侯外方,張茂森,張琳,韓敏,石璇,陳美蓉,欒晶

(陜西省缺血性心血管疾病重點實驗室,陜西省腦疾病重點實驗室,西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所,西安 710021)

1 血管性認(rèn)知障礙概述

血管性認(rèn)知障礙(vascular cognitive impairment,VCI)是一個綜合癥[1],致病因素較為復(fù)雜,包含有腦血管病的危險因素,例如:高血壓病、糖尿病、高脂血癥、同型半胱氨酸血癥和代謝綜合征等[2-6],涵蓋了顯性腦血管病,例如:腦梗死和腦出血等[7]以及非顯性腦血管病如:白質(zhì)損傷和慢性腦缺血等[8-9]導(dǎo)致的從輕度認(rèn)知損害到癡呆的臨床綜合征。它的發(fā)病和發(fā)展是一個持續(xù)的由輕至重的發(fā)展過程,包括非癡呆性VCl(VCI non-dementia,VCIND)和血管性癡呆(vascular dementia,VaD)。血管性認(rèn)知障礙的病程持續(xù)加重會演變?yōu)檠苄园V呆。尤其在中老年人群中發(fā)病較高[10-13]。VCI嚴(yán)重?fù)p害患者日常生活能力和社會功能,明顯降低患者的生活質(zhì)量,已經(jīng)成為重大的公共衛(wèi)生問題之一。

值得一提的是,VCI是除了年齡之外最大的單一可識別的癡呆風(fēng)險因素,這意味著由血管疾病導(dǎo)致的癡呆癥狀或許是最有可能在發(fā)病早期發(fā)現(xiàn)、并通過早期干預(yù)阻止病程進(jìn)一步惡化的癡呆[14-15]。成功建立慢性腦缺血性血管性認(rèn)知障礙的動物模型,是醫(yī)學(xué)研究其發(fā)病機(jī)制、探索治療方法并攻克此疾病的第一步?，F(xiàn)有的研究顯示,腦血流量減少40%~50%,腦細(xì)胞活動就會受到明顯的抑制。在慢性缺血的條件下,廣泛的腦血管病變會導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的不可逆性損傷、腦灰質(zhì)減少、腦白質(zhì)損傷、腦脂質(zhì)穩(wěn)定性異常、軸突和髓磷脂損傷,這些的病理變化會影響大腦的電生理活動,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)對信息的攝取、傳遞、整合、處理能力衰退最終影響認(rèn)知功能造成認(rèn)知功能障礙[16-19]。因此,通過手術(shù)法結(jié)扎或閉塞重要的腦部大血管,是模擬VCI發(fā)病機(jī)理,構(gòu)建VCI模型的較好途徑。

2 VCI動物模型的構(gòu)建

2.1 大鼠四血管閉塞法及其改良模型

2.1.1 大鼠四血管閉塞法

Pulsinelli等[20]在1979年提出的四血管閉塞(4-vessel occlusion,4-VO)法。此手術(shù)方法被廣泛用于研究腦缺血性認(rèn)知障礙[21-24]。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),通過電灼法永久閉塞Wistar大鼠兩個椎動脈,并在雙側(cè)頸總動脈處放置松弛的可逆性卡環(huán),24 h后收緊頸動脈卡環(huán)暫時閉塞雙側(cè)頸總動脈以達(dá)到四血管閉塞的目的,根據(jù)研究目的選擇在術(shù)后間隔10、20、30 min解除頸總動脈卡環(huán)的閉塞,實現(xiàn)頸總動脈的血液再流通。

(2)模型機(jī)制:a:缺血受損:通過永久性閉塞大鼠雙側(cè)椎動脈,配合間歇性閉塞雙側(cè)頸總動脈,主要導(dǎo)致大鼠前腦大腦半球嚴(yán)重缺血缺氧引起腦神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)障礙以及細(xì)胞氧代謝障礙,引起腦組織神經(jīng)元細(xì)胞壞死,同時壞死細(xì)胞觸發(fā)炎癥反應(yīng),致使白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)如:基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等生成,最終導(dǎo)致一氧化氮(NO)和氧自由基(ROS)生成增多導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫出血和死亡[25],與大鼠智能相關(guān)的區(qū)域受損嚴(yán)重,而腦干部分幾乎不受影響。b:缺血再灌注損傷:由于再通雙側(cè)頸總動脈致使血液再流通,引起氧化應(yīng)激、白細(xì)胞浸潤、炎癥反應(yīng)過度激活、血腦屏障遭到破壞以及白細(xì)胞和補體過度激活共同加重的腦損傷[26]。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在施行不同時間間隔的頸總動脈再通的4-VO手術(shù)后,大鼠腦部不同區(qū)域的損傷程度不同,且損傷程度與缺血時間成正比表現(xiàn)出逐級加重,損傷涵蓋了海馬的HI區(qū)、H3-5區(qū)和旁正中區(qū)、后新皮質(zhì)的第3、5和6層以及紋狀體[27]。有研究表明4-VO法術(shù)后的動物存在前腦短暫性缺血性不可逆性損傷,損傷涵蓋了脆弱神經(jīng)元群體,如海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞等也包含在內(nèi),這個大腦區(qū)域?qū)W(xué)習(xí)和記憶至關(guān)重要[28]。b:認(rèn)知行為學(xué):4-VO大鼠在術(shù)后除了記憶功能障礙之外,還存在感覺運動障礙或者非特異性認(rèn)知缺陷,出現(xiàn)有持續(xù)的記憶困難[28],該手術(shù)方法是針對鼠類最初的研究大腦缺血性疾病認(rèn)知障礙的手術(shù)方法。

(4)模型制作的注意事項:該手術(shù)方案由于需要閉塞大鼠椎動脈,手術(shù)較為精細(xì)復(fù)雜對于實驗操作者具有較高的要求。

(5)優(yōu)點:根據(jù)研究目的控制動脈閉塞的時間(10、20、30 min解除頸總動脈卡環(huán)的閉塞),間接控制動物腦損傷的程度。

(6)缺點:同時閉塞四支主要供應(yīng)腦部的血管可造成較高的大鼠死亡率,現(xiàn)今研究已經(jīng)較少應(yīng)用。

2.1.2 大鼠四血管閉塞法的第1種改良模型

Yamaguchi團(tuán)隊提出對于4-VO法進(jìn)行改進(jìn),改良版的4-VO法也被大量學(xué)者沿用[29]。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),在手術(shù)過程中將Wistar大鼠雙側(cè)頸總動脈和雙側(cè)椎動脈同時夾閉、并間隔一段時間(10 min或30 min)后將四支血管進(jìn)行再疏通。

(2)模型機(jī)制:術(shù)后大鼠腦血流量(cerebral blood flow,CBF)減少,同4-VO中的病變機(jī)制一致。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:在術(shù)后24、48、72 h,間隔10 min再疏通血管實驗組中動物CA1和CA3區(qū),以及在實驗組間隔30 min再疏通實驗組中動物的RGb、S1、白質(zhì)、丘腦、CA1、CA2、CA3和齒狀回都觀察到相應(yīng)細(xì)胞的損傷[29]。b:神經(jīng)功能評分:實驗動物存在神經(jīng)缺陷,神經(jīng)功能評分明顯下降[29]。

(4)模型制作的注意事項:該手術(shù)方案被廣泛采用后,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)無論用4-VO還是改良4-VO法,再疏通血管間隔的不同時間、手術(shù)中動物腦部處于的不同溫度環(huán)境、以及術(shù)后時間的長短都會影響大腦病變損傷部位和程度[30-33],進(jìn)而,在研究疾病的過程中,通過控制上述變量可得到動物的不同病理表現(xiàn),使得該手術(shù)方案的應(yīng)用更加廣泛。值得一提的是,4-VO法和改良4-VO法也可被應(yīng)用于腦缺血和腦缺血性再灌注損傷的相關(guān)研究[34-37],這也體現(xiàn)了該手術(shù)方法適用范圍的廣泛性。

(5)優(yōu)點:改良的4VO手術(shù)不影響血氣值、血細(xì)胞比容、血紅蛋白或直腸溫度,也不導(dǎo)致食管或氣管損傷或過度出血。根據(jù)研究目的控制動脈閉塞的時間、術(shù)中腦溫度等因素可間接控制動物腦損傷的程度。

(6)缺點:手術(shù)需同時閉塞四支主要供應(yīng)腦部的血管,大鼠因大腦缺血缺氧導(dǎo)致死亡率較高,該問題目前仍舊沒有得到根本性的解決。

2.1.3 大鼠四血管閉塞法的第二種改良模型

Pereira等[38]2012年通過研究提出了基于4-VO方案的另一種新型Wistar大鼠的缺血性認(rèn)知功能障礙的動物模型。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),通過椎動脈和頸內(nèi)動脈的永久性閉塞并且按照雙側(cè)椎動脈→頸內(nèi)動脈→頸內(nèi)動脈的順序?qū)τ谠撍臈l血管進(jìn)行3階段逐漸閉塞(4-vessel occlusion/internal carotid artery,4-VO/ICA),選擇級間間隔(the interstage interval,ISI)即一個閉塞階段和下一個閉塞階段之間經(jīng)過的時間分別為7、5、4或3 d。

(2)模型機(jī)制:術(shù)后大鼠出現(xiàn)慢性腦血流量(cerebral blood flow,CBF)灌注減少,同4-VO中的病變機(jī)制一致,不同的是術(shù)中未再進(jìn)行血液再灌注,避免腦部血液再灌注損傷,且大鼠腦血流量逐漸減少,大鼠生理指標(biāo)較穩(wěn)定。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:實驗表明,海馬CA1至CA4亞區(qū)、RS、PtA皮層中功能正常的錐體細(xì)胞,隨著ISI的縮短和4-VO/ICA術(shù)后閉塞血管時間的延長而減少即神經(jīng)退行性程度增加。該研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)4-VO/ICA持續(xù)時間增加,到90 d,神經(jīng)變性的程度僅輕微增加且不顯著,即腦損傷的程度不會出現(xiàn)和持續(xù)時間呈正相關(guān)的現(xiàn)象。研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞變性和死亡的發(fā)生發(fā)展在很大程度上是在4-VO/ICA的最初幾天內(nèi)發(fā)生的[38]。b:認(rèn)知行為學(xué):新型8臂放射狀迷宮實驗顯示動物出現(xiàn)逆行性遺忘(健忘癥)且病變程度隨著4-VO/ICA慢性化程度的增加而增加。

(4)注意事項:在使用該模型時,可根據(jù)研究目的選擇ISI和術(shù)后間隔時間。研究提示ISI越短動物腦灌注越不足。由于神經(jīng)細(xì)胞變性和死亡的發(fā)生發(fā)展很大程度上是在最初幾天內(nèi)發(fā)生的,這也提示其他學(xué)者,如果應(yīng)用該動物模型研究藥物在預(yù)防永久性4-VO/ICA后神經(jīng)元死亡方面的藥效,那么給藥時間要盡可能早(即在閉塞階段)或在4-VO/ICA完成后不久開始。

(5)優(yōu)點:該方法避免了因動物眼部的不完全性缺血造成的動物視覺功能障礙而影響迷宮實驗中評估學(xué)習(xí)和記憶的實驗數(shù)據(jù),保證了實驗數(shù)據(jù)的可靠性[38-39]。

(6)缺點:因大鼠腦部主要供血的四支血管同時閉塞,極易造成大鼠因腦部短時間供血不足而死亡。此外,有研究表明4-VO法大鼠的認(rèn)知障礙只存在于中老年大鼠而對于年輕大鼠無效[40-41]。

2.2 大鼠兩血管閉塞法及其改良模型

2.2.1 大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法

雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法(bilateral common carotid arteries ligation,2-VO)是通過SD大鼠雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎的方法,來研究慢性整體腦血液灌注不足對于認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)退行性過程的影響。利用該模型對血管性癡呆(VD)的研究涵蓋了2-VO相關(guān)的腦血液灌注不足程度、代謝變化、學(xué)習(xí)和記憶障礙、神經(jīng)元信號衰竭、以及海馬的神經(jīng)病理改變等[42]。因而也被眾多學(xué)者應(yīng)用于VCI研究。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),于大鼠的雙側(cè)頸總動脈進(jìn)行同時結(jié)扎閉塞,從而構(gòu)建大鼠腦部血液灌注不足的模型。

(2)模型機(jī)制:永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈,腦組織處于慢性低灌注狀態(tài),從而產(chǎn)生大腦嚴(yán)重缺血缺氧引起腦神經(jīng)細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)障礙以及細(xì)胞氧代謝障礙,引起腦組織神經(jīng)元細(xì)胞壞死,同時壞死細(xì)胞觸發(fā)炎癥反應(yīng),致使白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)如:基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等生成,最終導(dǎo)致一氧化氮(NO)和氧自由基(ROS)生成增多導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫出血和死亡[25],腦組織的損害是漸進(jìn)性的,學(xué)習(xí)記憶功能的損害程序性加重。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:由于大腦中的灰質(zhì)、白質(zhì)、以及海馬對于缺血缺氧都非常的敏感,故缺血缺氧后常發(fā)生灰質(zhì)、白質(zhì)、以及海馬體損傷和神經(jīng)元死亡這些病理學(xué)改變會引起動物學(xué)習(xí)和記憶障礙記憶功能下降發(fā)生缺血型中風(fēng)[43-44]。b:認(rèn)知行為學(xué):4-VO法構(gòu)建的大鼠模型表現(xiàn)出持續(xù)受損的空間學(xué)習(xí)能力[45],2VO法可實現(xiàn)相同的表型[46],2-VO法構(gòu)建的大鼠存在學(xué)習(xí)和記憶障礙。

(4)注意事項:在進(jìn)行手術(shù)的過程中,結(jié)扎動脈時保證實現(xiàn)血管的完全閉塞。

(5)優(yōu)點:由于2-VO法術(shù)后出現(xiàn)的病理學(xué)損傷的病因和其手術(shù)操作比4-VO法相對簡單,術(shù)后動物表現(xiàn)出持續(xù)受損的空間學(xué)習(xí)能力,與4-VO一致。2-VO隨后被認(rèn)為是大腦缺血后認(rèn)知障礙病和血管性癡呆(VD)的理想模型。該手術(shù)方案相對簡單,手術(shù)成本也較低。

(6)缺點:該模型仍存在不足,例如因需同時結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈,動物腦部迅速發(fā)生低血流量灌注,導(dǎo)致較高的死亡率;此外,有報道發(fā)現(xiàn)2-VO術(shù)后動物表現(xiàn)出的認(rèn)知缺陷有部分原因是術(shù)后動物眼部的不完全缺血造成視網(wǎng)膜損傷[47-48],影響了動物的視覺功能,混淆了行為學(xué)中評估學(xué)習(xí)和記憶表現(xiàn)的實驗數(shù)據(jù)。

2.2.2 改良大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法

隨著對血管性癡呆研究的深入,Sarti等[49]提出了將大鼠[50]兩側(cè)頸總動脈分別間隔1周做兩次手術(shù)結(jié)扎即改良的2-VO法。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),用結(jié)扎線對于大鼠的雙側(cè)頸總動脈進(jìn)行間隔1周的結(jié)扎閉塞。

(2)模型機(jī)制:機(jī)制同2-VO法,間隔1周分兩次永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈,腦組織處于慢性低灌注狀態(tài),從而產(chǎn)生缺血缺氧性損害,腦組織的損害是漸進(jìn)性的,學(xué)習(xí)記憶功能的損害程序性加重。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:存在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷,白質(zhì)區(qū)也有損傷。b:認(rèn)知行為學(xué):Morris水迷宮等行為學(xué)實驗結(jié)果也驗證了相對與假手術(shù)組,實驗組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶成績潛伏期明顯延長(P<0.01)[51]。以上結(jié)果說明改良后的手術(shù)方案能夠復(fù)制大鼠的血管性癡呆的模型,且顯著提高術(shù)后動物的成活率。

(4)注意事項:在進(jìn)行大鼠的動脈閉塞過程保證結(jié)扎線完全閉塞動脈血管,實現(xiàn)頸總動脈的完全閉塞。

(5)優(yōu)點:改良2-VO手術(shù)法避免了同時結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈導(dǎo)致的大鼠腦急速缺血缺氧,從而降低大鼠死亡率。吳章福等[51]采取Sarti等[49]提出的設(shè)想驗證了采用改良的2-VO法,發(fā)現(xiàn)在術(shù)后大鼠48 h和60 d的成活率相對于傳統(tǒng)的同時結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)而言,有顯著的提高:傳統(tǒng)2-VO實驗組60 d的成活率為40%,而改良組60 d的成活率為75%(P<0.05)。此外,該手術(shù)操作簡單,手術(shù)成本較低。

(6)缺點:由于手術(shù)分兩次進(jìn)行,首次手術(shù)和二次手術(shù)間隔時間為1周,實驗周期延長。

2.3 大鼠一側(cè)頸總動脈閉塞一側(cè)頸總動脈的狹窄法。

根據(jù)現(xiàn)有的研究,Mansour團(tuán)隊提出了對于成年SD大鼠的一側(cè)頸總動脈閉塞一側(cè)頸總動脈的狹窄模型(modified common carotid artery occlusion,mCCAO)。

(1)具體構(gòu)建方法:在動物麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),用6-0號絲線將左側(cè)頸總動脈進(jìn)行結(jié)扎,同時,將右側(cè)頸總動脈與動脈和較鈍的29號針捆綁在一起,而后抽出針的建模方法,這種技術(shù)保留了該側(cè)動脈的部分血流,成功構(gòu)建了一側(cè)頸總動脈閉塞一側(cè)頸總動脈的狹窄(modified common carotid artery occlusion,mCCAO)。

(2)模型機(jī)制:機(jī)制同2-VO法,腦組織處于慢性低灌注狀態(tài),從而產(chǎn)生缺血缺氧性損害。

(3)評價指標(biāo):a:影像學(xué):mCCAO引起中度缺血腦部血流量灌注下降,但是沒有腦梗塞,隨著時間的推移該模型動物狹窄一側(cè)動脈會出現(xiàn)自發(fā)閉塞,動物椎動脈和基底動脈形成了側(cè)支代償循環(huán),動物CBF在進(jìn)行手術(shù)后第1周表現(xiàn)出逐漸適量減少,在第2周趨向于平穩(wěn),然后從第3周到第4周開始恢復(fù)。b:病理學(xué)變化:研究顯示海馬CA1亞區(qū)受損神經(jīng)元的百分比在mCCAO術(shù)后第4周約為30%,在mCCAO術(shù)后第8周約為23%。由大腦缺血導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷(WM)約在第4周出現(xiàn)并在第8周開始出現(xiàn)緩解。c:認(rèn)知行為學(xué):研究表明動物的腦血流量在第4周開始恢復(fù),第8周由缺血導(dǎo)致的WM損傷有緩解趨勢。但大鼠認(rèn)知障礙在第8周仍然存在且有加重的趨勢。此外,mCCAO術(shù)后大鼠僅存在空間學(xué)習(xí)障礙,而無運動功能障礙或出現(xiàn)不活動大鼠[52]。

(4)注意事項:對大鼠的體重要求嚴(yán)格,手術(shù)過程中盡可能的避免損傷血管,在將血管針捆綁而后抽針的過程避免血管的損傷。

(5)優(yōu)點:可通過不同型號的針構(gòu)建不同程度的頸總動脈狹窄,因此應(yīng)用范圍較為廣泛,手術(shù)花費較少。

(6)缺點:此模型的構(gòu)建更傾向于煙霧病[53]的病理模型,模型的局限性在于4~8周后腦白質(zhì)的損傷會得到一定的逆轉(zhuǎn),這一特點對研究血管性癡呆的治療效果以及病程進(jìn)展研究存在干擾,不利于對疾病預(yù)防和治療的進(jìn)一步探索。此外,該模型有潛在的腦脊液瘺形成。

2.4 小鼠雙側(cè)頸總動脈狹窄法(BCAS)

最初針對VCI的研究都是以大鼠為實驗對象展開的,缺少小鼠的模型。由于C57BL/6品系小鼠的后交通動脈存在發(fā)育不良,因此有學(xué)者通過手術(shù)將0.18 mm的金屬微線圈套在小鼠雙側(cè)頸總動脈上,造成小鼠頸總動脈狹窄(bilateral CCA stenosis,BCAS),腦部血液灌注不足、腦組織缺血缺氧的,以此方法成功構(gòu)建晚期皮質(zhì)下缺血的血管性癡呆模型。

(1)具體構(gòu)建方法:選取C57BL/6J小鼠在麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),采用0.18 mm的金屬微線圈套在小鼠雙側(cè)頸總動脈,對于兩支頸總動脈進(jìn)行狹窄化處理。

(2)模型機(jī)制:機(jī)制同2-VO法,因雙側(cè)頸總動脈狹窄,腦組織處于慢性低灌注狀態(tài),從而產(chǎn)生慢性缺血缺氧性損害。

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:經(jīng)檢測,約30 d后小鼠出現(xiàn)腦白質(zhì)損傷,8個月后在腦白質(zhì)嚴(yán)重的損傷的前提下,小鼠海馬也受到影響發(fā)生明顯的萎縮和凋亡,這是白質(zhì)損傷后通過信號調(diào)節(jié)間接介導(dǎo)海馬損傷的結(jié)果[54]。同時研究發(fā)現(xiàn)動物的血腦屏障通透性增加。b:認(rèn)知行為學(xué):實驗小鼠表現(xiàn)出空間工作記憶障礙以及運動功能受損(皮質(zhì)下血管性癡呆的關(guān)鍵特征之一)。

(4)注意事項:該手術(shù)很復(fù)雜,在手術(shù)過程中尤其要注意避免微線圈套入動脈過程中損傷動脈。

(5)優(yōu)點:動物在術(shù)后出現(xiàn)感覺/運動缺陷(即皮質(zhì)下血管性癡呆的典型特征之一),動物出現(xiàn)的海馬病變與人類患者這有相似之處,研究發(fā)現(xiàn)實驗動物不涉及視神經(jīng)損傷。

(6)缺點:在術(shù)后第3個月動物才開始出現(xiàn)感覺/運動缺陷(即皮質(zhì)下血管性癡呆的典型特征之一)。此外,術(shù)后30 d里BCAS小鼠模型并未出現(xiàn)皮質(zhì)下VCI的其他的如認(rèn)知障礙和記憶力減退的表型。該手術(shù)花費較高,且手術(shù)難度高。

2.5 不對稱雙側(cè)頸動脈狹窄法(ACAS)

ACAS模型較成功的復(fù)制了伴有梗塞和運動功能障礙的皮質(zhì)下低灌注型VCI。

(1)構(gòu)建方法:不對稱頸動脈手術(shù)(asymmetric CCA surgery,ACAS),選取C57BL/6小鼠在麻醉的前提下進(jìn)行手術(shù),用金屬微線圈套在C57BL/6J小鼠的一側(cè)頸總動脈,另一側(cè)頸總動脈采用Ameroid環(huán)[55]進(jìn)行結(jié)扎,由此構(gòu)建具有運動功能障礙和腦白質(zhì)梗死損傷模型。

(2)模型機(jī)制:機(jī)制同2-VO法,因一側(cè)頸總動脈狹窄,一側(cè)側(cè)頸總動脈漸進(jìn)性閉塞,腦組織處于慢性漸進(jìn)性血液低灌注狀態(tài),從而產(chǎn)生慢性缺血缺氧性損害傷

(3)評價指標(biāo):a:病理學(xué)變化:該模型動物CBF下降趨勢較平緩,在術(shù)后第14天和第32天可觀察到多個白質(zhì)梗死灶,皮質(zhì)下的胼砥體、內(nèi)囊、海馬傘和尾狀核都存在梗死相關(guān)病灶。b:認(rèn)知行為學(xué):動物表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知記憶障礙、執(zhí)行功能障礙、和運動功能障礙[56]。

(4)注意事項:該手術(shù)需要兩種技術(shù)較為復(fù)雜,在手術(shù)過程中尤其要注意避免微線圈套入動脈過程中損傷動脈。

(5)優(yōu)點:采用Ameroid環(huán)進(jìn)行手術(shù)實現(xiàn)了對于該側(cè)頸總動脈進(jìn)行逐漸進(jìn)行性的狹窄化處理,更加符合VCI的疾病進(jìn)展。

(6)缺點:ACAS小鼠不會發(fā)生微血管病理學(xué)變化,這與大多數(shù)VCI人類的發(fā)病機(jī)制存在差異[57]。術(shù)后,微線圈會對動脈血管內(nèi)皮產(chǎn)生不利影響[58-59]。該手術(shù)難度較高,且手術(shù)成本花費是BCAS法的兩倍以上。

3 以上不同手術(shù)方案的對比

繼大鼠4-VO法的提出與廣泛應(yīng)用,針對嚙齒類動物VCI模型構(gòu)建方法的改進(jìn)包括從手術(shù)方法(如:同時結(jié)扎4支供應(yīng)腦部的主要血管,到分批次結(jié)扎椎動脈和頸總動脈等)到實驗對象(從大鼠到小鼠)的嘗試?，F(xiàn)對以上幾種模型構(gòu)建方法進(jìn)行橫向比較。

3.1 2-VO法、4-VO法、mCCAO法對比

與4-VO法比,2-VO法在一定意義上降低了由于同時閉塞四支主要腦部供血的血管而導(dǎo)致的因腦組織急性缺血缺氧造成的高死亡率。此外,2-VO的手術(shù)操作更簡單。

與2-VO相比,4-VO可根據(jù)研究目的控制其他變量,間接控制動物腦損傷的程度,因此該方法的應(yīng)用范圍更加的廣泛。且4-VO術(shù)后的動物不存在眼睛的不完全缺血導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷影響動物的視覺功能。

與2-VO和4-VO相比,mCCAO法可使狹窄一側(cè)動脈自發(fā)閉塞,血管病理變化更接近腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。然而在術(shù)后第3周到第4周動物腦血流量開始逐漸恢復(fù),因缺血導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷(WM)損傷逆轉(zhuǎn)并且出現(xiàn)緩解。此外,mCCAO法大鼠僅存在空間學(xué)習(xí)障礙,該特點對血管性癡呆的治療效果以及病程進(jìn)展研究存在缺陷。

3.2 大鼠模型與小鼠模型對比

小鼠模型的構(gòu)建使得對VCI的研究不再僅局限于以往的大鼠研究,但因小鼠的組織器官更小,在進(jìn)行手術(shù)時操作難度高于大鼠。小鼠手術(shù)方案(ACAS,BCAS)實現(xiàn)了頸總動脈血管逐漸閉塞,這對于臨床上的心腦血管疾病的研究都具有重要的意義。此外,目前大部分轉(zhuǎn)基因動物為不同品系小鼠,如果研究目的涉及特定的基因功能,需要應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠來進(jìn)行建模。

大鼠的優(yōu)勢在于術(shù)后所出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙相對小鼠更加明顯,BCAS小鼠模型30內(nèi)并不出現(xiàn)皮質(zhì)下VCI的如認(rèn)知障礙等表型,ACAS小鼠不出現(xiàn)微血管病理變化。

3.3 BCAS法與ACAS法對比

傳統(tǒng)VCI手術(shù)方案以大鼠為實驗對象,ACAS和BCAS的手術(shù)方案將實驗對象改為小鼠,使在該疾病的模式動物研究中有更多選擇,此外,這樣創(chuàng)新性的嘗試也有利于發(fā)現(xiàn)新的腦缺血缺氧后的病理損傷因素以及認(rèn)知功能障礙的影響因素。兩種手術(shù)方案的操作難度相似,ACAS手術(shù)方案以一側(cè)的Ameroid環(huán)代替BCAS手術(shù)方案中的金屬微線圈,二者都成功實現(xiàn)了頸總動脈血管逐漸閉塞的效果,可開展小鼠血管性癡呆的相關(guān)機(jī)制研究。BCAS模型的成功建立了晚期的皮質(zhì)下缺血性血管性癡呆,但是無出現(xiàn)皮質(zhì)下VCI如認(rèn)知障礙和記憶力減退等表型。ACAS動物表現(xiàn)出明顯認(rèn)知記憶障礙、執(zhí)行功能障礙和運動功能障礙,但ACAS小鼠無微血管病變,這與大多數(shù)人類VCI發(fā)病機(jī)制存在差異。

4 結(jié)合研究目標(biāo)選擇最優(yōu)手術(shù)方案

本文歸納總結(jié)以上幾種手術(shù)方案的特點(表1)及優(yōu)缺點(表2)如下:

表1 常見血管性認(rèn)知障礙動物模型對比Table 1 Comparison of common animal models of vascular cognitive impairment

表2 常見血管性認(rèn)知障礙動物模型優(yōu)缺點比較Table 2 Summary of advantages and disadvantages of common animal models of vascular cognitive impairment

4.1 4-VO法及其改良模型

4-VO以及第一種改良4-VO模型是通過4血管閉塞(雙側(cè)椎動脈以及雙側(cè)頸總動脈)而后再灌注血液成功建模。一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要病理生理學(xué)機(jī)制之一[60],有研究表明在4-VO術(shù)后大鼠出現(xiàn)如肝功能異常、糖尿病等代謝性疾病[61-62],因此在研究VCI與缺血再灌注損傷相關(guān)的機(jī)制以及VCI與糖尿病相關(guān)的研究可以優(yōu)先考慮4-VO法。三種4-VO法對應(yīng)的腦損傷部位存在一定差異,4-VO法腦損傷包含了新皮質(zhì)以及紋狀體,第1種改良版的4-VO法腦損傷包含了白質(zhì)和丘腦的損傷,第2種改良版4-VO法損傷包含了皮質(zhì),故在此提示研究者在進(jìn)行VCI的機(jī)制研究以及藥物治療研究過程中針對損傷部位的不同而對應(yīng)優(yōu)選方案。

4.2 2-VO法及其改良模型

2-VO法及其改良模型的機(jī)制為腦部缺血性壞死,2-VO術(shù)后動物還存在灰質(zhì)損傷,這也是2-VO手術(shù)相對改良版2-VO存在的優(yōu)勢。所示改良版2-VO手術(shù)的優(yōu)點是明顯降低術(shù)后動物的死亡率。以上提示,對于單純性缺血性腦損傷(無缺血再灌注)可以優(yōu)先考慮2-VO手術(shù)方案進(jìn)行建模,若相關(guān)研究涉及灰質(zhì)損傷則優(yōu)選2-VO法,若研究僅涉及海馬和白質(zhì),出于術(shù)后存活率的考慮,則優(yōu)選改良版2-VO法進(jìn)行手術(shù)建模。

4.3 mCCAO法

mCCAO的發(fā)病機(jī)制為腦部缺血性壞死,腦損傷部位包含海馬和白質(zhì)損傷,該手術(shù)方案的優(yōu)勢在于可以對于腦缺血的程度進(jìn)行一定意義上的控制,然而在4~8周后動物的白質(zhì)損傷存在一定程度的自發(fā)逆轉(zhuǎn),故提示研究者選擇該方案時需考慮以上因素。

4.4 BCAS以及SCAS

C57BL/6品系小鼠的后交通動脈發(fā)育不良,這與大鼠的解剖結(jié)構(gòu)存在明顯差異,這也提示構(gòu)建小鼠VCI模型對于該疾病研究具有重要意義。BCAS和ACAS小鼠模型的發(fā)病機(jī)制為腦部缺血性壞死,BCAS模型術(shù)后小鼠出現(xiàn)感覺/運動缺陷(即皮質(zhì)下血管性癡呆的典型特征之一),ACAS滿足頸總動脈進(jìn)行逐漸進(jìn)行性的狹窄化,更符合人類VCI的發(fā)病過程。由此提示廣大研究者,尤其是對VCI的疾病的治療以及病程病理研究感興趣的學(xué)者,在經(jīng)費充足的前提下可優(yōu)先選擇ACAS和BCAS方案。

5 總結(jié)

嚙齒類動物的腦白質(zhì)較少,這與人類大腦的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出的明顯的差異性,該特點限制了動物模型在探索人類VCI疾病機(jī)制的應(yīng)用。VCI病因復(fù)雜,迄今還未有能夠完全復(fù)制人類VCI所有特征的動物模型出現(xiàn)。然而在此綜述的8種模型對于研究VCI疾病的發(fā)生發(fā)展以及藥物治療及預(yù)防都具有一定的積極意義,是現(xiàn)今應(yīng)用較為廣泛的VCI動物模型。以上動物模型針對模型構(gòu)建方法不同,實驗動物發(fā)生的病理損傷也存在差異,研究人員需根據(jù)研究目和需求謹(jǐn)慎選擇造模方法和手術(shù)方案,并在手術(shù)過程中注意避免感染、動物麻醉過度等現(xiàn)象,此外,動物倫理相關(guān)事項也需注意,在實驗觀察終點對需實驗動物進(jìn)行安樂死。