王巖航，葉效明#，姚 璐，孫成宏，姚景春，屠鵬飛，張貴民*，曾克武*

淫羊藿苷元治療血小板減少癥的靶點(diǎn)鑒定及作用機(jī)制研究

王巖航1，葉效明1#，姚 璐1，孫成宏2，姚景春2，屠鵬飛1，張貴民2*，曾克武1*

1. 北京大學(xué) 天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191 2. 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

探索淫羊藿苷元治療血小板減少癥的直接作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制。從BALB/c小鼠股骨中分離得到原代骨髓細(xì)胞，利用鍵合淫羊藿苷元的瓊脂糖微球捕獲并鑒定靶點(diǎn)蛋白，使用表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)進(jìn)行靶點(diǎn)確證；采用Western blotting檢測(cè)淫羊藿苷元對(duì)胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、Hippo、細(xì)胞周期、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關(guān)蛋白的調(diào)控作用；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淫羊藿苷元對(duì)巨核細(xì)胞系分化的影響。共發(fā)現(xiàn)20個(gè)與造血干細(xì)胞增殖分化功能密切相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白，且淫羊藿苷元可能通過(guò)作用于泛素羧基末端酯酶L5（ubiquitin carboxyl-terminal esterase L5，UCHL5）、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8（tumor necrosis factor α-induced protein 8，TNFAIP8）、Visfatin靶點(diǎn)，進(jìn)而激活I(lǐng)RS1/Akt/mTOR/GSK3β和細(xì)胞周期通路，并抑制Hippo、JAK/STAT和NF-κB通路，最終促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化。淫羊藿苷元通過(guò)UCHL5、TNFAIP8、Visfatin等多靶點(diǎn)治療血小板減少癥。

血小板減少癥；淫羊藿苷元；靶點(diǎn)識(shí)別；信號(hào)通路；巨核細(xì)胞

血小板減少癥是指由于血小板的數(shù)量大量減少，造成凝血功能障礙，并以自發(fā)性出血為特征的臨床常見(jiàn)疾病[1]。血小板減少癥的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，一方面是血小板的自身生成不足，另一方面是免疫失調(diào)導(dǎo)致的血小板破壞過(guò)多所致[2]。目前尚無(wú)治療血小板減少癥的特效藥物。傳統(tǒng)中藥淫羊藿具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，臨床上常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、慢性再生障礙性貧血等疾病[3]。淫羊藿苷元為淫羊藿的重要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷元能夠顯著回調(diào)免疫性血小板減少性紫癜模型小鼠外周血的血小板數(shù)量，可有效抑制血小板減少[5]，但淫羊藿苷元治療血小板減少癥的具體作用靶點(diǎn)與機(jī)制仍不明確。因此，本研究利用淫羊藿苷元鍵合的固相瓊脂糖微球，從骨髓細(xì)胞裂解液中捕獲靶點(diǎn)蛋白并進(jìn)行高分辨質(zhì)譜鑒定，同時(shí)結(jié)合表面等離子共振技術(shù)（surface plamon resonace technology，SPR）確認(rèn)淫羊藿苷元的作用靶點(diǎn)；此外對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)下游的胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、Hippo、細(xì)胞周期、Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，旨在從靶點(diǎn)源頭上揭示淫羊藿苷元治療血小板減少癥的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠20只，6～7周齡，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房，溫度25 ℃，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號(hào)SCXK（京）2016-0010]。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿苷元（批號(hào)170602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購(gòu)自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1；瓊脂糖環(huán)氧微球（批號(hào)17-0480-01）購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；人源泛素羧基末端酯酶L5（ubiquitin carboxyl-terminal esterase L5，UCHL5）蛋白購(gòu)自美國(guó)ProSpec公司；人源腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8（tumor necrosis factor α-induced protein 8，TNFAIP8）蛋白購(gòu)自中國(guó)北京義翹神州科技有限公司；人源Visfatin蛋白購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；mTOR抗體（批號(hào)ab134903）購(gòu)自北京百諾威生物科技有限公司；磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體（批號(hào)5536）、p-Akt抗體（批號(hào)3348）、IRS1抗體（批號(hào)3407）、GSK3β抗體（批號(hào)5676）、磷酸化Yes相關(guān)蛋白1（phosphorylated yes-associated protein 1，p-YAP1）抗體（批號(hào)13008）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)8884）、JAK2抗體（批號(hào)3230S）、STAT3抗體（批號(hào)12640S）、NF-κB抗體（批號(hào)8242S）、p-NF-κB抗體（批號(hào)3033S）、NF-κB抑制因子α（NF-κB inhibitor α，IκBα）抗體（批號(hào)4814T）、p-IκBα抗體（批號(hào)2859T）、兔二抗（批號(hào)7074）、鼠二抗（批號(hào)7076S）購(gòu)自美國(guó)CST公司；Akt抗體（批號(hào)BS1502）、p-GSK3β抗體（批號(hào)BS94042）、Cyclin B1抗體（批號(hào)BS1392）、YAP1抗體（批號(hào)BS1701）、哺乳動(dòng)物體20樣激酶1（mammalian sterile-20-like 1，MST1）抗體（批號(hào)BS71058）、大抑癌基因1（large tumor suppressor 1，LATS1）抗體（批號(hào)ab243656）、p-JAK2抗體（批號(hào)BS4837）、p-STAT3抗體（批號(hào)AP0274）購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司；Cyclin D1抗體（批號(hào)bs-0623R）購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體（批號(hào)60008-1-Ig）購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；流式細(xì)胞術(shù)蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司；Hippo通路抑制劑XMU-MP-1（批號(hào)HY-100526）、IRS1/Akt/mTOR/GSK3β通路抑制劑MK-2206（批號(hào)HY-10358）、NF-κB通路抑制劑Bay11-7082（批號(hào)HY-13453）購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；JAK/STAT通路抑制劑AZD-1480（批號(hào)S2162）購(gòu)自上海藍(lán)木化工有限公司。

圖1 淫羊藿苷元結(jié)構(gòu)式

1.3 儀器

LTQ-Orbitrap質(zhì)譜（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Biacore 8K等離子表面共振儀、CM5氨基偶聯(lián)芯片（美國(guó)Biacore公司）；Calibur2流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences公司）。

2 方法

2.1 骨髓細(xì)胞的提取與培養(yǎng)

BALB/c小鼠脫頸椎處死后取股骨，用PBS溶液沖出骨髓，離心后棄去上清，加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，離心后棄去上清，得到原代骨髓細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞接種于6孔板中，用含1%青霉素-鏈霉素混合溶液、10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后更換培養(yǎng)基。

2.2 淫羊藿苷元鍵合的瓊脂糖環(huán)氧微球的制備

將未鍵合的瓊脂糖環(huán)氧微球和淫羊藿苷元（500 μmol/L）在堿性緩沖條件（pH 8）下孵育12 h，以PBS溶液洗滌鍵合后的微球5次[6]。

2.3 淫羊藿苷元的靶點(diǎn)蛋白鑒定

用含1%蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心后取上清。分別用鍵合了淫羊藿苷元的固相微球和未鍵合的固相微球與等量且等質(zhì)量濃度蛋白溶液孵育過(guò)夜，對(duì)微球捕獲的蛋白樣品用nanoLC-LTQ-Orbitrap MS/MS進(jìn)行分析：RP-C18AQ毛細(xì)管液相色譜柱（15 cm×100 μm，美國(guó)Michrom Bioresources公司）；正離子模式；進(jìn)樣量為1 μL；掃描分辨率為FWMH 60 000；噴霧電壓為1.8 kV；全掃描范圍為/350～2000；體積流量為300 nL/min。數(shù)據(jù)處理采用Thermo Proteome Discoverer v.1.4.1.14。

2.4 SPR鑒定淫羊藿苷元與靶點(diǎn)蛋白互作

分別取100 μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-(3-dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]和100 μL-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS）對(duì)8通道CM5氨基偶聯(lián)的蛋白芯片進(jìn)行活化，將蛋白用PBS溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，并連接到CM5芯片，直至響應(yīng)值達(dá)到10 000。將淫羊藿苷元母液稀釋為0.78～50.00 μmol/L的溶液，分別與UCHL5、TNFAIP8、Visfatin蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析和親和力測(cè)試。

2.5 靶點(diǎn)通路富集分析

選擇質(zhì)譜結(jié)果中結(jié)合組的響應(yīng)值與空白組的響應(yīng)值比值大于1.5的蛋白質(zhì)，利用Cytoscape version 3.6.0軟件中的ClueGO程序選擇Medium Network Specificity進(jìn)行基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，種屬選擇為Mus Musculus [10090]。

2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

設(shè)置對(duì)照組和淫羊藿苷元（5、10、20 μmol/L）組，各給藥組加入相應(yīng)藥物，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。骨髓細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，加入含1%蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液，于冰上孵育30 min，12 000 r/min離心20 min，取上清液，加入6×Protein loading buffer，98 ℃加熱10 min。蛋白樣品經(jīng)8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉30 min，分別加入IRS1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-GSK3β、GSK3β、MST1、LATS1、p-YAP1、YAP1、Cyclin B1、Cyclin D1、p-IκBα、IκBα、p-NF-κB、NF-κB、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、GAPDH和β-actin抗體，室溫孵育2 h；加入二抗，孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，采用Tanon-5200 Multi系統(tǒng)成像，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨核細(xì)胞的分化

設(shè)置對(duì)照組、淫羊藿苷元（10 μmol/L）、XMU-MP-1（1 μmol/L）、MK-2206（1 μmol/L）、Bay11-7082（1 μmol/L）和AZD-1480（1 μmol/L）組，除對(duì)照組外，其余各組加入淫羊藿苷元（10 μmol/L），各抑制劑組再加入相應(yīng)抑制劑，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。骨髓細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的含10%胎牛血清的PBS溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液至1×106/mL；加入CD41、CD117、Lineage抗體，同時(shí)加入7-AAD以排除死細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，以PBS溶液清洗細(xì)胞后，2000 r/min離心3 min，然后重懸于預(yù)冷的含10%胎牛血清的PBS溶液中。將細(xì)胞避光保存于冰上，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，Lineage陰性、CD41陽(yáng)性、CD117陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是巨核細(xì)胞[7]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 淫羊藿苷元作用靶點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)及作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

為了探索淫羊藿苷元的作用靶點(diǎn)，采用LC-MS的方法對(duì)鍵合有淫羊藿苷元的瓊脂糖微球富集到的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明UCHL5、TNFAIP8、Visfatin、ESD、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶K1（glutathione-transferase κ1，GSTK1）、SUMO活化酶E1（SUMO-activating enzyme E1，SAE1）、蛋白酪氨酸磷酸酶-α（protein tyrosine phosphatase-α，PTP-α）、蛋白二硫化物異構(gòu)酶A6（protein disulfide-isomerase A6，PDIA6）可能是淫羊藿苷元的潛在作用靶點(diǎn)。研究表明，UCHL5主要參與細(xì)胞內(nèi)的代謝[8]，TNFAIP8參與調(diào)控細(xì)胞周期[9]，ESD和Visfatin參與免疫功能調(diào)控[10-11]，GSTK1發(fā)揮抗氧化作用[12]，SAE1參與蛋白質(zhì)的降解[13]，PTP-α和PDIA6參與信號(hào)傳遞[14-15]。

對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)到的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集，如圖2所示，靶點(diǎn)功能主要集中于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、嘧啶代謝、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA合成以及蛋白降解，此外還有部分靶點(diǎn)參與了免疫調(diào)節(jié)[12-13]。表明淫羊藿苷元可能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、增強(qiáng)細(xì)胞代謝、促進(jìn)細(xì)胞周期以及免疫調(diào)節(jié)等功能，從而治療血小板減少癥。

3.2 淫羊藿苷元與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合作用確證

為了進(jìn)一步確證淫羊藿苷元與不同靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力，本研究采用SPR技術(shù)分析了淫羊藿苷元與靶點(diǎn)蛋白的解離常數(shù)（D），主要選取了3個(gè)具有代表性功能的靶點(diǎn)蛋白，分別是與細(xì)胞代謝相關(guān)的UCHL5、與細(xì)胞周期相關(guān)的TNFAIP8以及與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的Visfatin。如圖3所示，淫羊藿苷元與UCHL5的D為8.72×10?6mol/L，為強(qiáng)結(jié)合；淫羊藿苷元與TNFAIP8的D為9.99×10?6mol/L，為強(qiáng)結(jié)合；淫羊藿苷元與Visfatin的D為5.64×10?5mol/L，為中等強(qiáng)度結(jié)合。由此判斷，淫羊藿苷元與UCHL5、TNFAIP8、Visfatin等靶點(diǎn)的結(jié)合存在特異性，因此UCHL5、TNFAIP8、Visfatin可能是淫羊藿苷元發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

圖2 淫羊藿苷元的作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

圖3 淫羊藿苷元與UCHL5、TNFAIP8、Visfatin蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析

3.3 淫羊藿苷元對(duì)IRS1/Akt/mTOR/GSK3β信號(hào)通路的調(diào)控作用

UCHL5在干細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)程中具有重要的生物學(xué)意義，可以通過(guò)調(diào)控IRS1/Akt/mTOR/ GSK3β通路促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的糖脂代謝，進(jìn)而提高細(xì)胞的能量供應(yīng)，并為干細(xì)胞增殖分化提供動(dòng)力[8]。如圖4所示，淫羊藿苷元可以促進(jìn)骨髓細(xì)胞中IRS1蛋白表達(dá)，上調(diào)Akt的磷酸化，進(jìn)而增加mTOR和GSK3β的磷酸化水平（＜0.05、0.01），表明淫羊藿苷元能夠激活I(lǐng)RS1/Akt/mTOR/ GSK3β通路，促進(jìn)糖脂代謝的發(fā)生，進(jìn)而為造血干細(xì)胞的增殖分化提供能量，發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。

3.4 淫羊藿苷元對(duì)Hippo信號(hào)通路和細(xì)胞周期通路的調(diào)控作用

TNFAIP8可以通過(guò)抑制Hippo通路進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖分化[9]。如圖5所示，淫羊藿苷元能夠促進(jìn)骨髓細(xì)胞中Hippo通路上游MST1蛋白表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)下游LATS1蛋白表達(dá)，降低轉(zhuǎn)錄因子YAP1磷酸化水平并提高YAP1蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），提示淫羊藿苷元可能通過(guò)TNFAIP8發(fā)揮抑制Hippo信號(hào)通路的作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖分化基因的表達(dá)，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。

TNFAIP8能夠促進(jìn)Cyclin系列細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞周期通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。如圖6所示，淫羊藿苷元能夠上調(diào)骨髓細(xì)胞中Cyclin B1和Cyclin D1細(xì)胞周期蛋白表達(dá)（＜0.01），表明淫羊藿苷元可以通過(guò)TNFAIP8激活Cyclin B1/Cyclin D1細(xì)胞周期通路，促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖5～8同

圖5 淫羊藿苷元能夠激活原代細(xì)胞中的Hippo信號(hào)通路

圖6 淫羊藿苷元能夠激活原代骨髓細(xì)胞中的Cyclin B1/Cyclin D1信號(hào)通路

3.5 淫羊藿苷元對(duì)NF-κB和JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)控作用

免疫性血小板減少癥是自身免疫介導(dǎo)的血小板破壞和血小板生成缺陷的一類疾病。因此，可以通過(guò)抑制炎癥相關(guān)通路的激活進(jìn)而減少免疫介導(dǎo)的血小板破壞和生成缺陷，從而治療血小板減少癥。Visfatin可通過(guò)JAK/STAT和NF-κB通路調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活動(dòng)[11]，因而推測(cè)淫羊藿苷元可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中JAK/STAT和NF-κB通路的功能，發(fā)揮治療免疫性血小板減少癥的作用。如圖7所示，淫羊藿苷元能夠下調(diào)IκBα以及NF-κB的磷酸化水平（＜0.05），表明淫羊藿苷元通過(guò)Visfatin抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少免疫介導(dǎo)的血小板破壞和生成缺陷，發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。

JAK/STAT通路與免疫應(yīng)答密切相關(guān)，如圖8所示，淫羊藿苷元明顯抑制JAK2以及STAT3蛋白表達(dá)，并下調(diào)其磷酸化水平（＜0.05），表明淫羊藿苷元通過(guò)Visfatin抑制了JAK/STAT相關(guān)信號(hào)通路的激活，阻斷免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮治療血小板減少癥的作用。

圖7 淫羊藿苷元能夠激活原代骨髓細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路

圖8 淫羊藿苷元能夠激活原代骨髓細(xì)胞中的JAK/STAT信號(hào)通路

3.6 基于流式細(xì)胞術(shù)探索淫羊藿苷元促進(jìn)血小板形成的作用機(jī)制

為了進(jìn)一步探索淫羊藿苷元抑制血小板減少癥的作用機(jī)制，本研究分別使用IRS1/Akt/mTOR/ GSK3β、Hippo、NF-κB、JAK/STAT信號(hào)通路的抑制劑對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。如圖9所示，淫羊藿苷元能夠增加骨髓細(xì)胞中CD41單陽(yáng)的巨核細(xì)胞比例（＜0.01），表明淫羊藿苷元能夠直接促進(jìn)巨核細(xì)胞的分化進(jìn)而促進(jìn)血小板形成；Hippo通路抑制劑XMU-MP-1、NF-κB通路抑制劑Bay11-7082和JAK/STAT通路抑制劑AZD-1480與淫羊藿苷元同時(shí)使用時(shí)，不具有顯著的協(xié)同增效作用；而IRS1/Akt/mTOR/GSK3β通路抑制劑MK-2206有效逆轉(zhuǎn)了淫羊藿苷元促進(jìn)巨核細(xì)胞分化的作用（＜0.01），表明淫羊藿苷元可能主要通過(guò)激活I(lǐng)RS1/Akt/mTOR/GSK3β通路實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血小板形成的作用，而對(duì)Hippo、NF-κB、JAK/STAT等通路則表現(xiàn)出潛在的抑制作用。

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與淫羊藿苷元組比較：##P＜0.01

4 討論

本研究結(jié)果表明，淫羊藿苷元通過(guò)作用于UCHL5、TNFAIP8、Visfatin靶點(diǎn)，進(jìn)而激活I(lǐng)RS1/Akt/mTOR/GSK3β和細(xì)胞周期通路并抑制Hippo、JAK/STAT和NF-κB等通路，發(fā)揮促進(jìn)巨核細(xì)胞分化并治療血小板減少癥的潛在作用。表明淫羊藿苷元不僅具有減少血小板免疫破壞的作用，還能夠增強(qiáng)血小板的生成，即淫羊藿苷元可以從多角度治療血小板減少癥。

基于固相微球的藥物靶點(diǎn)捕獲與鑒定技術(shù)利用藥物分子與靶點(diǎn)蛋白之間存在相互作用的特性，廣泛用于藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；而基于生物信息學(xué)的靶點(diǎn)蛋白分析方法是依據(jù)藥物小分子調(diào)控的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，首先明確小分子的功能，進(jìn)一步根據(jù)小分子的功能尋找對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白。為了快速有效地篩選到淫羊藿苷元的靶點(diǎn)蛋白，本研究首先根據(jù)結(jié)合組與競(jìng)爭(zhēng)組的蛋白響應(yīng)值進(jìn)行初步篩選，進(jìn)而根據(jù)蛋白功能利用KEGG通路富集方法對(duì)初步篩選的蛋白進(jìn)行分類，明確淫羊藿苷元的主要作用信號(hào)通路，并基于此進(jìn)一步尋找通路上游的蛋白，進(jìn)行SPR互作分析驗(yàn)證。除本研究關(guān)注的UCHL5、TNFAIP8、Visfatin等靶點(diǎn)，其他功能靶點(diǎn)也可能參與了淫羊藿苷元的藥理作用。氧化應(yīng)激是制約細(xì)胞增殖的重要因素，過(guò)度氧化應(yīng)激可誘發(fā)細(xì)胞衰老及DNA損傷，GSTK1蛋白主要發(fā)揮抗氧化作用，因此淫羊藿苷元也可能通過(guò)GSTK1蛋白調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)對(duì)血小板及其前體細(xì)胞分化發(fā)揮作用；SAE1是參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵蛋白，淫羊藿苷元同樣可能通過(guò)結(jié)合SAE1進(jìn)而促進(jìn)與炎性反應(yīng)相關(guān)蛋白的降解，保護(hù)血小板免受免疫介導(dǎo)的損傷。由此可見(jiàn)，淫羊藿苷元能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路治療血小板減少癥。

綜上所述，本研究初步闡明了淫羊藿苷元治療血小板減少癥的可能作用靶點(diǎn)與作用機(jī)制，為今后淫羊藿苷元的臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)于治療血小板減少癥的創(chuàng)新藥物研發(fā)也具有重要的參考意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Target identification and mechanism research on inhibiting thrombocytopenia of icaritin

WANG Yan-hang1, YE Xiao-ming1, YAO Lu1, SUN Cheng-hong2, YAO Jing-chun2, TU Peng-fei1, ZHANG Gui-min2, ZENG Ke-wu1

1. State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China 2. State Key Laboratory of Generic Manufacture Technology of Chinese Traditional Medicine, Lunan Pharmaceutical Group Corporation, Linyi 276006, China

To explore the direct target and mechanism of icaritin on treatment of thrombocytopenia.Primary bone marrow cells were isolated from BALB/c mice. Target proteins were captured and identified by icaritin-binding agarose and further confirmed with surface plasmon resonance (SPR). Western blotting was used to detect the regulation of icaritin on insulin receptor substrate 1 (IRS1)/protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR)/glycogen synthase kinase 3β (GSK3β), Hippo, cell cycle, Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) and nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathways related proteins. The effect of icaritin on differentiation of megakaryocytes was clarified by flow cytometry.A total of 20 target proteins associated to proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells were found. In addition, icaritin activated IRS1/Akt/mTOR/GSK3β, cell cycle signaling pathways, inhibited Hippo, JAK/STAT and NF-κB signaling pathways through potentially interacting with ubiquitin carboxyl-terminal esterase L5 (UCHL5), tumor necrosis factor α-induced protein 8 (TNFAIP8) and Visfatin to promote the differentiation of megakaryocytes.Icaritin treats thrombocytopenia through interacting with multiple target proteins including UCHL5, TNFAIP8, and Visfatin.

thrombocytopenia; icaritin; target identification; signaling pathway; megakaryocyte

R285.5

A

0253 - 2670(2021)17 - 5250 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.017

2021-06-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973505）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81773932）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1702400，2019YFC1708902）

王巖航（1995—），博士，研究方向?yàn)橹兴幾饔冒悬c(diǎn)及藥理機(jī)制。E-mail: 2011110102@pku.edu.cn

曾克武，沈陽(yáng)藥科大學(xué)66期藥學(xué)（日語(yǔ)）專業(yè)校友，研究員，博士生導(dǎo)師，教育部青年長(zhǎng)江學(xué)者，研究方向?yàn)橹兴幾饔冒悬c(diǎn)及藥理機(jī)制。Tel: (010)82802859 E-mail: ZKW@bjmu.edu.cn

張貴民，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾滤庨_(kāi)發(fā)與制劑研究。E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

#共同第一作者：葉效明（1997—），碩士，研究方向?yàn)橹兴幾饔冒悬c(diǎn)及藥理機(jī)制。E-mail: yexiaoming@pku.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]