趙夢(mèng)婧，覃 彬，陳 宇，吳秀山，江志鋼，萬(wàn)永奇

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院心臟發(fā)育研究中心，長(zhǎng)沙 410081）

黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）是一種應(yīng)用廣泛的模式生物，擁有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如體型小、便于飼養(yǎng)管理、繁殖力強(qiáng)、性狀易于觀察等［1］。果蠅的大多數(shù)發(fā)育相關(guān)基因與人類(lèi)基因高度保守，近年來(lái)其在人類(lèi)發(fā)育與疾病研究領(lǐng)域也揮著重要作用［2］。數(shù)據(jù)表明，預(yù)計(jì)到2030年，全球死于心血管疾病的人數(shù)將達(dá)到2 300萬(wàn)，占據(jù)非傳染性疾病致死人數(shù)的44%，是死于癌癥人數(shù)的2倍［3-4］。而果蠅心臟發(fā)育過(guò)程與人類(lèi)的心臟發(fā)育過(guò)程高度相似，研究果蠅心臟發(fā)育的調(diào)控機(jī)制將能為人類(lèi)心臟疾病的治療提供重要的線索［5-7］。

Lbe基因是果蠅同源框基因的成員之一，也是果蠅心臟發(fā)育的重要標(biāo)記基因。它參與了果蠅的心源性途徑，并在果蠅胚胎早期的成心細(xì)胞和心臟前體細(xì)胞中均有表達(dá)，與中胚層Tinman基因、Wg基因和神經(jīng)基因等共同調(diào)控果蠅的心臟發(fā)育［8-10］。有研究表明，特異性干擾Lbe將會(huì)擾亂心臟中胚層內(nèi)特定細(xì)胞類(lèi)型的基因表達(dá)空間模式，從而導(dǎo)致心臟祖細(xì)胞分化與定位紊亂，如Lbe過(guò)表達(dá)將導(dǎo)致心臟前體細(xì)胞的異常增多，而Lbe基因失活將導(dǎo)致心臟循環(huán)異常等［10-13］。這表明Lbe的調(diào)控對(duì)于心臟的正常發(fā)育過(guò)程是必不可少的。因此，制備針對(duì)Lbe的抗體可以更清楚地了解該基因的表達(dá)狀況，為研究其在心臟發(fā)育過(guò)程中的具體功能奠定基礎(chǔ)。

DNA免疫是利用基因重組技術(shù)將目的基因與合適的表達(dá)載體相連作為抗原，直接免疫機(jī)體以表達(dá)相應(yīng)抗體的新技術(shù)［14］。與傳統(tǒng)的抗體制備方法相比，DNA免疫具有許多優(yōu)勢(shì)［15-16］，如DNA免疫不需要在體外合成蛋白質(zhì)作為抗原，體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)可以最大程度地維持天然構(gòu)象和翻譯后修飾形成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，從而有助于針對(duì)天然構(gòu)象抗原的高親和力抗體的產(chǎn)生?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，本文選擇通過(guò)DNA免疫來(lái)制備Lbe抗體。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及材料

試驗(yàn)所用的大腸桿菌菌株DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保種；哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pCAGGS-P7由本實(shí)驗(yàn)室提供；限制性?xún)?nèi)切酶KpnI、XhoI以及2×MIX Taq酶購(gòu)買(mǎi)自sigma公司；蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、丙烯酰胺、通用胚胎固定液、含有0.5%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline with 0.5% bovine serum albumin，PBSBT）購(gòu)買(mǎi)自生工公司；組織快速裂解液（radio-immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）和蛋白上樣緩沖液購(gòu)買(mǎi)自康為試劑公司；RNA試劑盒購(gòu)買(mǎi)自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Takara公司；無(wú)內(nèi)毒質(zhì)粒提取試劑盒（離心柱型）購(gòu)自康為試劑公司；昆明白小鼠由本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中找到果蠅的Lbe基因序列，并找出抗原性最佳的片段，隨后利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度約為440 bp的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）引物。正義引物：5'CTATAGGGCGAATTGGG TACCATGCTCTGCCCTCCAACCAT 3'（劃線部分是KpnI同源臂）；反義引物：5'ATCGATACCGTCGACC TCGAGCGCTGCTTCTCCGAGTGACC 3'（劃線部分是XhoI同源臂）。引物由北京擎科生物公司合成。Lbe蛋白的分子量大小約為51 kD。

1.2.2 基因克隆及載體構(gòu)建

選取w1118野生型果蠅發(fā)育后期（10 h）胚胎50枚，使用RNA提取試劑盒提取其RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫(kù)；隨后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)梯度為53、56、59、62及65℃的退火溫度，得到擴(kuò)增長(zhǎng)度為440 bp的片段。經(jīng)純化后將片段與哺乳動(dòng)物載體pCAGGS-P7連接并轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中，挑取單克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)大培養(yǎng)和測(cè)序分析。

1.2.3 重組質(zhì)粒的提取

將測(cè)序正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后，用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。質(zhì)粒提取后于-20℃保存。

1.2.4 多克隆抗體的制備

將重組質(zhì)粒pCAGGS-P7-Lbe免疫4周齡小鼠。分別對(duì)體型相似、性別一致的3只小鼠其后肢股四頭肌注射質(zhì)量濃度為500 ng/μL的重組質(zhì)粒DNA 40 μL，注射完畢后立即在注射部位兩側(cè)5 mm處用細(xì)胞融合轉(zhuǎn)基因儀兩端電極電擊3次，讓質(zhì)粒DNA盡快擴(kuò)散均勻。分別在注射7、14、21 d后，按上述方法給這3只小鼠注射同種相同劑量質(zhì)粒DNA用于加強(qiáng)免疫。于35 d后取血收集血清，將血清分裝后加入等體積濃度為0.05%的疊氮化鈉，于-80℃保存。

1.2.5 多克隆抗體的效價(jià)評(píng)價(jià)

收集的血清用于后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡（Western blot）試驗(yàn)檢測(cè)效價(jià)。取發(fā)育后期（10 h）的w1118野生型果蠅胚胎100枚研磨，加入RIPA組織裂解液后靜置10 min，待溶液澄清后加入蛋白上樣緩沖液約100 μL，上下混勻后煮沸10 min，即得到蛋白樣本。使用前先12 000 r/min離心1 min，取用上清。將Lbe血清抗體稀釋為1∶200、1∶500后，采用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)多克隆抗體的特異性。相同條件下，用免疫前的小鼠血清作為對(duì)照。在果蠅發(fā)育不同時(shí)期的試驗(yàn)中，不同發(fā)育時(shí)間的胚胎均取用100枚，幼蟲(chóng)與成蠅均取用1只。

1.2.6 果蠅胚胎固定

收集胚胎后，用毛筆輕輕掃下胚胎于30%的次氯酸鈉溶液中脫殼，約5 min后可在顯微鏡下觀察到胚胎觸角消失；此時(shí)用逆滲透（reverses osmosis，RO）水沖洗3～4遍，再將胚胎轉(zhuǎn)入到含有胚胎固定液（4 mL正庚烷、3 mL通用胚胎固定液、1 mL甲醛）的帶蓋玻璃瓶中；震蕩30 min后，將下層吸棄，并用RO水清洗2遍，再將胚胎吸入到裝有1 mL甲醛的EP管中。

1.2.7 果蠅胚胎抗體染色

將固定好的胚胎加入到1 mL PBSBT中，搖洗1 min后，除去廢液。加入1 mL PBSBT，搖洗10 min，再吸出廢液。加入1 mL PBSBT，在室溫?fù)u洗1 h，進(jìn)行封閉。封閉完成后，吸棄液體，加入200 μL PBSBT與1 μL一抗，室溫孵育2 h?；厥找豢购?，加入PBSBT搖洗30 min，隨后按200∶1的體積比混合PBSBT與熒光二抗，避光孵育2 h。最后PBSBT搖洗30 min后即可在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.8 胚胎染色觀察與圖像處理

果蠅胚胎染色制片后使用蔡司（ZEISS）正置智能顯微鏡 Axio Imager M2 進(jìn)行觀察拍攝，拍攝所得圖片使用Photoshop CS6軟件進(jìn)行標(biāo)注編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的克隆及重組載體鑒定

利用添加同源臂后設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR。為了找到最適PCR退火溫度，本研究設(shè)計(jì)了53、56、59、62及65℃ 5個(gè)溫度梯度。PCR結(jié)果如圖1所示。PCR擴(kuò)增條帶均一且位置符合預(yù)期，表明目的片段成功擴(kuò)增。將目的片段純化后與pCAGGS-P7質(zhì)粒同源重組，構(gòu)建如圖2所示的pCAGGS-P7-Lbe重組載體。使用KpnI和XhoI對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳結(jié)果顯示，所得條帶大小分別與載體和目的片段一致（圖3）。對(duì)單克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果表明pCAGGS-P7-Lbe載體構(gòu)建成功（圖4）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)重組載體中有3處點(diǎn)突變，分別位于171、371和431 bp處，但3處突變均為同義突變（CCG-CCA-脯氨酸；GTT-GTC-纈氨酸），不影響氨基酸序列。

圖1 Lbe基因 PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果Fig. 1 PCR amplification and electrophoresis result of Lbe geneM：DNA marker；1：53℃退火溫度時(shí)PCR擴(kuò)增條帶；2：56℃退火溫度時(shí)PCR擴(kuò)增條帶；3：59℃退火溫度時(shí)PCR擴(kuò)增條帶；4：62℃退火溫度時(shí)PCR擴(kuò)增條帶；5：65℃退火溫度時(shí)PCR擴(kuò)增條帶。M: DNA Marker; 1: PCR amplification band at 53℃ annealing temperature; 2: PCR amplification band at 56℃ annealing temperature; 3: PCR amplification band at 59℃ annealing temperature; 4: PCR amplification band at 62℃ annealing temperature; 5: PCR amplification band at 65℃ annealing temperature.

圖3 pCAGGS-P7-Lbe重組質(zhì)粒Kpn I和Xho I雙酶切的電泳結(jié)果Fig. 3 Double digested with Kpn I and Xho I and electrophoresis result of pCAGGS-P7-Lbe recombinant plasmidM：DNA Marker；1：pCAGGS-P7-Lbe重組質(zhì)粒Kpn I和Xho I雙酶切的產(chǎn)物。M: DNA marker; 1: The recombinant plasmid pCAGGS-P7-Lbe was double digested with Kpn I and Xho I.

圖4 pCAGGS-P7-Lbe重組質(zhì)粒測(cè)序的比對(duì)結(jié)果Fig. 4 Sequencing comparison result of recombinant plasmid pCAGGS-P7-Lbe紅色方框內(nèi)為3處同義突變（CCG-CCA-脯氨酸；GTT-GTC-纈氨酸）。Three synonymous mutations were identified in the red box (CCG-CCA-proline; GTT-GTC-valine).

2.2 Lbe多克隆抗體的Western blot鑒定

將免疫后小鼠血清作為一抗針對(duì)野生型果蠅胚胎全蛋白進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該血清的全蛋白檢測(cè)中只出現(xiàn)了一條蛋白帶（圖5a），且大小與預(yù)計(jì)的Lbe蛋白大小接近，表明該血清的特異性較好，無(wú)交叉反應(yīng)。隨后，對(duì)該血清使用的最佳稀釋比例進(jìn)行摸索，分別以1∶200、1∶500兩種稀釋比例進(jìn)行Western blot試驗(yàn)（圖5b、5c），結(jié)果顯示當(dāng)稀釋比例為1:200時(shí)，條帶清晰且背景干凈（圖5b），表明1:200為該抗血清的適宜稀釋比例。所有Western blot試驗(yàn)均以β-actin作為內(nèi)參（圖5d）。

圖5 抗Lbe血清特異性與適宜稀釋比例檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Specificity and appropriate dilution ratio detection results of anti-Lbe serum（a）抗Lbe血清的全蛋白檢測(cè)結(jié)果；（b）血清稀釋比例為1∶200時(shí)的Western blot結(jié)果；（c）血清稀釋比例為1∶500時(shí)的Western blot結(jié)果；（d）β-actin抗體稀釋比例為1∶1 000時(shí)的Western blot結(jié)果。(a) Whole protein detection result of anti-Lbe serum; (b) Western blot result when the dilution ratio of serum is 1∶200; (c) Western blot result when the dilution ratio of serum is 1∶500; (d) Western blot result when the dilution ratio of anti-β-actin is 1∶1 000.

2.3 Lbe蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)狀況

為了深入了解Lbe蛋白在果蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，我們利用制備的抗體檢測(cè)了w1118果蠅不同時(shí)期的胚胎中Lbe蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在胚胎中，Lbe在4 h時(shí)開(kāi)始表達(dá)，在7 h和10 h時(shí)表達(dá)不斷增強(qiáng)，但在13 h和16 h時(shí)表達(dá)有所下降（圖6a）。我們認(rèn)為這可能是由于Lbe基因在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮了作用，在果蠅胚胎生殖帶伸長(zhǎng)時(shí)期便有表達(dá)，隨后參與中胚層心臟前體細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，故在此期間表達(dá)量不斷增加，而在果蠅胚胎中線閉合后表達(dá)下降。為了驗(yàn)證上述猜想，我們選擇了果蠅發(fā)育的3個(gè)不同時(shí)期，即胚胎、幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)，檢測(cè)這3個(gè)時(shí)期Lbe蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在胚胎階段，Lbe蛋白的表達(dá)量較高，而在幼蟲(chóng)階段表達(dá)明顯減少，在成蠅中基本檢測(cè)不到Lbe的表達(dá)（圖6b）。這與我們的猜想相一致。上述結(jié)果提示，Lbe基因在果蠅胚胎早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，我們制備的抗體能夠準(zhǔn)確反映Lbe蛋白的表達(dá)水平。

圖6 果蠅不同發(fā)育時(shí)期的Lbe蛋白表達(dá)情況Fig. 6 Expression of Lbe protein in Drosophila melanogaster at different developmental stages（a）胚胎發(fā)育到4、7、10、13和16 h時(shí) Lbe的蛋白表達(dá)；（b）果蠅胚胎、幼蟲(chóng)、成蠅階段的Lbe蛋白表達(dá)。(a) The expression level of Lbe protein in Drosophila melanogaster embryo at 4, 7, 10, 13 and 16 h; (b) The expression of Lbe protein in Drosophila melanogaster embryo, larva and adult stages.

2.4 胚胎抗體染色

為了檢測(cè)抗體能否用于免疫染色，我們用血清對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的果蠅胚胎進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)在stage 8時(shí)期，Lbe基因的表達(dá)集中在胚胎的肛板處（圖7b）。隨著發(fā)育的進(jìn)行，到stage 10時(shí)期，Lbe基因的表達(dá)在胚胎內(nèi)開(kāi)始增加，主要集中在胚胎觸角段、上下頜節(jié)段和唇部等部位，并且在胚胎邊緣的神經(jīng)母細(xì)胞中也能檢測(cè)到Lbe的表達(dá)，肛板處的表達(dá)仍然強(qiáng)烈（圖7c）。stage 11時(shí)期，Lbe基因的表達(dá)相較上一時(shí)期有了明顯回縮的趨勢(shì)，集中在上下頜節(jié)段中。值得注意的是，在位于表皮內(nèi)側(cè)的成心前體細(xì)胞中能檢測(cè)到較強(qiáng)的Lbe表達(dá)信號(hào)（圖7d）。這表明Lbe基因確實(shí)參與了成心前體細(xì)胞的發(fā)育。而在胚胎發(fā)育末期，在節(jié)段邊界肌形成細(xì)胞中與表皮內(nèi)側(cè)能檢測(cè)到廣泛的Lbe蛋白陽(yáng)性信號(hào)，并且表達(dá)Lbe蛋白的表皮內(nèi)側(cè)細(xì)胞的寬度也有所增加（圖7e）。在stage 15時(shí)期，表達(dá)Lbe蛋白的成心前體細(xì)胞有向背中線遷移的趨勢(shì)（圖7f）。這也證明了Lbe的正確表達(dá)與果蠅心管的形成密不可分。上述免疫染色結(jié)果中Lbe陽(yáng)性信號(hào)與其發(fā)育規(guī)律高度符合，表明我們制備的抗體能夠精確檢測(cè)Lbe蛋白的表達(dá)定位，可用于胚胎抗體染色，且效果良好。

圖7 Lbe多克隆抗體胚胎染色鑒定（×200）Fig. 7 Immunofluorescence identification of Lbe polyclonal antibody (×200)（a）空白血清對(duì)照組；（b）stage 8時(shí)期的野生型果蠅胚胎（發(fā)育時(shí)間為3 h 30 min）；（c）stage 10時(shí)期的野生型果蠅胚胎（發(fā)育時(shí)間為4 h 20 min）；（d）stage 11時(shí)期的野生型果蠅胚胎（發(fā)育時(shí)間為7 h）；（e）stage 15時(shí)期的野生型果蠅胚胎（發(fā)育時(shí)間為13 h）；（f）stage 13時(shí)期的野生型果蠅胚胎（發(fā)育時(shí)間為10 h）的背觀圖。圖中的胚胎均按照頭部向左，腹部向下的姿勢(shì)擺放。ap：肛板；nb：神經(jīng)母細(xì)胞；de：表皮內(nèi)側(cè)；cb：成心前體細(xì)胞；mf：節(jié)段性邊界肌形成細(xì)胞。黃色箭頭所示均為細(xì)胞類(lèi)型和特定細(xì)胞區(qū)域；白色箭頭所示為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)。(a) Blank serum control group; (b) Wild type Drosophila embryos at stage 8 (development time 3 h 30 min); (c) Wild type Drosophila embryos at stage10 (development time 4 h 20 min); (d) Wild type Drosophila embryos at stage 11 (development time 7 h); (e) Wild type Drosophila embryos at stage 15 (development time 13 h); (f) Wild type Drosophila embryos at stage 13 (development time 10 h). All whole-mounts are oriented with the anterior to the left; (f) is the back view. ap: Analplate; nb: Mandibular segment; de: Dorsal epidermis; cb: Cardioblast precursors; mf: Segmental border muscle founder cells. yellow arrow shows cell type and specific cell area; white arrow shows cell movement trendency.

3 討論

心臟作為身體內(nèi)最重要的器官之一，從早期發(fā)育階段就擔(dān)負(fù)著全身循環(huán)的功能。在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中，心臟起源于雙側(cè)中胚層的原基細(xì)胞，并且越來(lái)越多的證據(jù)表明，心臟譜系的分子控制機(jī)制在生物進(jìn)化過(guò)程中是保守的。果蠅雖然在進(jìn)化上離脊椎動(dòng)物較遠(yuǎn)，但它的心管在形態(tài)上類(lèi)似于脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育早期的線性管，其心管發(fā)育基因的同源物也在脊椎動(dòng)物心臟發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控功能。因此，本文選擇果蠅為模式生物來(lái)研究心臟發(fā)育。Lbe基因會(huì)在果蠅特定的成心細(xì)胞亞群中表達(dá)，并在心臟前體的多樣化中發(fā)揮作用。已有研究表明，當(dāng)Lbe基因被敲除表達(dá)時(shí)，果蠅心臟前體細(xì)胞的數(shù)量會(huì)減少，而過(guò)度表達(dá)Lbe將會(huì)導(dǎo)致果蠅表現(xiàn)出心臟結(jié)構(gòu)缺陷，以及心律失常、心臟停搏等癥狀［17-18］。Lbe基因在進(jìn)化上是保守的，在小鼠和人類(lèi)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)同源基因［13］。

果蠅與人體的心臟發(fā)育基因具有高度保守性，故研究果蠅心臟發(fā)育基因是探索人類(lèi)心臟發(fā)育基因的一條有效途徑。但由于市面上的果蠅心臟基因抗體難以購(gòu)得，導(dǎo)致果蠅心臟發(fā)育基因研究缺少合適的工具。本文通過(guò)DNA免疫技術(shù)成功制備了可用于Western blot和胚胎染色的果蠅Lbe基因的抗體。雖然與原核表達(dá)載體相比，血清抗體的效價(jià)略低，但DNA免疫的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)（如可以直接免疫小鼠、方法更加簡(jiǎn)便、耗時(shí)更少等）使其成為快速制備分子量較小的蛋白抗體的有效途徑之一［15-17］。Western blot和免疫染色結(jié)果表明，所制備抗體的特異性和敏感性都較好，這為將來(lái)運(yùn)用免疫共沉淀等方法研究Lbe基因調(diào)控果蠅心臟發(fā)育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。