劉小蘭, 高 薇, 梁 超, 喬俊琴*, 王 康, 練鴻振*

(1. 生命分析化學(xué)國家重點實驗室, 南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心, 江蘇 南京 210023; 2. 泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)公共平臺服務(wù)中心, 江蘇 泰州 225300; 3. 濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司, 江蘇 泰興 225441)

反相液相色譜(RPLC)因具有良好的選擇性,已成為當(dāng)今應(yīng)用最為廣泛的色譜分離模式。然而,在分析一些離解性強的化合物時,單一的RPLC體系并不能得到滿意的分離效果[1]。離子對反相液相色譜法(IP-RPLC)通過在流動相中添加離子對試劑,增強帶相反電荷溶質(zhì)的保留從而改善分離,主要用于強離解化合物的分離分析[2-7]。在IP-RPLC的應(yīng)用研究中,科研工作者對影響化合物保留行為的因素一直頗為關(guān)注,開展了較為廣泛的研究。Fletouris等[8]采用烷基季銨鹽作為離子對試劑,對多種青霉素進(jìn)行IP-RPLC分析,研究了配對離子鏈長度、流動相pH和濃度,以及柱溫對青霉素保留行為的影響。Lu等[9]利用IP-RPLC梯度洗脫研究了氯雷他定及其8種相關(guān)化合物的保留行為與流動相pH以及離子對試劑濃度之間的關(guān)系。劉文霞等[1]將十二烷基硫酸鈉(SDS)作為流動相添加劑,考察了不同色譜條件對表阿霉素及其6種相關(guān)物質(zhì)保留行為的影響,為表阿霉素及其相關(guān)物質(zhì)的分離測定提供了新思路。Burmaoglu等[5]采用蒸發(fā)光散射檢測器,分別考察了離子對試劑濃度、有機調(diào)節(jié)劑類型、流動相pH、色譜柱類型、柱溫等對唑來膦酸及其相關(guān)雜質(zhì)保留行為的影響,建立了最佳分離分析策略。很顯然,在IP-RPLC的應(yīng)用研究中,人們主要關(guān)注離子對試劑的濃度及對離子(counter ion)類型、緩沖溶液的濃度及pH、柱溫等對保留的影響,而離子對試劑中的非對離子(non-counter ion)以及緩沖鹽類型對溶質(zhì)保留行為的影響研究相對較少。

定量結(jié)構(gòu)-保留行為關(guān)系(QSRR)模型可以溝通溶質(zhì)保留與疏水性參數(shù)正辛醇-水分配系數(shù)(logP)之間的關(guān)系,可用于溶質(zhì)保留行為的預(yù)測或者logP的測定[10]。對于離解性化合物,通常用表觀正辛醇-水分配系數(shù)logD代替logP。研究[11]發(fā)現(xiàn),在RPLC中以100%水相作流動相時的保留因子對數(shù)值(logkw)與logP或logD之間具有很好的相關(guān)性。Logkw可由線性溶劑強度(linear solvent strength, LSS)模型外推獲得[12]:

logk=logkw-Sφ

(1)

k為溶質(zhì)的保留因子,φ是流動相中有機調(diào)節(jié)劑的體積分?jǐn)?shù),S是線性回歸得到的常數(shù)。

當(dāng)溶質(zhì)在流動相和固定相上達(dá)到相等分配(k=1, logk=0)時,對應(yīng)的有機調(diào)節(jié)劑比例稱為色譜疏水指數(shù)(chromatographic hydrophobicity index, CHI)。有文獻(xiàn)[13,14]指出,在引入溶質(zhì)氫鍵描述符的情況下,CHI與logP以及l(fā)ogD之間也存在著較好的線性關(guān)系。CHI可通過logkw和S計算[15]:

CHI=logkw/S

(2)

本文以14種磺酸化合物為研究對象,在硅膠基質(zhì)C18柱上,以甲醇為有機調(diào)節(jié)劑,采用IP-RPLC進(jìn)行保留行為研究。首先,固定流動相中離子對試劑為四丁基溴化銨不變,考察緩沖鹽類型(磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨)對磺酸化合物保留行為的影響;然后,固定流動相中緩沖鹽為磷酸二氫銨不變,考察四丁基季銨鹽離子對試劑(四丁基溴化銨、四丁基磷酸二氫銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基硝酸銨和四丁基乙酸銨)中陰離子對磺酸化合物保留行為的影響,并探索了IP-RPLC的保留機制。最后,對logkw、S、CHI與logD的相關(guān)性進(jìn)行了比較。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

實驗所用高效液相色譜儀為Waters Alliance 2695(Waters,美國),儀器配有真空脫氣機、數(shù)碼四元泵和120位自動進(jìn)樣器。數(shù)據(jù)的采集和處理均在Waters Empower色譜管理系統(tǒng)中進(jìn)行。用996紫外-可見二極管陣列(PDA)檢測器在每個化合物的最佳吸收波長處檢測其吸收峰。流動相pH值使用SevenMulti型pH/電導(dǎo)率/離子綜合測試儀(Metter-Toledo,瑞士)測量。

實驗中所用甲醇(HPLC級)購自美國Honeywell公司,所用水均為飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán));分析純磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、乙酸銨、氯化銨、氨水(25%～28%)、磷酸(85%)、冰乙酸(98%)和鹽酸(36%～38%)均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司;四丁基溴化銨(99%)購自百靈威公司(上海),四丁基硫酸銨(99%)購自安耐吉化學(xué)(上海),四丁基乙酸銨(98%)和四丁基磷酸氫銨(99%)購自畢得醫(yī)藥科技有限公司(上海),四丁基硝酸銨(99%)購自艾覽化工科技有限公司(上海)。

本實驗中對14種磺酸類化合物進(jìn)行研究,具體信息見表1。其中,logD7.0值(pH=7.0條件下的logD值)是由本課題組前期工作中利用IP-RPLC測試得到的實驗值[16], pKa值由ACD/Labs軟件計算得到,溶質(zhì)靜電荷ne、氫鍵酸性參數(shù)A、氫鍵堿性參數(shù)B、極性表面積PSA由https://ilab.acdlabs.com/iLab2/獲取?；撬峄衔锓謩e購自Accu Standard(美國)、TCI(日本)、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)、Acros Organics(美國)、Matrix Scientific(美國)和Sigma-Aldrich(美國)。所有物質(zhì)的純度均大于98%,用甲醇配制成儲備液(1.0 g/L),置于4 ℃冰箱中備用。

表1 化合物的log D7.0、pKa、ne、A、B和PSA值

1.2 色譜條件

色譜柱:Welch Ultimate?XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司);柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。各化合物的進(jìn)樣質(zhì)量濃度均為50 mg/L,所有樣品的保留時間(tR)均為至少3次獨立進(jìn)樣的平均值。

流動相①: (甲醇+10 mmol/L四丁基溴化銨)-(20 mmol/L緩沖鹽+10 mmol/L四丁基溴化銨,pH 7.0),分別使用磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨作為緩沖鹽。

流動相②: (甲醇+10 mmol/L四丁基季銨鹽)-(20 mmol/L磷酸二氫銨+10 mmol/L四丁基季銨鹽,pH 7.0),分別使用含不同陰離子的5種四丁基季銨鹽(四丁基溴化銨、四丁基磷酸二氫銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基硝酸銨和四丁基乙酸銨)作為離子對試劑。

1.3 實驗方法

采用尿嘧啶測定死時間t0,所有化合物均使用等度洗脫,根據(jù)化合物疏水性差異,每個化合物至少在4個不同的甲醇體積百分?jǐn)?shù)(70%～10%,間隔5%～10%)下測定tR,使用雙點校正法(DP-RTC)校正[17]。根據(jù)k=(tR-t0)/tR計算保留因子k,根據(jù)方程(1)建立logk-φ方程,求得kw和S值,根據(jù)方程(2)計算CHI值。采用Origin 9.4進(jìn)行相關(guān)模型建立及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖鹽類型對磺酸化合物保留行為的影響

由于磺酸化合物具有較小的pKa值(見表1),在實驗環(huán)境下(pH=7.0)帶有完全的負(fù)電荷,為典型的強離解化合物,并且磺酸化合物具有明顯的紫外特征吸收,可用使用最為普遍的二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測,因此,我們選擇磺酸化合物作為模型化合物。在分析強離解酸性化合物時,四丁基季銨鹽為最常使用的離子對試劑,在pH=7.0的條件下,四丁基季銨鹽帶正電荷,與磺酸化合物形成離子對。實驗中采用甲醇作為有機調(diào)節(jié)劑,固定流動相中離子對試劑為四丁基溴化銨不變,分別以磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨作為緩沖鹽(濃度相同,pH相同),考察緩沖鹽類型對磺酸化合物保留行為的影響。

在不同的甲醇比例下,分別獲取3種緩沖鹽條件下磺酸化合物的k值,并建立logk-φ模型(方程(1)),結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型的線性相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。由logk-φ模型獲取每個化合物在不同流動相下的logkw和S值,并根據(jù)方程(2)計算各化合物的CHI值。3種緩沖鹽體系下磺酸化合物的logkw、S和CHI值如圖1所示。從圖1a可以看出,氯化銨體系下溶質(zhì)的logkw值最大,而大部分溶質(zhì)在磷酸二氫銨體系下的logkw值最小,表明流動相中氯離子的存在有利于增強磺酸化合物的保留。圖1b顯示大部分溶質(zhì)在氯化銨體系下的S值最大,但SA2、SA4、SA5和SA13在乙酸銨體系下的S值明顯大于其他兩種緩沖鹽體系。圖1c顯示各化合物的色譜疏水指數(shù)CHI在乙酸銨體系下最小。盡管在3種緩沖鹽體系下的CHI值存在一定差別,但總體上同一化合物在各體系下對應(yīng)的CHI值近似相等(見圖1c)。

圖1 不同緩沖鹽體系下磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 1 (a) log kw(logarithm of retention factors of soluteswhen 100% aqueous phases were used as the mobile phase), (b) S (intercept of the linear solvent strength model) and (c) CHI (chromatographic hydrophobic index) values for sulfonic acid compounds with different buffer solutions

2.2 離子對試劑非對離子對磺酸化合物保留行為的影響

圖2 離子對試劑不同陰離子時磺酸化合物的(a) log kw、(b) S以及(c) CHIFig. 2 (a) log kw, (b) S and (c) CHI values forsulfonic acid compounds with different ion-pair reagents Br-, CH3COO-, represent different quaternary ammonium ion-pair reagents (tetrabutylammonium bromide, tetrabutylammonium hydrogen sulfate, tetrabutyl ammonium acetate, tetrabutylammonium hydrogen phosphate and tetrabutylammonium nitrate, respectively).

2.3 IP-RPLC的保留機理

對IP-RPLC的保留機理一直存在著兩種不同的觀點,一種認(rèn)為是離子對模式保留機理,離子對試劑與帶相反電荷的分析物在流動相中首先形成中性物質(zhì),然后中性物質(zhì)分配到疏水性固定相中[19];另外一種認(rèn)為是動力學(xué)離子交換模式保留機理,離子對試劑首先被吸附到固定相上,在固定相表面產(chǎn)生電荷位點,作為帶相反電荷分析物的離子交換位點[20]。

在動態(tài)離子交換模式保留機理中,疏水性的四丁基銨鹽可以吸附在固定相表面,形成雙電層,磺酸化合物通過與陰離子的交換實現(xiàn)保留,保留主要取決于磺酸化合物所帶陰離子電荷的數(shù)量。然而,我們的實驗表明,具有2個凈電荷(ne=-2)的化合物SA2、SA6、SA10的保留(logkw)甚至比相同色譜條件下只有1個凈電荷(ne=-1)的化合物(SA7、SA12等)的保留弱(見圖1a和2a)。相反,保留最強的化合物為SA11,對應(yīng)凈電荷為-1.14,具有最大的logD值(-0.33),即疏水性最強。因此,動態(tài)離子交換模式保留機理占主導(dǎo)地位不成立,猜測離子對模式保留機理占主導(dǎo)地位。

2.4 log kw、S、CHI與log D相關(guān)性的比較

在IP-RPLC模型下,電荷作用和氫鍵作用均會影響離解化合物的保留,可以在logD-logkw模型中引入溶質(zhì)靜電荷ne、氫鍵酸堿性參數(shù)A和B,建立QSRR模型[14],用于logD或保留的預(yù)測。在磷酸二氫銨、氯化銨和乙酸銨3種緩沖鹽體系下,我們分別以14種磺酸化合物的logD7.0、logkw、ne、A和B進(jìn)行多元線性擬合,建立QSRR模型,結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?3種流動相條件下的logD7.0和logkw之間均有良好的線性相關(guān)性,R2達(dá)到0.98。為了進(jìn)一步改善方程的相關(guān)性,我們將溶質(zhì)的極性表面積PSA引入到上述方程中,發(fā)現(xiàn)方程的R2進(jìn)一步增大,線性得到改善。同樣,在引入?yún)?shù)ne、A和B的情況下,以S對logD7.0作線性方程,可以得到良好的線性相關(guān)性,當(dāng)引入PSA后,氯化銨體系下的線性相關(guān)性得到明顯改善,線性相關(guān)系數(shù)R2由0.96增大到0.99(見表2)。最后,分別對3種緩沖鹽體系下得到的CHI對logD7.0進(jìn)行線性擬合,結(jié)果顯示,PSA引入前后logD7.0-CHI模型的線性相關(guān)性R2均在0.98以上。表2中的結(jié)果表明,溶質(zhì)的極性表面積PSA會影響溶質(zhì)的保留,PSA的加入有利于logD7.0-logkw、logD7.0-S和logD7.0-CHI模型的改善。

引入溶質(zhì)靜電荷ne、氫鍵酸堿性參數(shù)A和B、極性表面積PSA,分別用14種磺酸化合物的logD7.0值與在5種不同離子對試劑條件下得到的logkw、S以及CHI值,進(jìn)行多元線性擬合,得到如表3所示的線性方程。可以看出,logD7.0和logkw、S以及CHI之間均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2均在0.98以上。

用IP-RPLC研究logD相關(guān)的QSRR模型,通常以logkw作為疏水性指數(shù),建立logD和logkw之間的線性關(guān)系。我們的研究發(fā)現(xiàn),logD與S以及CHI之間也具有良好的線性相關(guān)性。強離解酸性化合物進(jìn)行IP-RPLC分析時,當(dāng)流動相中使用不同的緩沖鹽陰離子或者離子對試劑陰離子,即使得到的logkw和S值存在一定差異,但最終獲取的色譜疏水指數(shù)CHI幾乎相等。因此,相比logkw和S而言,CHI更適用于QSRR模型的建立。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)IP-RPLC中緩沖鹽陰離子以及離子對試劑陰離子均會影響磺酸化合物的保留行為。相同離子對試劑情況下,氯化銨體系下的logkw最大;相同緩沖鹽的情況下,離子對試劑中弱離解性陰離子(乙酸根)的存在有利于增加磺酸化合物的S值。我們推測磺酸化合物的IP-RPLC保留機理同時存在著離子對模式和動態(tài)離子交換模式,并以離子對模式為主。對于強離解酸性化合物,由于在IP-RPLC不同緩沖鹽和不同非對離子條件下獲得的logkw和S值存在著一定的差異,而CHI值相對穩(wěn)定,因此CHI更適用于QSRR模型的建立。