丁龐華 史利卿 石 磊 郭 一 路瓊瓊寇富舜 趙興杰 毛堂友 孫中美 李軍祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是發(fā)生在結(jié)直腸、原因不明的非特異性炎癥性疾病［1］。本病好發(fā)于中青年，臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便及腹痛等癥狀，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。近10年來我國UC患病率（11.6/10萬人）逐年上升，發(fā)病人數(shù)增加了7倍［2-3］，成為當(dāng)前消化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前UC的臨床治療藥物主要包括5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑。但以上藥物可能出現(xiàn)臨床療效不穩(wěn)定、停藥后易復(fù)發(fā)或不同程度的毒副作用。隨著對UC研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識到黏液屏障作為腸道黏膜屏障的第一道防線，在UC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-5］。腸黏液屏障結(jié)構(gòu)減弱是UC發(fā)病的早期關(guān)鍵環(huán)節(jié)［6］。UC的炎癥表現(xiàn)與促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的失衡有關(guān)，其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎因子的上調(diào)在此過程中起著重要作用［7］。在UC的發(fā)生發(fā)展過程中，IL-6的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致T細(xì)胞過多堆積，加重腸黏膜的慢性炎癥，出現(xiàn)UC的臨床炎癥表現(xiàn)［8］。TNF-α在UC的發(fā)生發(fā)展過程中起到“樞紐樣”作用，已有研究證實(shí)TNF-α參與UC發(fā)展的許多環(huán)節(jié)［9］。

虎地腸溶膠囊作為活動期UC治療的代表方藥，在2017年《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識意見》中被推薦使用［10］。在前期評價(jià)虎地腸溶膠囊以及聯(lián)合美沙拉嗪腸溶片治療活動期UC臨床療效的多中心、隨機(jī)對照、雙盲雙模擬的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其治療UC療效顯著［11］。因此，本研究采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠UC模型，觀察虎地腸溶膠囊對UC小鼠腸黏液屏障及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討虎地腸溶膠囊治療UC的作用機(jī)制，從而為其臨床治療UC提供實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級C57BL/6雌性小鼠20只，體質(zhì)量18～20 g，鼠齡7～8周，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SYXK（京）2019-0013。于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心動物房飼養(yǎng)，溫度23～27℃，相對濕度40%～60%，室內(nèi)通風(fēng)良好，每日光照10～12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動物實(shí)驗(yàn)方法符合北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)程，倫理編號：BUCM-4-2020082704-3138。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 虎地腸溶膠囊由朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬、二色補(bǔ)血草、地榆、白及、甘草組成（安徽九方制藥，國藥準(zhǔn)字Z20020035，批號：14000367653），結(jié)合其臨床規(guī)定使用劑量，進(jìn)行人-鼠等劑量換算，使用劑量為0.73 g/kg。美沙拉嗪腸溶片（德國?？酥扑幱邢薰荆?guī)格0.5 g/粒，批號：H20171358），使用劑量為0.46 g/kg。

1.3 試劑與儀器 DSS（美國MP Biomedicals，43 kDa，批號：160110），用100 mL滅菌蒸餾水溶解2.5 g DSS配制2.5%的DSS溶液用于實(shí)驗(yàn)；無水乙醇，北京華騰化工有限公司；二甲苯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木素、伊紅，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；中性樹膠，中國上海標(biāo)本模型廠；阿利新藍(lán)染液套裝（AB-PAS），Servicesbio；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)，貨號分別為ml06315-J、ml002095-J）。電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，型號SKP-02.600；病理石蠟包埋機(jī)，沈陽市龍首電子儀器有限公司，型號LS-100；石蠟切片機(jī)，北京弘泰嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司，型號Finesse 325；顯微鏡，奧林巴斯株式會社，型號BX60。

1.4 造模與給藥 20只小鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予如下處理：空白組普通飼養(yǎng)，每日予滅菌蒸餾水0.2 mL灌胃；模型組予2.5% DSS溶液自由飲用7 d，每日予滅菌蒸餾水0.2 mL灌胃。虎地腸溶膠囊組飲水同DSS組，每日予虎地腸溶膠囊溶液0.73 g/kg灌胃；美沙拉嗪組飲水同DSS組，每日予美沙拉嗪溶液0.46 g/kg灌胃。所有小鼠除飲水和灌胃之外，其他飼養(yǎng)條件一致。

1.5 一般情況與疾病活動指數(shù)（DAI）評分 每天觀察并記錄各組小鼠精神狀態(tài)、活動情況、皮毛色澤、大便性狀、體質(zhì)量變化、大便潛血情況等。計(jì)算每組小鼠DAI評分值，DAI=（體質(zhì)量評分+大便性狀評分+出血情況評分）/3。具體評分準(zhǔn)則如下：體質(zhì)量下降＜1%計(jì)0分，下降1%～5%計(jì)2分，下降10%～15%計(jì)3分，下降＞15%計(jì)4分；大便呈干性顆粒狀計(jì)0分，松散便計(jì)2分，稀便計(jì)4分；大便隱血陰性計(jì)0分，隱血陽性計(jì)2分，肉眼血便計(jì)4分。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察。末次藥物干預(yù)結(jié)束后，使用二氧化碳麻醉小鼠，眼球取血后斷頸處死，分離小鼠結(jié)腸，測量從肛門至回盲部的結(jié)腸長度，然后取結(jié)腸遠(yuǎn)端約1 cm長度，用4%多聚甲醛溶液固定后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察切片組織學(xué)變化。2）血清中IL-6和TNF-α含量。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測儀按照標(biāo)準(zhǔn)檢測流程檢測小鼠血清中IL-6和TNF-α的含量。3）結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞觀察。截取1 cm左右的病變組織，置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，用石蠟包埋，切片，用于AB-PAS染色，光鏡下觀察結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，滿足正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 空白組小鼠第1～7天體質(zhì)量穩(wěn)中有增，排便正常。模型組小鼠給予DSS溶液自由飲用后的第2～3天開始出現(xiàn)大便不成形、大便潛血（+）或肉眼血便等情況，伴體質(zhì)量進(jìn)行性下降?；⒌啬c溶膠囊組、美沙拉嗪組的小鼠，在給予DSS溶液的第2～3天出現(xiàn)大便不成形、大便潛血（+）或肉眼血便等情況，隨著時(shí)間的增加，小鼠體質(zhì)量減輕情況較模型組變緩。

2.2 各組小鼠干預(yù)后DAI評分比較 見表1。造模4 d后模型組小鼠體質(zhì)量開始出現(xiàn)下降，且全部呈現(xiàn)便血癥狀，大便性狀改變，DAI升高。造模7 d后模型組小鼠體質(zhì)量下降明顯且全部呈現(xiàn)便血、大便性狀改變癥狀。造模后與空白組相比，模型組小鼠DAI顯著升高（P＜0.01），虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組治療后能夠顯著降低UC小鼠DAI（P＜0.01）?；⒌啬c溶膠囊組與美沙拉嗪組之間小鼠DAI無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠DAI評分及結(jié)腸長度比較（±s）

表1 各組小鼠DAI評分及結(jié)腸長度比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組虎地腸溶膠囊組美沙拉嗪組結(jié)腸長度（cm）9.06±0.56 6.98±0.29*7.50±0.39#7.52±0.21#n 5 5 5 5 DAI評分（分）0.00±0.00 2.83±0.43*2.13±0.45#2.25±0.32#

2.3 各組小鼠結(jié)腸長度比較 見表1。與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.01）；與模型組相比，虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組治療后能夠改善小鼠結(jié)腸長度（P＜0.05）?；⒌啬c溶膠囊組與美沙拉嗪組之間小鼠結(jié)腸長度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠組織病理學(xué)變化比較 由圖1可見，空白組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸黏膜未見病變。模型組可見黏膜下隱窩腺體全部消失，炎癥細(xì)胞浸潤黏膜至上皮，腸黏膜結(jié)構(gòu)明顯破壞?；⒌啬c溶膠囊組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)與空白組最為接近。美沙拉嗪組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)基本正常，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少。

圖1 各組UC小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，100倍）

2.5 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平比較 見表2。與空白組比較，模型組IL-6、TNF-α明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療后虎地腸溶膠囊組、美沙拉嗪組IL-6、TNF-α明顯降低，接近于空白組（P＜0.05）。虎地腸溶膠囊組與美沙拉嗪組中TNF-α的減低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且虎地腸溶膠囊優(yōu)于美沙拉嗪組（P＜0.05）；而IL-6的減低，兩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與美沙拉嗪組比較，△P＜0.05。

TNF-α 63.68±4.19 69.97±4.90*46.16±1.50#△59.92±6.52#組別空白組模型組虎地腸溶膠囊組美沙拉嗪組n 5 555 IL-6 9.62±2.04 16.17±2.15*12.43±2.23#12.78±1.62#

2.6 各組小鼠結(jié)腸黏膜中杯狀細(xì)胞變化比較 見圖2?？瞻捉M小鼠結(jié)腸黏膜的杯狀細(xì)胞密集分布于隱窩兩側(cè)，形態(tài)規(guī)則飽滿。而模型組小鼠結(jié)腸黏膜破損，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，大小不均，較之正常組，具有顯著差異?；⒌啬c溶膠囊組的杯狀細(xì)胞沿著腺體分布，比較密集，數(shù)量增多，較之模型組有明顯變化。美沙拉嗪組小鼠杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，大小不均，較之模型組無明顯變化。

圖2 各組UC小鼠結(jié)腸黏膜的杯狀細(xì)胞觀察（AB-PAS染色，100倍）

3 討論

根據(jù)UC臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“久痢”等范疇，其病機(jī)多屬濕熱瘀阻、脾氣虛弱。多因外感內(nèi)傷致脾胃運(yùn)化失司，水濕內(nèi)停，郁而化熱，濕熱下注大腸，與腸道氣血相搏結(jié)，氣血凝滯，化為膿血；故患者出現(xiàn)腹瀉，下利黏液膿血便。腸道傳導(dǎo)失司，氣機(jī)阻滯，腑氣不通，故見腹痛，里急后重；脾氣不足，不能運(yùn)化水谷精微，表現(xiàn)為神疲乏力、肢體困倦、食少納差。治療多以清熱化濕、涼血化瘀、健脾益氣為主。

虎地腸溶膠囊由朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬、二色補(bǔ)血草、地榆炭、白及和甘草組成。方中朱砂七、虎杖、白花蛇舌草、北敗醬合用可清熱利濕解毒，且可止痛；地榆、白及合用既可涼血收斂止血，也可解毒消腫生肌。二色補(bǔ)血草具有益氣血、散瘀止血之功效，常用于病后體弱、胃脘痛、消化不良、崩漏、帶下、尿血、痔血。甘草性味甘平，可緩急止痛、解毒消癰、調(diào)和諸藥，防止苦寒傷胃，且可補(bǔ)脾胃不足以扶正，二藥合用達(dá)到健脾益氣之功效?；⒌啬c溶膠囊在臨床中治療輕中度活動期UC療效顯著［11］。美沙拉嗪通過抑制結(jié)腸黏膜釋放前列腺素、白三烯等損傷性因子，從而減輕炎癥因子對腸黏膜的損傷；故選用為本次研究的陽性對照藥。本研究結(jié)果顯示，虎地腸溶膠囊在改善UC模型小鼠DAI、結(jié)腸長度等方面療效與美沙拉嗪相近。

UC發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能的失衡與其發(fā)病密切相關(guān)。腸黏膜屏障的完整性依賴于正常的免疫反應(yīng)、腸黏膜上皮細(xì)胞（IECs）的完整性和黏液的產(chǎn)生［12-14］。黏液的正常分泌形成了腸道的黏液屏障，黏液屏障在UC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。有文獻(xiàn)指出，腸黏液屏障損傷（包括黏液層厚度和通透性異常改變）可導(dǎo)致腸道通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致腸道致病細(xì)菌更易侵犯腸黏膜引起腸道疾病。UC活動期，杯狀細(xì)胞會明顯減少甚至消失，導(dǎo)致黏蛋白分泌減少，黏液層變薄甚至缺失，暴露出來的上皮細(xì)胞易受細(xì)菌侵襲［15］。有研究者發(fā)現(xiàn)DSS誘導(dǎo)的UC模型中，在炎癥發(fā)生之前，糞便中的細(xì)菌會侵入結(jié)腸黏液層，由此證明DSS能夠直接破壞黏液層，也說明了完整的黏液層對腸道的保護(hù)作用［16］。

當(dāng)腸黏膜屏障第一道防線腸黏液屏障被破壞時(shí)，IECs暴露在多種抗原刺激下，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，炎癥介質(zhì)不斷積累，對IECs和自身抗體的毒性作用會刺激自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腸損傷的發(fā)展并形成惡性循環(huán)，這也是UC反復(fù)發(fā)作的原因之一［17］。IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子來源于多種免疫和非免疫細(xì)胞以及IECs自身產(chǎn)生。IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的升高，會促進(jìn)IECs的凋亡，從而導(dǎo)致屏障功能障礙［18］。UC患者血清中檢測到促炎因子IL-6、TNF-α水平的升高，抗IL-6R抗體和TNF-α阻斷劑已成為臨床中治療UC的重要替代品［19-20］。

本次研究中，DSS致小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量降低，精神萎靡、腹瀉血便等現(xiàn)象，符合UC的表現(xiàn)，屬于虎地腸溶膠囊的治療范圍。與模型組相比較，各給藥組小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)，狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，結(jié)腸長度偏長，結(jié)腸病理情況有不同程度的改善。各給藥組小鼠結(jié)腸組織較模型組IL-6、TNF-α的合成和釋放減少。模型組小鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，虎地腸溶膠囊組能夠明顯增加杯狀細(xì)胞的數(shù)量，而美沙拉嗪組對杯狀細(xì)胞數(shù)量改善不明顯，這可能是虎地腸溶膠囊發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵所在。

綜上所述，虎地腸溶膠囊能夠有效促進(jìn)UC小鼠的恢復(fù)，回復(fù)腸道形態(tài)，改善其腸道病理損傷。其治療效果可能是通過促進(jìn)杯狀細(xì)胞的生長，修復(fù)腸黏液屏障，進(jìn)而恢復(fù)腸黏液及黏液屏障功能，并為其他屏障功能的正常發(fā)揮提供基礎(chǔ)；同時(shí)可能通過下調(diào)血清中炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的水平，減輕因黏液屏障功能損傷或消失引起的炎癥因子對腸黏膜直接的炎癥刺激，緩解腸道炎癥反應(yīng)，恢復(fù)腸黏膜功能。此次研究為臨床應(yīng)用虎地腸溶膠囊治療活動期UC提供了更多的分子生物學(xué)理論依據(jù)。