查玉玲,孔淼,周育平*,張文杰

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院,北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029)

心腎綜合征(Cardiorenal Syndrome,CRS)是心臟或腎中某一器官發(fā)生急性或慢性病變引起另一個器官的急性或慢性病變[1],分為5種亞型。I型和II型是指心力衰竭(heart failure,HF)引起腎功能損害。研究表明,大于1/4的HF患者合并腎功能不全[2],腎損害是HF死亡的獨立危險因素[3]。由于I型CRS起病急,發(fā)病快,病情重和致死率高,臨床治療措施局限,而II型CRS是許多心血管疾病的共同轉歸和結局,是近年HF領域研究的焦點,因此本文主要研究II型CRS動物模型。

CRS機制研究主要包括:血流動力學異常(靜脈淤血及灌注不足),神經內分泌紊亂、炎癥反應、氧化應激、內皮功能異常和貧血等[4],主要生物標記物包括:中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)、B型鈉酸肽(BNP)或NT-proBNP、Galectin-3、a-Klotho蛋白、胱抑素C(CysC)等[5]。有關CRS發(fā)病機制研究已有進展,但尚不明確,尋找合適的動物模型有助于明確CRS病理過程,系統(tǒng)探究其內在規(guī)律。

1 單一模型

1.1 心力衰竭動物模型

血流動力學改變是CRS發(fā)病最初驅動力。HF發(fā)生時,心輸出量減少導致腎灌注不足,以及中心靜脈壓(CVP)升高,腎靜脈淤血,均可造成腎小球濾過率下降。過度激活的腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)導致血管收縮,水鈉潴留,血管內皮功能受損,血管彈性降低,血壓升高,加重腎灌注受損。因此HF模型從理論上可以作為CRS模型使用。

1.1.1 冠狀動脈結扎動物模型

冠脈結扎通過造成冠脈管腔變窄,影響心臟血流供應,長期易導致心衰,與人類缺血性心衰機制相似,冠狀動脈結扎(MI)術是構建心梗后HF的經典模型。Harrison等[6]通過MI術構建2型CRS模型,術后90 d大鼠出現(xiàn)心梗后HF,心室重量增加,左室舒張功能受損且壓力升高,肌酐清除率明顯降低,腎基底膜增厚,腎小球濾過率降低。該模型提供了由HF導致腎損傷的確鑿的形態(tài)、生化和功能證據,是2型CRS代表模型。郝慧鑫[7]采用MI術,6周后觀察到小鼠腎破壞明顯,小鼠心臟、腎纖維化(腎小球和間質)程度、NGAL表達量、血肌酐(SCr)水平明顯升高。Krishnan等[8]采用MI術,觀察到大鼠心室后壁變薄,炎性細胞浸潤,腎纖維化,腎小管壞死。Qiu等[9]采用MI術,28 d后大鼠左室收縮末和舒張末內徑顯著升高,左室射血分數(shù)(LVEF)和短軸縮短率(LVFS)顯著降低,腎主動脈阻力指數(shù)升高,血管緊張素II(AngII)、尿素氮(BUN)、環(huán)磷鳥苷(cGMP)和SCr濃度升高,腎小管擴張明顯,腎間質可見大量炎性細胞浸潤。

雖然MI術在確定終點事件時操作方法不盡相同,最終病理變化也存在差異,但都成功模擬出CRS病理過程。目前此類模型成模觀察時間在4~6周[6],造模的成功率與結扎部位高低以及操作人員熟練能力有直接關系,目前成功率一般>70%[6-7,9]。Duan等[10]提出MI術能激活大鼠體內RAAS系統(tǒng),實驗中注射外源性AngII可以增加HF大鼠的氧化應激反應。

1.1.2 主動脈縮窄動物模型

主動脈縮窄(TAC)術通過造成主動脈血流受阻,血壓增高,誘導左室增生肥厚,是研究壓力負荷性HF的常見模型。Kamal等[11]通過TAC術構建CRS模型,術后4~6周小鼠開始出現(xiàn)HF,當小鼠出現(xiàn)晚期非缺血性慢性HF時,小鼠SCr和腎損傷標記物1(KIM-1)表達增加,心腎出現(xiàn)纖維化。研究顯示HF小鼠模型誘導腎功能惡化、腎小管間質重塑和炎癥發(fā)展無需手術操作來實現(xiàn),優(yōu)于缺血性心臟損傷和腎損傷相結合的方法,減少了實驗創(chuàng)傷。Zhao等[12]采用TAC術,術后8周小鼠心臟β-肌球蛋白重鏈(β-MHC),基質纖連蛋白和促炎性腫瘤壞死因子-α(TNF-α)明顯增加,同時小鼠腎小球足細胞標志物podocalyxin的表達受到抑制,出現(xiàn)纖連蛋白和Snail1的腎表達。這表明TAC可能觸發(fā)了心臟Wnt/β-catenin途徑激活心臟RAAS和促炎性細胞因子釋放,而循環(huán)細胞因子(例如TNF-α)反向抑制了腎中的klotho蛋白表達,從而導致腎損傷。

TAC術可重復性強,且HF呈現(xiàn)漸進性發(fā)展,可以觀察心臟從代償走向失代償?shù)纳聿±碜兓?可以很好地模擬CRS病理過程。目前此類模型成模觀察時間在4~8周[11-12],有研究提示近心端結扎腹主動脈縮窄術致CHF癥狀及程度更明顯,但是成活率相對降低,為60%,實驗難度相對增大[13]。

1.1.3 自發(fā)性高血壓模型

自發(fā)性高血壓(SHR)模型多用于高血壓研究,與RAAS、NO、免疫炎癥、血管功能障礙等機制有關[14]。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)老年雄性SHR大鼠9周齡時收縮壓開始升高,65周>150 mmHg,平均動脈壓(199.0±8.1)mmHg;左室肥厚(LVH)隨年齡增加而增加,且老年SHR大鼠RAAS活性增強,尿蛋白和白蛋白排泄增加,出現(xiàn)腎小球硬化和壞死、腎小管細胞凋亡、腎間質淋巴細胞浸潤、心腎小血管內皮細胞和平滑肌細胞凋亡等現(xiàn)象。

SHR模型在自然條件下產生的,與人類相應疾病近似,很好地模擬臨床心腎損傷的自然過程。其成模周期、成模率不需要實驗者考慮,比較便捷,但目前由于其仍受到培養(yǎng)周期長、環(huán)境要求高、動物價格高等因素的影響,所以在實際應用中仍受到一定的限制[16]。

1.1.4 給藥動物模型

Angelini等[17]腹腔注射野百合堿(MCT)30 mg/kg誘發(fā)肺動脈高壓性右室衰竭,術后大鼠出現(xiàn)較高BNP水平,血清促炎型細胞因子、胰蛋白酶、腎和心臟組織NGAL水平升高,右室肥厚擴張,伴有胸腹腔積液出現(xiàn)。Matsushita等[18]使用注射氯化鉀聯(lián)合心肺復蘇法誘發(fā)急性CRS模型,術后小鼠出現(xiàn)急性腎損傷,表現(xiàn)出少尿、腎小球濾過率降低、腎小管上皮細胞損傷/死亡、炎癥浸潤等現(xiàn)象。該模型死亡率高,可重復性低,實驗穩(wěn)定性較差。歐陽過等[19]采用腹腔注射阿霉素3 mg/kg,術后模型大鼠心腎功能出現(xiàn)損傷,心肌及腎組織細胞凋亡率、血清NTproBNP、KIM-1含量均增加。

本模型與人體CRS發(fā)生過程存在一定差異。目前在給藥模型中,野百合堿模型成模率在70%~80%,造模時間在4周左右,有研究提示50 mg/kg劑量組野百合堿誘導的動物模型更為接近大鼠肺動脈模型的理想數(shù)值[20]。氯化鉀聯(lián)合心肺復蘇法成模率在37%~60%,臨床死亡率較高,造模時間在7周左右[18}。阿霉素注射臨床成模率在40%~60%,與阿霉素的注射速度、累積劑量均有關聯(lián),有研究提示以2 mL/kg體重劑量腹腔注射,每周1次,共6周,累積總量24 mg/kg體重可以構建心衰模型[21]。

1.1.5 動靜脈瘺動物模型

Aboryag等[22]采用腎下主動脈腔瘺(ACF)法構建大鼠HF模型,術后28 d大鼠心肺重量指數(shù)明顯增加,CVP、左室舒張末期壓力和容積、左室收縮末期容積顯著升高,LVEF顯著降低,腎小球出現(xiàn)萎縮性改變,Bowman腔變寬,腎小球結構、近曲小管結構明顯改變,出現(xiàn)上皮脫落和刷緣丟失等現(xiàn)象,這些發(fā)現(xiàn)提供了HF導致腎損傷的形態(tài)學證據,支持了CRS的病理過程。Abu等[23]采用大鼠腹主動脈和下腔靜脈間造瘺術,術后大鼠尿流量和腎小球濾過率明顯降低,鈉排泄、腎血漿流量明顯下降,腎小管損傷,尿NAGL絕對排泄量顯著增加。

動靜脈瘺手術造成局部血流動力學改變,可以用于研究血流動力學對CRS的影響,然而小動物靜脈薄且脆,臨床上大動物模型的解剖結構更接近于臨床狀況,因此血液動力學剪切應力研究一般選用大型動物模型[24-25]。目前動靜脈瘺成模時間為(28±2)d[22],大型動物模型臨床成模率較高,大部分在90%~100%,但是大型動物模型實驗成本較高[25]。

1.2 轉基因小鼠模型

基因小鼠模型目前被認為是最具前景的動物模型。Pleasant等[26]采用心肌細胞特異性高表達突變體αβ-晶體蛋白的轉基因小鼠模型,與野生型(WT)相比,轉基因小鼠的SCr、NAGL、腎小管腎素蛋白表達均明顯增高,這些為無癥狀HF小鼠模型腎內RAAS的早期活化提供了證據。Giam等[27]采用擴張型心肌病(DCM)轉基因小鼠模型,發(fā)現(xiàn)DCM小鼠的腎小管間質和腎小球纖維化程度(分別為88%和73%)高于同齡WT小鼠,腎氧化性谷胱甘肽水平比WT小鼠高40%,舒張期和收縮期室間隔厚度分別比WT小鼠少35%和44%,收縮期左室后壁厚度比WT小鼠減少25%,這些數(shù)據說明2型CRS模型與腎炎癥,谷胱甘肽缺乏和纖維化有關。Klotho基因編碼的a-Klotho蛋白,在臨床研究中被認為有心腎的雙重保護作用。劉熹等[28]發(fā)現(xiàn)下調或者敲除a-Klotho基因,可以加重心、腎損傷。

轉基因小鼠模型遺傳背景相對穩(wěn)定,突變方向人工可控,對研究CRS病理機制,開發(fā)新藥物具有一定的優(yōu)勢。當然其操作要求更高,造模成本相應增加見表1。

表1 II型CRS單一模型一覽表Figure 1 List of type II CRSsingle models

2 復合動物模型

與單式模型相比,復合模型在展現(xiàn)心腎之間互為影響的病理過程時更加貼近臨床實際。但是在臨床研究中,著重點往往在于觀察指標的情況,對于復合模型的造模成功率、造模時間關注較少。

2.1 冠脈結扎聯(lián)合腎切除動物模型

冠脈結扎聯(lián)合腎切除是目前CRS造模最常用的方法之一。韋震鳴等[29]采用MI聯(lián)合5/6腎切除術,手術以心肌缺血發(fā)白,腎缺血發(fā)白面積在5/6左右為造模成功,造模兩次手術間隔時間1周,存活率53.84%,這種方法不僅縮短了造模周期,降低了死亡率,而且在明顯誘導出慢性心腎功能受損及心肌組織纖維化的基礎上保持了器官的完整性,提高了實驗的效率和穩(wěn)定性。吳英智[30]采用MI聯(lián)合3/4腎切除進行造模,大鼠存活77.8%,MI術后2周(腎切術后1周),模型大鼠SCr、BUN、BNP明顯升高,MI術后4周(腎切術后3周),24 h尿蛋白、心臟質量指數(shù)、左腎質量指數(shù)明顯升高,心臟和腎HE染色非梗死區(qū)大量炎癥細胞浸潤和纖維結締組織生長。吳氏認為減少腎切面積,可簡化手術過程,降低死亡率,造模早期心功能和腎功能即明顯下降,符合CRS發(fā)病過程中心、腎相互作用和病程發(fā)展的的病理特點。段曉宇等[31]通過MI術結合腎急性缺血再灌注損傷制備CRS模型,術后大鼠血中Cys-C、SCr、Ang II、尿微量白蛋白(UMA)和NGAL含量均顯著升高,腎損傷嚴重。盛曉生等[32]采用左腎切除聯(lián)合MI術,造模后CRS組血清中和肽素(CPP)、SCr、尿肌酐(UCr)、BUN均顯著升高,CPP作為AVP前體羧基末端的一段多肽,在血中長期保持穩(wěn)定,利于檢測,可作為生物標志物替代AVP的檢測。

雖然構建心腎復合模型時,心腎損傷面積并沒有統(tǒng)一的標準,但此類模型臨床指標較為完善,有利于揭示心腎互相影響的臨床機制。此類復合模型因為急性CRS模型和慢性CRS模型差別,造模周期存在差異。

2.2 藥物聯(lián)合腎切除模型

吳翔等[33]采用鹽酸多柔比星腹腔注射聯(lián)合5/6腎切除術,術后大鼠LVFS、LVEF明顯下降,心臟組織細胞凋亡信號調節(jié)激酶1(ASK1)、心肌細胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38 mRNA和蛋白表達均明顯升高,心肌細胞凋亡率明顯升高,說明腎功能不全可以促進心功能不全的發(fā)展。Yang等[34]采用5/6腎切除聯(lián)合腹腔注射阿霉素(累積量7.5 mg/kg)和每日高蛋白飲食誘導CRS,術后第63天時,模型大鼠BUN和Cr以及尿蛋白/肌酐顯著升高。

本方法簡捷高效,與單一腎切除造模時間相似[35],由于藥物毒性作用很難控制劑量以及排除對其他器官的干擾,給藥聯(lián)合手術的方式增加了實驗的難度,具有一定的局限性(見表2)。

表2 II型CRS復合模型一覽表Figure 2 List of type II CRScomposite models

3 討論

無論是外科手術、藥物模型、單式模型、復式模型還是轉基因模型,均一定程度反映了CRS病理機制,但并非完美地模擬了CRS發(fā)病和進展過程,故需要探索優(yōu)質模型以模擬心腎之交互作用,以及伴隨的血液動力學和全身代償機制的激活,為藥物治療評價提供手段。