張 華，王 耕，王明華，華永永，樊一飛，王 蓓，袁 杰，李文仿，李 志

（1. 十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）普通外科，胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442000；2. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院普通外科，?？?570000；3. 錦州醫(yī)科大學(xué)太和研究生培養(yǎng)基地， 十堰 442000）

神經(jīng)介素U（neuromedin U，NMU）屬于平滑肌收縮多肽，因可以引起子宮（uterus）平滑肌強(qiáng)烈收縮, 故以U命名［1］。NMU及其受體神經(jīng)介素U受體1（neuromedin U receptor 1，NMUR1）廣泛分布于人體的各個(gè)器官，參與調(diào)控新陳代謝、應(yīng)激、攝食行為等多種生理功能，在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中也具有重要的作用［2］。研究表明，在口腔癌［3］、食道癌［4］、頭頸磷狀上皮細(xì)胞癌［5］以及白血病［6］等惡性腫瘤中，NMU和NMUR1的甲基化對(duì)于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有十分重要的作用。乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）是女性最常見的惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第二大原因，僅此于肺癌［7］。盡管乳腺癌的綜合治療已取得了很大的進(jìn)展，但其侵襲性生長(zhǎng)和易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)仍是導(dǎo)致死亡的重要原因之一［8-10］。因此，研究與BRCA預(yù)后相關(guān)的基因?qū)τ谠u(píng)價(jià)患者的病情和生存具有重要意義。

DNA異常甲基化是癌癥表觀遺傳學(xué)的一個(gè)基本特征。DNA甲基化相關(guān)功能元件（DNA methylation-related functional elements，DMFEs）的異?？蓪?dǎo)致腫瘤進(jìn)展中調(diào)控基因的功能障礙，從而影響癌癥患者的預(yù)后［11］。SurvivalMeth （http://bio-bigdata.hrbmu. edu.cn/survivalmeth）是由李霞教授等國(guó)內(nèi)學(xué)者［12］開發(fā)的一個(gè)研究DMFEs對(duì)癌癥預(yù)后影響的數(shù)據(jù)庫，共收集了36種癌癥包含13 371個(gè)樣本中的81個(gè)DNA甲基化譜。用戶可以用其在不同的數(shù)據(jù)集中研究他們感興趣的基因，并且可以通過自動(dòng)化分析與預(yù)后相關(guān)的DMFEs，包括甲基化水平、相關(guān)分析、臨床分析、差異分析等，從而預(yù)測(cè)癌癥的預(yù)后。本文采用SurvivalMeth在線數(shù)據(jù)庫分析NMUR1在BRCA中的甲基化狀態(tài)及其對(duì)預(yù)后的影響，旨在為NMUR1作為BRCA預(yù)后和（或）治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NMUR1在BRCA中的表達(dá)

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）［13］的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析模塊分析NMUR1在BRCA腫瘤組織和正常乳腺組織中的表達(dá)情況。

1.2 NMUR1在BRCA中表達(dá)的驗(yàn)證

采用人類蛋白質(zhì)圖譜（the human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫（https://www.protein atlas.org/）［14］中NMUR1在BRCA腫瘤組織和正常乳腺組織中表達(dá)的免疫組化結(jié)果驗(yàn)證NMUR1在BRCA中的表達(dá)情況。

1.3 NMUR1在BRCA中甲基化水平及預(yù)后相關(guān)分析

采用SurvivalMeth數(shù)據(jù)庫［12］分析NMUR1在BRCA中的甲基化水平，同時(shí)進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)（COX）回歸分析、Kaplan-Meier生存分析以及胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）島甲基化風(fēng)險(xiǎn)模型分析。在單個(gè)基因分析界面，選擇疾病類型為“Breast invasive carcinoma”，實(shí)驗(yàn)平臺(tái)選擇“450k”，輸入基因名字“NMUR1”，其中轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件、CpG相關(guān)元件、重復(fù)元素、CTCF綁定區(qū)域選擇默認(rèn)設(shè)置，即“Without Restriction”，差異分析的P值設(shè)置為0.01。采用t檢驗(yàn)分析各個(gè)探針對(duì)應(yīng)的腫瘤組織和正常乳腺組織中NMUR1甲基化水平的差異，采用COX回歸模型分析NMUR1甲基化水平對(duì)患者的生存的影響，采用Kaplan-Meier生存分析研究NMUR1甲基化水平對(duì)BRCA患者預(yù)后的影響，使用自動(dòng)化工具構(gòu)建NMUR1甲基化模型并繪制甲基化模型風(fēng)險(xiǎn)曲線，并比較分析CpG島甲基化高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者生存的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)情況

將UALCAN數(shù)據(jù)庫中來自TCGA的1 097例BRCA腫瘤組織樣本、114例正常乳腺組織樣本納入分析，結(jié)果表明，NMUR1在BRCA腫瘤組織中的表達(dá)［0.148 3（0，0.690 4）］比在正常乳腺組織中的表達(dá)［1.779 3（0.077 2，8.825 1）］下調(diào)（P＜0.001）（圖1）。

圖1 NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)情況Fig. 1 Expression of NMUR1 in BRCA tissues of and normal tissues

2.2 HPA數(shù)據(jù)庫中NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的免疫組化結(jié)果

HPA數(shù)據(jù)庫中NMUR1在BRCA和正常乳腺組織中的表達(dá)結(jié)果顯示，NMUR1在BRCA腫瘤組織中低表達(dá)（圖2a），在正常乳腺組織中高表達(dá)（圖2b）。

圖2 NMUR1在BRCA組織與正常乳腺組織中蛋白表達(dá)的免疫組化染色Fig. 2 Immunohistochemical staining of NMUR1 protein expression in BRCA tissues of and normal tissues of patients（a）BRCA組織（HPA027895）；（b）正常乳腺組織（HPA027895）。(a) BRCA tissues (HPA027895); (b) Normal tissues (HPA027895).

2.3 NMUR1在BRCA中的甲基化狀態(tài)

采用SurvivalMeth數(shù)據(jù)庫分析NMUR1在BRCA中的甲基化情況，結(jié)果顯示，有11個(gè)探針NMUR1甲基化水平有顯著差異（P＜0.001）（圖3），8個(gè)探針NMUR1甲基化水平無明顯差異（P＞0.05）。由表1可知，NMUR1在BRCA中的甲基化可能存在11個(gè)位點(diǎn)，即cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg16297948、cg17207690、cg18250832、cg18877969、cg19077400、cg21424120、cg26913833。

表1 NMUR1在BRCA中甲基化顯著差異的結(jié)果Tab. 1 The significant result of differential analysis of NMUR1 methylation in BRCA

圖3 NMUR1在BRCA組織與正常乳腺組織中甲基化水平Fig. 3 NMUR1 methylation level of different probes in BRCA and normal tissues

2.4 COX回歸分析

COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，在11個(gè)甲基化位點(diǎn)中，cg17207690位點(diǎn)NMUR1甲基化對(duì)BRCA患者有降低死亡風(fēng)險(xiǎn)的作用［風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR） =0.001 900，95%CI（5.195e-06，6.940e-01），P=0.037］，其余10個(gè)位點(diǎn)NMUR1對(duì)BRCA預(yù)后無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

表2 NMUR1甲基化對(duì)BRCA患者預(yù)后影響的COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Tab. 2 COX regression model analysis of NMUR1 methylation on prognosis in BRCA patients

2.5 NMUR1在BRCA中甲基化Kaplan-Meier生存分析

構(gòu)建NMUR1甲基化模型，按CpG島甲基化風(fēng)險(xiǎn)分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=320）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=461），并繪制CpG島甲基化模型風(fēng)險(xiǎn)曲線。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，NMUR1在乳腺癌中CpG島甲基化與乳腺癌患者生存顯著相關(guān)，甲基化高風(fēng)險(xiǎn)組患者生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組［HR=2.140 300, 95%CI （1.305 4, 3.509 1，P=0.001］（圖4）。由NMUR1甲基化模型風(fēng)險(xiǎn)曲線可知，高風(fēng)險(xiǎn)組患者的預(yù)后較低風(fēng)險(xiǎn)組差（圖5）。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組在cg18877969（P=0.015）、cg16297948（P=0.028）、cg19077400（P=0.011）、cg26913833（P=0.035）位點(diǎn)上的CpG島甲基化水平較高，在cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg17207690、cg18250832、cg21424120位點(diǎn)上，兩組的CpG島甲基化無明顯差異（P＞0.05）（圖6）。

圖4 NMUR1在BRCA中甲基化CpG島高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組的Kaplan-Meier生存曲線Fig. 4 The Kaplan-Meier survival curves of NMUR1 methylation at high and low levels of CpGs in BRCA

圖5 NMUR1在BRCA中的甲基化模型風(fēng)險(xiǎn)曲線Fig. 5 Distribution of prognostic index of NMUR1 methylation level in BRCA

圖6 NMUR1在BRCA中CpG島甲基化高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組的甲基化水平Fig. 6 Heatmap of NMUR1 CpGs methylation level in BRCA

3 討論

NMU于20世紀(jì)80年代首次在豬脊髓中發(fā)現(xiàn)，其及其受體廣泛分布于動(dòng)物體內(nèi)，具有廣泛的生理功能，并在生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［1-2］。NMU在調(diào)節(jié)平滑肌收縮、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血壓與心率、能量代謝、攝食行為、痛覺及癌癥發(fā)生發(fā)展等方面具有十分重要的作用［15］。NMU主要通過與其特異性G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs），即NMUR1和神經(jīng)介素U受體2 （NMUR2），結(jié)合來發(fā)揮作用［16］。NMUR1主要表達(dá)在胃腸道、泌尿生殖系統(tǒng)、脂肪組織、淋巴細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)、心臟、胰腺、骨髓、脾、肺、氣管、乳腺、外周血白細(xì)胞等外周器官、組織和細(xì)胞中，而NMUR2更高效地表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，多數(shù)局限在大腦的特殊區(qū)域［17］。研究表明，NMUR1的甲基化對(duì)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有十分重要的作用，包括口腔癌、食道癌、頭頸磷狀上皮細(xì)胞癌以及白血病等惡性腫瘤［18-19］。我們通過對(duì)UALCAN數(shù)據(jù)庫中來自TCGA數(shù)據(jù)庫的1 097例乳腺癌組織和114例正常乳腺組織中NMUR1的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)NMUR1在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，同時(shí)對(duì)HPA數(shù)據(jù)庫中NMUR1在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的免疫組化情況進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。

DNA的異常甲基化與多種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，研究基因甲基化也是研究腫瘤的診斷和預(yù)后，以及尋找治療相關(guān)新靶點(diǎn)、新思路的重要方法［20-21］。目前對(duì)于NMUR1在BRCA中甲基化研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本文通過SurvivalMeth數(shù)據(jù)庫研究NMUR1在BRCA中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)NMUR1上有11個(gè)位點(diǎn)甲基化水平有顯著差異；通過構(gòu)建NMUR1甲基化模型，并繪制CpG島甲基化模型風(fēng)險(xiǎn)曲線，研究NMUR1在BRCA中CpG島甲基化水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)NMUR1在BRCA中CpG島甲基化與BRCA患者生存顯著相關(guān)，且生存率與甲基化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組在cg18877969、cg16297948、cg19077400、cg26913833位點(diǎn)上的CpG島甲基化水平較高，在其他7個(gè)位點(diǎn)CpG島甲基化無明顯差異。經(jīng)過分析，我們認(rèn)為NMUR1在BRCA中的甲基化水平與BRCA患者的預(yù)后相關(guān)。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來越多學(xué)者通過生物信息分析方法研究BRCA的臨床表型、分析機(jī)制、甲基化、腫瘤微環(huán)境等，為BRCA的預(yù)后以及治療新靶點(diǎn)提供新的研究思路和方向［22-23］。國(guó)內(nèi)外生物信息學(xué)者開發(fā)并建立了TCGA數(shù)據(jù)庫、HPA數(shù)據(jù)庫、UALCAN數(shù)據(jù)庫等各種各樣的生物學(xué)數(shù)據(jù)庫，用于生物學(xué)樣本的存儲(chǔ)、下載和分析等。研究者可以通過這些數(shù)據(jù)庫里龐大的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)研究?；谏镄畔W(xué)研究方法，本文首次采用SurvivalMeth數(shù)據(jù)庫分析NMUR1在BRCA患者NMUR1甲基化狀態(tài)及臨床意義。

本文首次采用SurvivalMeth數(shù)據(jù)庫分析NMUR1在BRCA患者中的甲基化狀態(tài)及臨床意義，通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，增加了研究的可靠性，但仍需試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，且NMUR1在BRCA中甲基化及對(duì)預(yù)后影響的機(jī)制也需要進(jìn)行研究。