陳小琴，雷彩霞，奚燕萍，肖 敏

（復旦大學附屬婦產科醫(yī)院上海集愛遺傳與不育診療中心，上海 200011）

卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）是垂體前葉腺體細胞分泌的一種糖蛋白激素，是人類生殖功能的核心激素之一，其生理功能的發(fā)揮必須通過與其特異性受體（FSH receptor，FSHR）的結合來完成。FSHR（MIM：136435；GenBank：NM_000145.4）可在顆粒細胞中嚴密地調控著卵泡成熟的各個階段，以應對FSH周期性的變化。FSHR蛋白是G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族的成員之一，并具有該蛋白家族典型的七次跨膜結構域［1］。

FSHR基因致病性變異可能與高促性腺激素閉經（hypergonadotropic amenorrhea）相關［2-6］，呈常染色體隱性遺傳。該病患者主要表現為女性40歲前出現持續(xù)性閉經、血促性腺激素升高、雌激素降低，可分為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）［7］和卵巢抵抗綜合征（resistant ovarian syndrome，ROS）［8-9］。POF患者的卵巢內竇狀卵泡少，無卵泡或偶見少數始基卵泡；而ROS患者的卵巢內有正常數目的始基卵泡及竇狀卵泡，且抗繆勒管激素（antimullerian hormone，AMH）值與年齡相符［10］。高促性腺激素閉經，一方面由于雌激素低下，患者表現出神經、代謝、心腦血管和骨質疏松等一系列機體的嚴重失調；另一方面，患者無排卵，表現為不孕癥。FSHR基因對男性的影響相對女性而言較小。存在FSHR純合變異的男性可能會存在不同程度的生精障礙，但并不會表現為無精或絕對的不育［6,11］。迄今為止，中國人群的FSHR基因相關變異報道較少。本研究對臨床表現為高促性腺激素閉經及不孕的患者及其家系進行全外顯子組測序及Sanger測序檢測，探討其遺傳性致病因素，期望對其家庭生育進行指導。

1 材料與方法

1.1 對象

患者，女，1992年出生，結婚2年，性生活規(guī)律，未避孕，未孕。17歲初潮后閉經，斷續(xù)人工周期治療，正常女性核型46，XX。2020年8月20日末次月經（last menstrual period，LMP），后未規(guī)范用藥，9月4日至5日有少量不規(guī)則出血2 d。2020年7月16日，激素檢測FSH為15.63 mIU/mL，黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）為8.75 mIU/mL，雌二醇（estradiol，E2）為11 pg/mL。2020年7月28日，經陰道B超提示：子宮為35 mm×34 mm×29 mm，內膜為7 mm；左卵巢為20 mm×15 mm×11 mm，卵泡直徑為4 mm；右卵巢為22 mm×15 mm×10 mm，卵泡直徑為5 mm。2020年9月23日，B超提示子宮位置后位，形態(tài)規(guī)則，肌層回聲尚均勻，大小為39 mm×36 mm×32 mm，內膜厚度為1 mm；左卵巢為17 mm×15 mm×9 mm，有2～3個直徑小于10 mm的卵泡；右卵巢為20 mm×17 mm×12 mm，有7～8個直徑小于10 mm的卵泡；右卵巢旁見一無回聲區(qū)，直徑約6 mm，邊界清，提示右卵巢旁囊腫，雙側卵巢未見明顯異常，不支持卵巢早衰（圖1）。2020年5月8日，AMH為2.43 ng/mL，屬于正常范圍?；颊哂幸唤憬銦o月經來潮，未避孕，未孕多年；患者弟弟已婚，妻子孕6月，未見明顯異常；患者父母非近親，無家族性遺傳性疾病史?；颊呒凹胰伺R床癥狀詳情見圖2及表1。本研究通過上海集愛遺傳與不育診療中心倫理委員會批準，與患者及家屬簽署了相關知情同意書。

圖1 患者雙側卵巢切面圖Fig. 1 Cross-sectional view of bilateral ovary of the patientROV：右側卵巢；LOV：左側卵巢。ROV: Right ovary; LOV: Left ovary.

圖2 FSHR基因突變家系圖Fig. 2 Family Tree of FSHR gene mutationM1表示攜帶c.392G＞A突變；M2表示攜帶c.310A＞G突變；N表示不攜帶FSHR基因變異。M1 means the person carries the c.392G＞A variant; M2 means the person carries the c.310A＞G variant; N means the person does not carry the FSHR gene variant.

表1 患者及其家人的基本信息及臨床癥狀Tab. 1 Basic information and clinical symptoms of the patient and her families

1.2 方法

1.2.1 全外顯子組測序

在獲得書面知情同意后，提取患者的外周血，使用安捷倫ClearSeq遺傳性疾病試劑盒和因美納捕獲試劑盒（TruSeq v3 Cluster and SBS Kit）進行外顯子組捕獲。在Illumina HiSeq平臺上進行全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）。臨床外顯子及其上游和下游20 bp序列的平均測序深度≥94×，富集區(qū)平均≥20×的覆蓋率為97.0%。平均覆蓋深度為55.8×，99.0%的目標DNA覆蓋10×以上［12］。主要使用Sentieon軟件套件對測序數據進行二級分析，通過Sentieon BWA與UCSC hg19參考基因組對測序數據進行比較。每個堿基的測序覆蓋率均來自所有基因組測序數據。

1.2.2 全外顯子組測序數據分析

使用明碼生物公司（https://csa.wuxinextcode.cn）的臨床測序分析系統（the clinical sequence analyzer，CSA）對測序數據進行分析，使用系統的默認設置對用戶界面、原始測序數據讀取以及基因組瀏覽器進行分析。使用系統分析可能導致蛋白質變異的純合子或者雜合子（無義、錯義、剪接位點或非編碼調控區(qū)），并用明碼生物公司的變異效應預測器（variant effect predictor，VEP）（評分≥0.9）評估其預測的有害影響［13］。VEP主要是利用蛋白功能損傷預測軟件（sorting intolerant from tolerant，SIFT）［14］和polyphen2（polymorphism phenotype）［15-16］的信息來預測變異對基因、轉錄本和蛋白質序列的影響。如果該變異在之前的同行評審出版物或公共數據庫［如人類基因突變數據庫（HGMD專業(yè)版）、ClinVar或人類孟德爾遺傳在線（online Mendelian inheritance of man，OMIM，https://omim.org/）數據庫、本地數據庫］中報告為致病性，則該變異將被標記為致病性或可能致病性。為了過濾出高頻率的變異，我們從人群頻率數據庫（gnomAD，http://gnomad.broadinstitute.org/）的公共數據集中對等位基因頻率進行了注釋。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American college of medical genetics and genomics，ACMG）的標準和指南［17］對與患者表型相關的變異進行分類。變異命名遵循人類基因組變異學會（human genome variation society，HGVS）的標準建議［18］。通過Alamut Visual軟件［版本號為v.2.15.0（19 Feb. 2020，Interactive Biosoftware，Rouen，France）］對已鑒定的變異進行可能的有害影響預測，使用Sentieon算法和NextGENe軟件（2.4.2.3版本）檢測拷貝數變異（copy number variation，CNV）。

1.2.3 Sanger驗證和共分離分析

提取并使用患者及其家屬的外周血樣本DNA，使用自動測序儀（3500XL Genetic Analyzer, Applied Biosystems，USA）從正向和反向兩個方向對家庭成員的變異進行Sanger測序驗證。外顯子編號按照參考序列NM_000145.4（10個外顯子）進行。采用Primer Premier 5.0軟件設計聚合酶鏈反應擴增引物。采用FinchTV軟件（Version 1.4.0）分析Sanger測序序列。Sanger測序所用引物有：FSHR-chr2-49217759-F1（TGGCCTCCCTATCTTTGCTAAC）、FSHR-chr2-49217759-R1（GCATCCTAATCCCCTTGTGACT）、FSHR-chr2-49244692-F1（ACCAAGTATCTCTCCACCTCCA）、FSHR-chr2-49244692-R1（CAGCAGGGAGACAGGGTTAATA）。

1.2.4 變異位點的保守性分析

使用MUSCLE（multiple sequence comparison by log-expectation）軟件［19］默認參數分析 FSHR氨基酸位點的進化保守性。

2 結果與分析

2.1 全外顯子組測序結果

基于患者的臨床表型，選用以下人類表型標準術語（human phenotype ontology，HPO）和/或在線孟德爾遺傳（online mendelian inheritance in man，OMIM）術語篩選出合適的候選致病基因：HP:0000141-Amenorrhea、HP:0000789-Infertility、HP:0008232-Elevated circulating follicle stimulating hormone level、HP:0030345-Abnormal circulating luteinizing hormone level、HP:0000137-Abnormality of the ovary、HP:0008222-Female infertility。經篩選，全外顯子組測序結果顯示，患者FSHR基因第5外顯子存在chr2: 49217759, NM_000145.4, c.392G＞A （p.Gly131Asp）錯義變異（圖3a），第4外顯子存在chr2: 49244692, NM_000145.3, c.310A＞G （p.Lys104Glu）錯義變異（圖3b）。

圖3 全外顯子組測序點突變可視化展示Fig. 3 Integrative genomics viewer for whole exome sequencing mutations（a）c.392G＞A（p.Gly131Asp）可視化展示；（b）c.310A＞G（p.Lys104Glu）可視化展示。第一行是染色體位置坐標。(a) c.392G＞A (p.Gly131Asp) integrative genomics viewer; (b) c.310A＞G (p.Lys104Glu) integrative genomics viewer. The first line is the chromosome position coordinates.

2.2 Sanger測序結果

Sanger測序發(fā)現患者母親攜帶與患者FSHR基因第5外顯子相同的完整變異（chr2: 49217759; NM_000145.4: c.392G＞A）（圖4a），其父親攜帶與患者FSHR基因第4外顯子相同的完整變異（chr2: 49244692; NM_000145.3: c.310A＞G）（圖4b），患者姐姐（圖4c）和弟弟（圖4d）檢出與患者完全相同的FSHR基因復合雜合變異。

圖4 患者父母及姐姐、弟弟FSHR基因變異位點Sanger測序的驗證結果Fig. 4 The results were verified by Sanger sequencing of the FSHR gene mutation locus of the patient’s parents, elder sister and younger brother藍色柱狀標記為變異所在位置。 The blue bars mark the location of the mutations.

2.3 變異位點生物信息學分析

生物信息學結果顯示，FSHR基因第5外顯子錯義變異c.392G＞A（p.Gly131Asp）所在位點氨基酸在不同物種中高度保守（圖5a）。根據ACMG指南［17］致病性分類可將其分為可能致病（likely pathogenic，LP）變異，證據如下。PM2：隱性基因FSHR在gnomAD外顯子組數據庫中純合子等位基因頻率數為0（gnomAD外顯子組覆蓋率為77.6%），在gnomAD基因組數據庫中未發(fā)現該變異（gnomAD基因組覆蓋率=31.5%），符合在正常對照人群數據庫中未發(fā)現的變異（或隱性遺傳病中極低頻位點）證據。PP2_Supporting：FSHR基因中的37個非VUS錯義變異中有31個致病性的變異，占比為83.8%，高于51.0%的閾值；臨床報告的93個FSHR基因變異中有33個致病性的變異，占比為35.5%，高于12.0%的閾值，所以符合對某個基因來說，如果這個基因的錯義變異是造成某種疾病的原因，并且這個基因中良性錯義變異所占的比例很小，那么在這樣的基因中所發(fā)現的新的錯義變異，可以使用PP2_Supporting證據。PP3_Supporting：基于BayesDel_addAF、DANN、EIGEN、FATHMM-MKL、LIST-S2、M-CAP、MVP、MutationTaster和SIFT的9個致病預測與PrimateAI的1個良性預測，符合多種統計方法預測出該變異會對基因或基因產物造成有害的影響的結果。PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。PP1：突變與疾病在家系中共分離（在家系多個患者中檢測到此變異）。

FSHR基因第4外顯子錯義變異c.310A＞G（p.Lys104Glu）所在位點氨基酸在不同物種高度保守（圖5b）。根據ACMG指南致病性分類可將其分為LP，證據包括PM2、PP2_Supporting、PP3_Supporting、PP4、PP1。

圖5 FSHR基因突變所在位點氨基酸在不同物種中的保守性分析Fig. 5 Analysis of conserved amino acids at the sites of FSHR gene mutations in different species （a）c.392G＞A（p.Gly131Asp）所在位點氨基酸在不同物種中的保守性分析；（b）c.310A＞G（p.Lys104Glu）所在位點氨基酸在不同物種中的保守性分析可視化展示。紅線標注列為變異所在位點氨基酸在不同物種保守性分析。(a) The conserved analysis of amino acids at the site of c.392G＞A (p.Gly131Asp) in different species; (b) The conserved analysis of amino acids at the site of c.310A＞G (p.Lys104Glu) in different species. The red line indicates the conserved analysis of amino acids at the mutation site.

基于以上分析，我們認為c.392G＞A（p.Gly131Asp）與c.310A＞G（p.Lys104Glu）的復合雜合變異是患者及其姐姐不孕的原因。

3 討論

人類FSHR基因定位于2號染色體短臂2區(qū)1帶（2p2.1），全長約54 kb，由10個外顯子與9個內含子構成，編碼FSHR蛋白。其中1～9號外顯子較短，編碼胞外區(qū)的氨基酸部分，10號外顯子負責編碼其他蛋白結構。其與生殖相關疾病關系的研究一直備受關注。FSHR基因突變存在失活突變和激活突變兩種形式。其中失活突變主要出現在早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）患者中，這些突變導致了FSHR基因功能的部分或全部喪失，對FSH的反應性減弱或缺乏。激活突變主要見于卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的研究，這些突變導致FSHR功能異?；钴S，對FSH的反應性增強。但FSHR基因突變具有顯著的種族差異，目前僅在芬蘭POI人群中報道較多，而在其他種族人群中比較罕見。

本研究檢測發(fā)現的2個FSHR基因突變均為未曾報道的新突變，豐富了FSHR基因突變譜及表型譜，同時為該家系的遺傳咨詢和生育指導提供了依據。遺傳性高促性腺激素閉經的女性患者通常表現為不孕。隨著輔助生殖技術的發(fā)展，各類促排卵方案的不斷涌現能夠幫助許多不孕家庭成功擁有自己的后代。當突變FSHR殘留部分功能時，可以嘗試用高劑量的FSH來刺激卵泡發(fā)育，但是需要告知患者預期較差；當突變FSHR完全喪失功能時，對各類促排卵方案均難以有應答。如果未明確診斷則容易造成無謂的嘗試，給患者的心理以及經濟均帶來嚴重的負擔。根據文獻報道，可以嘗試卵母細胞體外成熟培養(yǎng)來獲得成熟卵子［20］，但目前未見通過該方法患者成功生育的例子，現階段更行之有效的方案是建議患者選擇捐卵。