周麗慧, 肖小華, 李攻科

(中山大學化學學院, 廣東 廣州 510275)

干果類食品,包括堅果、果干和果脯等,來源廣泛,種類多樣,具有良好的口感和營養(yǎng)價值,易于儲存和攜帶[1],深受國內外消費者的喜愛。但干果在果實生產、食品加工與儲存運輸等各個環(huán)節(jié)容易產生或帶入各種有害物質,包括生產環(huán)境中農藥和重金屬等有害物質的使用和遷移累積[2,3],食品加工過程中各種添加劑的過量或違規(guī)使用[4],儲存過程中因霉變等因素帶來的霉菌毒素滋長[5,6]以及產品自身的致敏源等。消費者食用含有各種有害物質的干果食品容易出現安全問題,如農藥殘留會干擾內分泌,引起中毒,甚至致癌、致突和致畸[7,8];重金屬元素可通過降水、塵埃沉降和人類活動等方式進入土壤,并通過食物鏈遷移到人體,對人類健康構成直接或間接的威脅[9-12]。葡萄干比其他干果特別是帶殼的干果更容易被霉菌毒素污染[13,14],此外,多種霉菌毒素還可能產生協同/累加作用,損傷肝臟和免疫系統(tǒng)[15];食品添加劑主要包括各類防腐劑、甜味劑、著色劑等,超量使用會引發(fā)致畸、致癌、中毒等風險[16,17]。過敏性疾病已成為全球第六大疾病,致敏源可導致食物過敏[18]。

干果類食品基質復雜,有害物質種類多,結構和性質差異大,含量低,其分析檢測需要有快速高效的樣品前處理技術和準確靈敏的分析檢測方法。干果果肉的低含水率會阻礙萃取溶劑滲透,其較高含糖量也容易產生包覆現象,使農殘等分析物溶解不完全而萃取效率低;色素、有機酸等雜質的干擾也會影響樣品分析的準確度和靈敏度。近年來干果類食品中常用的樣品前處理方法有微波輔助萃取法(MAE)[19]、超聲波輔助萃取法(UAE)[20]等場輔助方法,固相(微)萃取法(SP(M)E)[21-23]、分散固相萃取法(DSPE)[24]、(分散)液液微萃取法(DLLME)等相分離法,以及衍生化方法等;干果類食品有害物質分析以色譜法[25-27]等實驗室檢測方法為主,一些快檢技術[28,29]也引起了廣泛研究。表1總結了干果中常見有害物質的種類、名稱、限量標準和分析檢測技術。本文綜述了干果類食品有害物質的樣品前處理方法和分析檢測研究進展。

表1 干果類食品中有害物質的種類、名稱、限量標準和分析檢測方法

1 干果類食品樣品前處理方法

干果類食品前處理方法包括場輔助前處理方法、相分離前處理方法及衍生化前處理方法。表2概括了干果食品分析中的不同樣品前處理方法的優(yōu)缺點。

表2 干果類食品樣品前處理方法及其優(yōu)缺點

1.1 場輔助樣品前處理法

場輔助萃取法主要包括超聲波輔助萃取法(UAE)和微波輔助萃取法(MAE)等,在干果中添加劑和農藥殘留檢測方面應用較多。UAE通常使用乙醇水溶液、氫氧化鈉溶液作為溶劑,用于萃取果脯中的羅丹明B[46]和亞硫酸鹽[54],可有效降低果膠和多糖干擾,提高檢測靈敏度。UAE操作簡單方便,常用于樣品中微量分析物的快速萃取,也可以通過循環(huán)提取或連續(xù)提取等方式處理大量的樣品。MAE通過微波作用強化傳熱和傳質效率,提高萃取性能,與傳統(tǒng)浸漬提取和索式抽提法相比,具有快速高效、環(huán)境友好等特點[55]。MAE已應用于干果中多酚類化合物等有效成分的萃取分離[47],萃取效率受萃取劑、萃取溫度和萃取時間的影響較大。經優(yōu)化后的MAE與其他萃取方法相比,其萃取效率可提高8.4%～34.8%,且能耗更低。

超聲波、微波等場作用可與各種相分離方法,如SPE、SPME等結合,進一步提高或者改善其萃取分離效率。陳正毅等[56]以水為溶劑超聲波輔助萃取干果中的糖精鈉后,SPE對其進行凈化富集,結合表面增強拉曼光譜(SERS)分析,方法檢出限為0.6 g/kg,靈敏度高，雜質干擾小。

1.2 相分離樣品前處理法

1.2.1固相萃取法

SPE常用來提取瓜子、果脯蜜餞、葡萄干等食品中的添加劑[48]和農殘[57],也是目前食品中霉菌毒素[58]的主要前處理方法。SPE主要以C18為填料,石油醚、丙酮為萃取溶劑,常用洗脫液是乙腈、甲醇和乙醇與水的混合溶液。

SPE可同時完成樣品富集和凈化,提高檢測靈敏度,它與液相色譜在線聯用可實現自動化并簡化分離步驟,減少樣品損耗,特別適用于常規(guī)分析大量樣品,在食品、環(huán)境等領域應用越來越廣。Campone等[59]將加壓液體萃取與SPE結合,開發(fā)出一種在線樣品前處理裝置,用于分析干果中的黃曲霉毒素。該裝置可同時進行富集和凈化,與色譜等分析技術聯用后,整個分析過程可實現完全自動化,簡化了樣品處理步驟,實現了高通量分析，并取得了高度精確的結果。

1.2.2固相微萃取法

SPME集萃取、濃縮于一體,可大大加快樣品分離分析的效率。但傳統(tǒng)SPME存在萃取纖維易斷裂、涂層剝離和記憶效應等缺點,為此開發(fā)出了一些新材料用于固相微萃取。Es’haghi等[60]通過溶膠-凝膠法制備碳納米管溶膠纖維,使用中空纖維固相微萃取技術(HF-SPME)萃取、預富集花生樣品中黃曲霉毒素B1(AFB1)和黃曲霉毒素B2(AFB2),具有很高的富集因子和良好的選擇性。

管內SPME采用內表面涂層的開口管狀熔融石英毛細管作為SPME器件,易與LC-MS在線耦合,萃取過程自動化,減少了分析時間,比手動/離線技術提供了更好的精密度、準確度和靈敏度。采用自動管內固相微萃取法萃取干果中真菌毒素時,樣品無需處理,可直接將GC毛細管柱用作管內SPME裝置,并將其放置在自動進樣器的進樣環(huán)和進樣針之間,從而實現在線分離[61],可成為食品中真菌毒素監(jiān)測的有力工具。

頂空固相微萃取法(HS-SPME)適合揮發(fā)性成分如呋喃類物質的分離富集,可有效減少基體中干擾物質的影響[49]。萃取前向樣品溶液中加入NaCl可降低樣品中有機分析物的溶解度,增加樣品基體與涂層吸附劑之間的吸附作用,提高萃取效率。

1.2.3分散固相萃取法

DSPE操作簡單快速,成本低,分析范圍廣,但容易受基體效應干擾,難以達到高通量分析的要求。當以聚酰胺為吸附劑,乙醇-氨溶液(8∶2，v/v)為洗脫溶劑時,可有效去除無機鹽和有機化合物對樣品中著色劑的分析干擾[62]。由于傳統(tǒng)吸附劑如丙基乙二胺(PSA)和C18選擇性不強、效率有限,近年來一些碳材料,包括碳納米管(CNTs)、活性炭纖維(ACFS)受到了關注。Singh等[50]使用鎳納米粒子和碳納米纖維分散的活性炭纖維(Ni-ACF/CNF)作為吸附劑凈化脂肪基質中的農藥殘留。結果表明,結晶碳和無定形碳的Ni-ACF/CNF組合可更好地清除脂肪酸基質,吸附效率比PSA和C18高。磁性納米顆粒(MNPs)廣泛用于食物、環(huán)境中微痕量污染物的磁分離富集。Karami-Osboo等[63]開發(fā)了一種分散磁性固相萃取技術,使用Fe3O4MNPs去除雜質,使用微升級的氯仿萃取堅果中黃曲霉毒素,萃取效率高,操作方便。

QuEChERS法是農藥殘留和真菌毒素分析中常用的樣品前處理方法。采用QuEChERS法萃取堅果中的農藥殘留時,使用乙腈作為萃取溶劑可有效去除脂肪、蛋白質等雜質的影響,萃取效率高[64]。但糖在乙腈中具有很高的溶解度并存在基質干擾,此法不適合含糖量高的樣品。對QuECHERS進行自動多塞過濾清除(multi-plug filtration cleanup, m-PFC)改進,可減少手動操作,精確控制推拉循環(huán)的體積和速度[65]。m-PFC將多壁碳納米管(MWCNT)與其他吸附劑和無水硫酸鎂混合在一起,填充并萃取,不需要額外的渦旋或離心步驟即可同時富集干果中的多種農藥殘留。以鋯為基礎的改性硅膠吸附劑Z-Sep可起路易斯酸的作用,與電子供體相互作用;C18通過烷基鏈的疏水作用與甘油三酯相互作用,可有效去除脂肪。將Z-Sep與C18混合使用時可有效消除干擾,高效富集干果食品中的16種真菌毒素[66]。此外,將QuEChERS法與其他樣品前處理方法如DLLME結合使用,分析物回收率得到顯著改善[67]。

1.2.4(分散)液-液微萃取法

液-液萃取法(LLE)是經典的樣品前處理方法,但需要消耗大量有機溶劑,LLME和DLLME是基于LLE原理發(fā)展起來的,用于處理痕量組分的前處理技術[51]。Karami-Osboo[52]將Fe3O4納米粒子作為膠體懸浮劑發(fā)展了一種納米流體空氣輔助分散液-液微萃取方法,只使用少量有機溶劑和納米顆粒,即可完成葡萄干樣品中曲霉毒素A的高效分離富集。超分子溶劑等新型溶劑在微萃取中的應用越來越多,Caballero-Casero等[68]以癸酸/四丁基葵酸銨囊泡作為超分子溶劑,提出了一種無溶劑微萃取方法,用于分離干果果實中的赭曲霉毒素A,該方法不需要稀釋及凈化步驟,基體干擾少,效率高。

1.3 衍生化樣品前處理法

衍生化法是一種采用衍生反應把分析物轉化成結構類似物的化學轉換樣品前處理方法?；瘜W衍生法是衍生化的一種重要方法,其借助化學反應將分析物接上某種特定基團,從而改善其分離效果和檢測靈敏度。Yu等[53]將甜蜜素鈉與次氯酸鈉反應轉化為N,N-二氯環(huán)己胺,利用其較強的電負性,使用氣相色譜-電子捕獲檢測器進行測定。該方法樣品制備簡單,衍生產物穩(wěn)定性高,選擇性好,甜蜜素的定量不受基體效應的影響。Robbins等[69]使用甲醛溶液將亞硫酸鹽轉化為羥甲基磺酸鹽(HMS),然后用C18SPE柱去除親脂性化合物,并使用親水相互作用色譜柱將HMS與其他基質組分分離,建立了高效靈敏的LC-MS/MS方法。

2 干果類食品中有害物質的分析檢測

食品中的有害物質檢測方法一般包括實驗室檢測和快速檢測兩類,其中實驗室檢測通過使用色譜、原子吸收光譜(AAS)等一系列精密儀器來分析目標組分,具有準確、靈敏度高、檢出限低、能夠定性定量分析的優(yōu)勢,但存在前處理過程較復雜、分析時間長、儀器昂貴、操作難度大等不足?？焖贆z測方法具有檢測時間短、操作簡單、價格便宜等優(yōu)勢,但其檢出限較高、靈敏度較低,主要起到半定量檢測和初篩作用。下文總結了近年來干果類食品中的分析檢測方法。

2.1 實驗室檢測方法

2.1.1色譜法

HPLC廣泛用于干果中甜味劑[70]、防腐劑[71]以及呋喃化合物[51]等的分析檢測,是食品中著色劑分析的標準方法[72]。Geng等[73]對HPLC的熒光檢測器進行改進,設計了一種新型紫外發(fā)光二極管誘導熒光檢測器(LED-IF),用于分析食品中的黃曲霉毒素。該檢測器使用普通紫外LED作為激發(fā)光源,采用光電放大器代替光電倍增管進行熒光檢測,實現了與傳統(tǒng)Xe燈為激發(fā)光源的熒光檢測相同的靈敏度,大大降低了成本。

GC常用于干果中有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯類、氨基甲酸酯類農藥殘留[74]以及甜味劑[75]的檢測。Yu等[53]將甜蜜素衍生后用氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)分析,果脯中防腐劑、工業(yè)染料等其他食品添加劑干擾小,方法檢出限為0.25 mg/kg。

將樣品前處理技術與LC-MS結合,可以減少樣品處理時間和溶劑消耗,實現高通量分析。LC-MS常被用來定性、定量分析干果中的農藥殘留[76]、漂白防腐劑[69]、合成染料[77]、真菌毒素[78]和致敏源[79,80]。Alsharif等[81]建立了干果、堅果等120種食品中霉菌毒素的QuEChERS-LC-MS/MS方法。他們應用單變量-多變量組合的化學計量學方法優(yōu)化分析方法,縮短了分析時間,提高了電離效率,方法的回收率為81.94%～101.67%。

2.1.2原子光譜法

AAS和原子熒光光譜法(AFS)是現今在食品、環(huán)境中重金屬檢測應用最廣泛的分析方法。尤其是AFS,靈敏度高,檢出限比AAS低,基體效應小,線性范圍寬,譜線簡單且干擾小[83],但僅能分析砷、硒、鉛、錫、汞等元素。電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)中心氣化溫度高可以使樣品充分氣化,準確度高,可以實現連續(xù)快速多元素測定[84]。

2.1.3無機質譜法

2.1.4電化學分析法

電化學分析在著色劑和工業(yè)染料的檢測中得到了廣泛應用。電化學測定羅丹明B一般是測定苯環(huán)C=N基團的氧化信號,因此電極是影響分析性能的關鍵步驟。方波溶出伏安法(SWSV)是一種快速、高靈敏度和高效能的電化學分析方法。Zhang等[90]用氧化硅柱狀磷酸鋯/全氟磺酸復合材料(SPZP/NAF)修飾的玻碳電極測定羅丹明B, SPZP具有層狀結構和較大的比表面積,表現出高的電催化活性。該電化學傳感器的線性響應范圍為0.01～5.0 μmol/L,檢出限低至4.3 nmol/L,穩(wěn)定性好。Yi等[62]結合DSPE和場放大進樣-毛細管電泳-電容耦合非接觸電導檢測,建立了果脯樣品中合成著色劑的高靈敏度分析方法,5種常見食用色素的檢出限為0.035～0.055 mg/kg。部分實驗室檢測方法如表3所示。

表3 干果中有害物質實驗室檢測方法

2.2 快速檢測方法

2.2.1分子光譜法

常見SO2快速檢測方法是鹽酸副玫瑰苯胺分光光度法,但此法中四氯化汞有劇毒,會對人體和環(huán)境造成一定的傷害[96],目前鹽酸副玫瑰苯胺法已停止使用[97],替換方法為碘滴定法。

熒光分析法(FL)檢測靈敏度高,適用于干果中痕量真菌毒素的檢測。上轉化納米顆粒(UCNPs)具有獨特的反斯托克斯發(fā)射特性,可以有效避免生物樣品的背景干擾,消除假陽性信號,是制備熒光探針的優(yōu)良材料,也是生物樣品成像的理想發(fā)光納米材料。Wang等[98]設計了一種通過適體修飾上轉換納米顆粒(UCNPs-aptamer)與金納米顆粒構建的基于發(fā)光共振能量轉移的適體傳感器。該適體傳感器由UCNP-aptamer充當發(fā)光供體,GNPs充當能量受體,可以避免其他黃曲霉毒素信號的干擾,具有很強的特異性?；ㄉ鷺悠分蠥FB1的檢出限為0.17 ng/mL,與傳統(tǒng)的熒光測定法相比,該方法具有準確性高、靈敏度高、樣品消耗低的優(yōu)點。

SERS在真菌毒素[99]、甜味劑[100]和致敏源[101]檢測中也得到了越來越多的應用。Gezer等[102]基于可生物降解且能被金納米包覆的玉米蛋白設計了一種SERS傳感器,并建立了花生中Ara h1蛋白的檢查方法。通過Ara h1單克隆抗體對傳感器表面進行功能化,首次在可生物降解的金/鋅膜SERS平臺上檢測花生過敏原蛋白Ara h1。

圖1 基于協同效應和酶促可編程3D DNA納米花的電化學發(fā)光生物傳感器原理圖[103]Fig. 1 Schematic diagram of electrochemiluminescence bioaptasensor based on the universal synergistic effects and enzyme-driven programmable 3D DNA nanoflowers[103]

2.2.2生物免疫法

生物免疫法主要基于免疫識別、抗體標記以及核酸雜交等技術發(fā)展起來的具有特異性的快檢分析技術。在干果類食品中廣泛應用于真菌毒素[104]和致敏源[105,106]的檢測。

酶聯免疫測定法(ELISA)包括夾心型和競爭型免疫分析兩種形式,其中夾心型免疫測定法具有很高的靈敏度和特異性,但不適用于定量監(jiān)測小分子,在干果中致敏源檢測方面應用較多[107]。競爭型免疫測定法可以為小分子測定提供有利的形式,因為目標分析物可以通過其與標記半抗原/抗原競爭的能力進行監(jiān)測。在傳統(tǒng)的競爭型ELISA中,介導信號輸出的酶通常作為信號探針使用[108]。實時聚合酶鏈式反應法(real-time PCR)是基于DNA靶標的檢測方法,在熱處理過程中仍具有穩(wěn)定性,與商業(yè)ELISA測試相比,實時PCR特異性和靈敏性更高[109],但DNA的存在不能保證蛋白質的存在,可能會出現假陽性結果。

光電化學傳感是基于光電轉化特性發(fā)展起來的新型檢測技術,通過目標物與光電化學活性物質之間的相互作用或生物識別過程前后所引起的光電流(壓)的變化與待測物濃度之間的關系進行定量分析。因為傳統(tǒng)酶聯免疫分析中使用的天然酶具有價格相對昂貴、易受到外界因素影響而失活等缺點。Lin等[110]設計了一種無需生物酶參與的新型光電化學免疫傳感平臺,用于定量檢測食品中的AFB1。該工作利用銀納米粒子-標記AFB1-牛血清白蛋白(BSA)偶聯物作為標記探針,與目標分析物AFB1競爭結合酶標板表面的相應抗體。利用硝酸溶解標記探針,釋放出大量Ag+,引發(fā)其與固定在電極表面的CdTe量子點之間的離子交換反應,導致表面激子俘獲的形成。形成的激子俘獲可以降低修飾電極的光電流,基于此實現AFB1的定量分析。為了進一步克服光電化學免疫分析中常用的半導體(如CdTe)毒性高、穩(wěn)定性差等缺點,Lin課題組[111]還提出了一種可以同時目視和光電化學分析的免疫傳感平臺,用于食品中AFB1的快速、靈敏檢測。該工作同樣采用了競爭型免疫分析平臺,使得目標AFB1與偶聯物葡萄糖氧化酶(GOx)-標記AFB1-BSA競爭結合修飾在磁珠表面的AFB1抗體,形成免疫復合物。免疫復合物中的GOx可以催化葡萄糖氧化,生成的H2O2進一步將電極表面的MnO2納米片還原/刻蝕為Mn2+,導致修飾在電極表面的碳量子點(CQDs)解離。因此,MnO2-CQDs修飾電極的光電流信號會隨著H2O2濃度增加而降低,所建立的光電化學免疫分析方法可檢測低至2.1 pg/mL的AFB1。此外,根據MnO2納米片解離前后MnO2-CQDs涂覆電極的顏色變化,還可以對AFB1進行目視檢測。該工作建立的免疫分析方法具有良好的重現性和準確性,能夠擴展到其他小分子或者真菌毒素的檢測上,同時結合高通量微流控芯片裝置,可以作為一個多功能免疫傳感平臺。

將微流控芯片技術應用于免疫分析方法中,可以顯著減少樣品成本及試劑用量,同時分析時間短、芯片尺寸小,是現場分析的理想選擇。Angelopoulou等[112]首次設計了基于可容納10個寬帶馬赫-森德干涉儀(BB-MZI)的硅微型傳感器芯片,如圖2所示,用于同時且無標記地測定4種過敏源,總檢測時間僅為6.5 min,所獲得的分析結果與ELISA的結果高度吻合。

圖2 具有不同生物分子的BB-MZI對的芯片示意圖[112]Fig. 2 Schematic of the chip depicting the BB-MZIs pairs spotted with the different biomolecules[112]BB-MZIs: broad-band Mach-Zehnder interferometers.

3 總結與展望

近年來,干果類食品深受大眾喜愛而食品安全風險較大,建立此類食品中有害物質的檢測方法具有十分重要的意義。針對干果類食品的樣品前處理方法,仍存在操作較為繁瑣復雜、設備自動化智能化程度低等問題,開發(fā)選擇性高、綠色無污染、成本低的前處理技術依然是干果類食品分析的重要研究內容,可通過發(fā)展新型微萃取方法、研制新型樣品前處理裝置或采用前處理-分析檢測一體化技術來提高樣品制備效率,縮短制備時間。微流控芯片技術因可在一塊芯片上完成分離、富集、分析等多個步驟,在免疫分析、生物傳感器等方面得到了越來越多的應用,開發(fā)出了許多超強運行能力的多功能芯片。干果中有害物質更多利用實驗室方法進行檢測,快速檢測方法應用較少。因此可以通過優(yōu)化樣品前處理方法和檢測技術,尋求新的檢測方法，特別是現場檢測技術來實現對干果類食品中有害物質的快速檢測。但快檢技術由于食品基體極其復雜、易受樣品基體干擾、選擇性不高、難以準確定量,導致出現“檢不出、檢不準、檢不快”等瓶頸問題,在實際操作中需克服準確性與省時性、靈敏度和特異性、漏檢率與錯檢率3方面的矛盾。研發(fā)集分離、富集、檢測于一身的高靈敏、高通量與智能化的綠色快速樣品前處理新方法與技術產品,構建精準、靈敏的快速檢測方法,研制配套試劑與設備,有望成為干果類食品中有害物質分析的發(fā)展趨勢。