌的紗布包裹手術部位,小鼠保溫,小鼠側放于新?lián)Q的籠具中,放入籠內(nèi)。術后3 d內(nèi)每天觀察小鼠精神狀態(tài)及進食、飲水及活動情況,之后每周觀察記錄。

1.2.2 肝癌PDX模型皮下接種方法

接收新鮮組織,放入含20%FBS的4℃RPMI-1640培養(yǎng)基中,24 h內(nèi)轉移至生物安全柜內(nèi)操作。于PBS緩沖液中將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊,去除結締組織和壞死組織(中間渣樣物),選取合適的腫瘤組織1~2塊,吸入穿刺針。每個標本(接種編號見表1)接種1只NCG小鼠皮下組織(前肢腋下和后肢內(nèi)側),具體操作如下:1%戊巴比妥溶液腹腔注射受體小鼠,誘導并維持麻醉,小鼠取仰臥位,腹部皮膚備皮并消毒,眼科剪于腹正中橫向剪開皮膚約2 mm,形成進針小口。將穿刺針從切口處進入皮下,輕緩到達皮下上肢腋下,迅速推出組織塊,用鑷子輕摁穿刺針下部,旋轉拔出,完成接種;使用可吸收線縫合切口處1~2針,并在切口處滴一滴青霉素防止傷口感染,用經(jīng)高壓滅菌的紗布包裹手術部位,小鼠側放于新?lián)Q的籠具中。術后3 d內(nèi)每天觀察小鼠精神狀態(tài)及進食、飲水及活動情況,之后每周觀察記錄。

表1 肝癌PDX模型患者信息Table 1 Clinical characteristics of orthotopic PDX models for hepatocellular carcinoma

1.2.3 核磁共振掃描肝癌原位腫瘤

接種原位肝細胞癌PDX模型小鼠在進入掃描室前除去體內(nèi)或體表所有的金屬和鐵磁性物品(例如金屬耳號,芯片等),然后對小鼠通過異氟烷氣體(2%的異氟烷和O2混合氣體)麻醉,然后將小鼠放進連通氣體麻醉劑的線圈內(nèi)固定。先將動物床置于掃描架,并固定好,傳至掃描位置。動物擺放俯臥姿,使頭正中矢狀面與身體長軸平行,身體中軸線與床板中軸重合,動物門牙勾住固定裝置。通過調(diào)節(jié)掃描架位置,將掃描部位放置于磁場中心位置。T2WI對小鼠進行橫斷面和矢狀面掃描,TR為2000~3000 ms,TE為48~84 ms,矩陣:256×256,ETL為8。在整個掃描過程中,小動物的呼吸、心電和溫度等生理狀態(tài)需持續(xù)監(jiān)測。小動物麻醉后體溫會降低,為防止體溫過低動物死亡,MRI腔體內(nèi)需連接電熱水浴墊或使用熱風持續(xù)加溫等方法維持動物體溫。

1.2.4 腫瘤生長曲線測定

皮下移植的腫瘤,每7 d測量1次腫瘤的長徑(L)與短徑(W),計算腫瘤體積,腫瘤體積計算公式為V=1/2×(L×W2),繪制腫瘤生長曲線,當腫瘤長徑達到1 cm時傳代或凍存。

1.2.5 腫瘤組織病理學檢查

MRI檢查后的原位肝癌模型和腫瘤長徑達到1 cm的皮下肝癌模型小鼠,通過頸椎脫臼法處安樂死,剝離肝上腫瘤組織,拍照記錄。然后取適量腫瘤組織于10%的中性甲醛溶液中固定至少24 h,通過梯度乙醇脫水和二甲苯透明后,浸蠟包埋,待組織塊變硬后切片(4μm),貼于玻片上烘干;染色前使用二甲苯脫蠟,再經(jīng)梯度乙醇最后至蒸餾水中即可染色;染色時先在蘇木精中染色2 min,酸水和氨水中分色后,入酒精伊紅染色2 min,然后脫水封片。經(jīng)過HE染色的組織切片,在光鏡下觀察并掃描染色結果。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及圖片制作,結果以平均值±標準誤(±sˉx)表示,兩組間的數(shù)據(jù)采用Student’s t檢驗和卡方檢驗(超過20%的方格n<5時,采用Fisher exact test)計算,P<0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 成功構建肝癌PDX原位和皮下模型

構建肝癌原位PDX模型,模式圖如圖1A。術中出血少,無需止血,視野清楚。術后6 h內(nèi),精神欠佳活動減少,能順利進食;12 h后,精神狀態(tài)正常,能正?；顒优c進食,小鼠術后均成活。構建的肝癌皮下PDX模型,術中基本無出血狀況,無需止血。小鼠術后均成活。術后4 h內(nèi),精神欠佳活動略少,能順利進食,12 h后,精神狀態(tài)正常,能正?；顒优c進食。在肝癌PDX原位與皮下模型構建過程中小鼠狀態(tài)良好,毛色光順、進食進水正常、糞便和尿量均無異常反應。

本次實驗中有5例標本同時構建了肝原位和皮下的PDX模型,其中原位模型的LC30和LC31患者原位PDX模型分別在第43天和第23天在腹部肝部位觸摸到小軟包,似腫瘤生長,持續(xù)觀察記錄。LC30和LC31分別于73、42 d時通過核磁成像檢測,結果顯示,T2WI上呈現(xiàn)高信號,提示有腫瘤生長(圖1B)。解剖后發(fā)現(xiàn)腫瘤位置與MRI掃描圖一致(圖1C)。這5例肝癌PDX皮下模型中,LC31皮下模型建立成功,接種后18 d,開始可能觸摸到小芝麻粒樣的腫物,于35 d時腫物明顯。這例PDX模型通過游標卡尺測量,統(tǒng)計其生長曲線,發(fā)現(xiàn)呈對數(shù)生長(圖1D)。

圖1 肝癌PDX原位和皮下模型的生長特征Note.A.Schematic diagram of HCC orthotopic and subcutaneous PDX model establishment.B.MRI results of the LC30 and LC31 HCC orthotopic PDX model at 73,42 d,respectively.C.Anatomy images of the LC30 and LC31 HCCorthotopic PDX model at 73,42 d,respectively.D.The growth curve of LC31 HCC subcutaneous PDX model.Figure 1 HCC orthotopic and subcutaneous PDX model growth characterization

2.2 肝癌PDX原位和皮下模型組織病理形態(tài)均與原始腫瘤相似

肝癌PDX模型成功荷瘤后,將肝癌患者腫瘤組織、PDX模型肝原位和皮下成瘤的組織,用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、組織切片后進行HE染色,光鏡下觀察成瘤前后腫瘤組織類型變化。結果顯示,LC30肝癌PDX模型肝原位法(P1)得到的腫瘤細胞呈巢團狀排列,間質(zhì)較少,細胞異質(zhì)性明顯,核近圓形,不規(guī)則,核仁明顯,胞漿豐富,嗜酸性染色,形態(tài)同LC30患者(圖2A)。LC31肝癌PDX模型肝原位法(P1)腫瘤細胞彌漫性增生,細胞較小,大部分腫瘤呈篩狀生長方式(圖2A);LC31肝癌PDX模型皮下法(P1)細胞彌漫性增生,細胞較小,胞核較大,大部分腫瘤細胞排列較為整齊,呈篩狀生長方式(圖2B)。原位與皮下模型兩者與LC31患者原始腫瘤形態(tài)具有較高的相似性,表明原位與皮下成瘤均能較好的保持組織病理學特征。為了進一步明確PDX模型中是否有癌旁組織和小鼠肝組織細胞,比較了人源和小鼠源的肝組織的形態(tài),發(fā)現(xiàn)兩者的細胞核圓形、較大,位于細胞中央,不同于PDX的P0和P1代腫瘤細胞形態(tài),表明建立的PDX模型來源于腫瘤組織而非癌旁部分(圖2C)。

圖2 肝癌PDX原位和皮下模型的組織病理形態(tài)Note.A.LC30 and LC31 HCCorthotopic PDX model,HE staining.B.LC31 HCC subcutaneous PDX model HE staining.C.Human and mouse liver HE staining.Figure 2 Histology of HCC orthotopic and subcutaneous PDX tumor tissues and human tumor tissues

2.3 肝癌PDX原位模型較皮下模型成瘤率高

PDX模型的成瘤率和成瘤周期是制約該模型應用的兩個重要指標。本次實驗配對5例原位模型中成瘤2例(編號為LC30和LC31,成瘤率40%),皮下成瘤1例(編號為LC31,成瘤率20%)兩者差異具有顯著性(圖3A);成瘤時間分別為:原位模型LC30:23 d,LC31:43 d;皮下成瘤LC31:35 d(圖3B)。由于本次實驗數(shù)量較少,因此增加PDX模型(原位模型共6例,皮下模型共15例,編號見表1)綜合統(tǒng)計成瘤率,其中原位模型6例患者中3例成瘤,成功率為50%,皮下模型的15例患者中成功建模3例,成功率為20%(圖3C);原位腫瘤的平均成瘤時間為30 d,而皮下平均成瘤時間為68 d(圖3D)。綜上,原位PDX的成瘤率較皮下模型高100%~150%,成瘤時間比皮下模型相對短22.86%~126.67%(圖3)。

圖3 肝癌PDX原位和皮下模型的成瘤率與成瘤時間Note.A.The tumor formation rate in 5 paired HCC orthotopic and subcutaneous PDX model.B.The tumor formation time in LC31 HCC orthotopic and subcutaneous PDX model.C.The tumor formation rate in 6 HCC orthotopic and 15 subcutaneous PDX model.D.The tumor formation time in 6 HCC orthotopic and 15 subcutaneous PDX model.**P<0.01,****P<0.0001.Figure 3 Tumor formation rate and time in HCC orthotopic and subcutaneous PDX model

3 討論

肝細胞癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,是第二大致死性腫瘤,5年生存率約為18%,世界衛(wèi)生組織預計到2030年會有將近1億的死亡病例[11]。目前肝癌的治療方法包括手術切除,腫瘤消融法,肝動脈治療和系統(tǒng)性治療。對于早期肝癌患者(BCLC分期0或者A),手術和消融法是一線治療的首選方案。對于中期的肝癌(BCLC分期B)則考慮肝動脈治療法。對于晚期進展期肝癌患者(BCLC分期C)和部分中期患者則推薦以藥物為主的系統(tǒng)性治療[12]。肝癌進展隱匿,早期癥狀不明顯,確診時大多為中晚期,需接受放療和化療在內(nèi)的綜合治療方案,其中化療以經(jīng)驗性用藥為主。由于腫瘤患者的異質(zhì)性,個體差異較大,相同的病理診斷適用藥物不盡相同,臨床用藥有效性較低。

PDX模型是目前最接近臨床患者的藥物篩選模型,有望提供個體化的藥物策略,這些模型可以預測臨床結果,用于臨床前藥物評價,并用于腫瘤的生物學研究,同時也是新藥研發(fā)的重要工具。本實驗成功構建了原位和皮下的PDX模型,通過組織病理學檢測發(fā)現(xiàn)構建原位和皮下PDX后,與原發(fā)灶的組織結構和腫瘤類型十分接近。原位模型操作相對復雜,而且需要核磁等配套設備檢查成瘤情況。而皮下移植模型操作簡單,是沒有特殊要求和設備的情況下的常用模型構建方法(見表2)。

表2 肝癌原位與皮下PDX模型比對Table 2 Compatative analysis of HCC orthotopic and subcutaneous PDX models

皮下模型由于腫瘤組織生長的微環(huán)境與生理狀態(tài)不同,而且血供營養(yǎng)較少,因此導致PDX移植失敗率高,并且生長緩慢。在PDX模型建立中P1代建模的成功率是“卡脖子”問題,本實驗中構建的肝癌原位PDX成功率為50%,皮下PDX成功率約為20%,原位的成功率高于皮下成瘤率PDX模型,約2~3倍,且差異具有顯著性,這為難生長的腫瘤的模型建立提供一個較高生存幾率的建模方法;同時我們發(fā)現(xiàn)原位模型平均成瘤時間為30 d,明顯腫瘤產(chǎn)生時間為68 d,平均成瘤縮短一半左右(見表2)。研究報道肝腫瘤細胞皮下P1代的平均成瘤時間為97 d,都長于原位PDX模型成瘤時間[9]。盡管目前還因為數(shù)量比較少,bar值較高還沒有統(tǒng)計學差異。在以后的實驗中增加樣本量,預期獲得有統(tǒng)計學差異的成瘤時間。

綜上,本次研究成功構建肝癌原位和皮下PDX模型,肝癌原位PDX模型的高成瘤率為難生長腫瘤的建模提供了一個新方法,但皮下模型操作相對簡單,觀察方便。在具體科學實踐中根據(jù)需求具體選擇,例如:對于較難生長和樣本珍貴的腫瘤,優(yōu)先選擇原代接種;當樣本易得,無特殊設備,或者數(shù)量較大時可選擇皮下模型造模;而且原位模型成瘤后傳代也可以考慮使用皮下模型。兩種模型為深入探索HCC的發(fā)病機制,及藥物篩選提供了有效的動物模型。在本實驗使用腫瘤組織塊構建PDX模型,在實際應用中還有胸腹腔積液,循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞等[13-14],這些模型構建需要針對各自特點調(diào)整操作;本實驗涉及的標本均為原位肝癌,關于原位與皮下PDX模型在轉移瘤中的特點需要今后收集肝癌轉移病例驗證;而且實驗樣本量相對較少,在以后的科研實踐中需要增加肝癌患者樣本量,豐富原位和皮下PDX模型的構建方法和效能評價數(shù)據(jù)。此外,原位和皮下PDX模型是將患者腫瘤組織接種在免疫缺陷小鼠身上,因此,破壞了腫瘤-免疫相互作用,如果在目前模型的基礎上,使用免疫系統(tǒng)人源化的小鼠模型,將會為研究人免疫系統(tǒng)與腫瘤之間相互作用提供有力模型工具[15]。