任春暉，王曉梅，王新玲，依明·尕哈甫，胡君萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011)

新疆鼠尾草(SalviadesertaSchang)是唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(Salvia)的一種芳香型多年生草本植物，產(chǎn)于新疆北部，生于海拔為270～1 850 m的田野荒地、溝邊、沙灘草地及林下。新疆鼠尾草也被稱為新疆丹參，在新疆分布廣泛，資源豐富。民間通常以全草入藥，具有清熱解毒、止咳祛痰、消腫利尿之功效[1]。

課題組前期研究對新疆鼠尾草進行了初步的化學(xué)成分和藥理活性研究，從中分離得到20余種化學(xué)成分，主要包括水溶性的酚酸類和脂溶性的二萜醌類、三萜類[1-3]。這些化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型與其同科同屬的丹參(Salviamiltiorrhiza)類似，而丹參的酚酸類化學(xué)成分具有治療糖尿病性心肌病[4]、糖尿病腎病(DN)[5]、糖尿病性視網(wǎng)膜病[6]等糖尿病并發(fā)癥以及抗病毒[7]和抗炎[8]等作用，丹參脂溶性化學(xué)成分則可保護心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和胰腺[9-11]?，F(xiàn)有研究證明，新疆鼠尾草的水溶性酚酸類化學(xué)成分能通過抑制腎臟組織細胞蛋白激酶C(PKC)的活性保護DN大鼠腎臟[12]，脂溶性成分則具有顯著的抗血栓作用，能增強抗血小板聚集和凝血失活[13]。課題組前期對新疆鼠尾草酚酸類化學(xué)成分的提取工藝進行了研究[14]，發(fā)現(xiàn)該提取物可明顯改善實驗性糖尿病SD大鼠的血糖、血脂紊亂，降低血清中肌酐質(zhì)量濃度及血尿素水平，對糖尿病大鼠腎臟具有一定的保護作用[15]。但課題組制備的新疆鼠尾草提取物中總酚酸質(zhì)量分數(shù)僅為68.0%，其化學(xué)組成尚需闡明。研究顯示，鼠尾草屬植物主要的酚酸類化學(xué)成分有丹參素、丹參素甲酯、原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸及丹酚酸K等，上述成分均具有抗炎、抗氧化活性[16-17]。故本文以新疆鼠尾草根中4種代表性酚酸類成分的質(zhì)量分數(shù)為指標，通過Design-Expert軟件，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計方法，優(yōu)選大孔吸附樹脂法純化新疆鼠尾草酚酸類化學(xué)成分的工藝條件，并對制備的3批樣品進行質(zhì)量控制，為闡明新疆鼠尾草酚酸類化學(xué)成分和后期藥理研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 ODS HYPERSⅡ色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國賽默飛世爾科技公司；Waters 2695高效液相色譜儀和Waters 2489雙波長紫外可見檢測器，均購自沃特世科技(上海)有限公司；KQ-500DE型離心機，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5A型離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；2HWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器有限公司；T6型新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2試藥 新疆鼠尾草，采于新疆烏魯木齊水磨溝區(qū)，由王曉梅副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬新疆鼠尾草SalviadesertaSchang的干燥根和根莖。對照品：丹參素(批號628B021)，原兒茶醛(批號1228A024)和咖啡酸(批號806D022)，均購自北京索萊寶科技有限公司；迷迭香酸(批號Y06A9K67402)，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸(批號110831-200803)，中國食品藥品檢定研究院。AB-8型、D301-12型和HP20型大孔吸附樹脂，均購自天津市光復(fù)精細化工研究所；S-8型、DM130型和D3520型大孔吸附樹脂，均購自滄州寶恩吸附材料科技有限公司；ADS-17型、HPD100型、HPD722型、HPD600型、HPD400型、HPD500型和HPD826型大孔吸附樹脂，均購自鄭州勤實科技有限公司；甲酸、鹽酸和氫氧化鈉(分析純)，均購自天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，美國Fisher Scientific公司；其余試劑均為分析純，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1新疆鼠尾草根提取物浸膏的制備以及4種酚酸類成分的質(zhì)量分數(shù)測定

2.1.1新疆鼠尾草根提取物浸膏的制備 取一定量新疆鼠尾草根粉末(過40目篩)，以25倍量體積分數(shù)為40%的乙醇加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，合并濾液，水浴蒸干得干浸膏[14]。浸膏得率為23.8%。

2.1.2溶液的制備

2.1.2.1混合對照品溶液 精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、原兒茶醛及丹參素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.01、3.02、0.98、1.00 mg·mL-1的單一對照品儲備液。精密吸取上述4種單一對照品儲備液加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為50.5、39.2、22.5、40.1 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2.2供試品溶液 取2.1項下制備的干浸膏粉末適量，用體積分數(shù)為40%的乙醇超聲溶解，離心，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3色譜條件 ODS HYPERSⅡ 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸(B)，梯度洗脫，洗脫程序為：0～10 min，20%A～25%A；10～20 min，25%A～30%A；20～25 min，30%A～35%A；25～35 min，35%A～36%A；35～37 min，36%A～47%A；37～42 min，47%A～60%A；42～47 min，60%A～80%A。流速：1 mL·min-1；檢測波長：285 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

2.1.4系統(tǒng)適用性考察 分別精密吸取2.1.2項下制備的混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，按照2.1.3項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種成分的保留時間分別為4.917、7.383、11.583、32.133 min，色譜峰之間的分離度均大于1.5，與其他組分分離完全，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)以迷迭香酸峰計算均大于3 000，符合質(zhì)量分數(shù)測定要求。

圖1 HPLC圖

2.1.5線性關(guān)系考察 吸取適量2.1.2.1項下制備的混合對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，按照2.1.3項下色譜條件分別進樣5、10、15、20、25 μL，以4種成分的質(zhì)量為橫坐標(x)、色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，回歸方程分別為y1=8×106x1+38 460(r1=0.999 2)，y2=5×107x2-40 696(r2=0.999 6)，y3=4×106x3-15 333(r3=0.999 9)，y4=2×106x4-55 878(r4=1.000 0)，4種成分分別在0.21～1.03、0.02～0.09、0.04～0.21、0.20～1.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6精密度實驗 精密吸取2.1.2.1項下制備的混合對照品溶液，按照2.1.3項下色譜條件重復(fù)進樣測定6次，結(jié)果4種成分的峰面積RSD值分別為0.54%、1.40%、1.32%、1.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性實驗 取2.1.2.2項下制備的供試品溶液，分別于配制后的 0、1、2、4、6、8 h 測定4種成分的峰面積，結(jié)果RSD值分別為0.77%、0.65%、0.32%、0.84%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8重復(fù)性實驗 按照2.1.2.2項下方法制備6份供試品溶液，按照2.1.3項下色譜條件進樣測定。結(jié)果4種成分峰面積的RSD值分別為0.49%、1.72%、1.59%、1.56%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.9回收率實驗 精密稱定2.1.1項下制備的新疆鼠尾草提取物浸膏適量，按照2.1.2.2項下方法制備9份供試品溶液，分別精密加入適量高、中、低質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，再按照2.1.3項下色譜條件進樣測定，計算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果 (n=3)

2.1.10質(zhì)量分數(shù)測定 按照2.1.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1.3項下色譜條件進樣測定，結(jié)果提取物中4種成分的質(zhì)量分數(shù)之和為1.35%。

2.2新疆鼠尾草酚酸類化學(xué)成分純化工藝的考察

2.2.1大孔吸附樹脂的預(yù)處理 取適量ADS-17、D3520、D301-12、HPD100、S-8、HPD722、HPD500、HPD600、AB-8、HPD400、HP20、DM130和HPD826共13種型號的樹脂，用體積分數(shù)為95%的乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，再用體積分數(shù)為95%的乙醇洗滌至流出液與5個柱體積(BV)水混合不顯白色渾濁，加水洗至無醇味，再用2 BV體積分數(shù)為5%的鹽酸浸泡4 h，用水洗至中性，最后用2 BV體積分數(shù)為2%的氫氧化鈉浸泡4 h，用水沖洗至中性，備用[18]。

2.2.2供試品溶液的制備 取2.1.1項下制備的新疆鼠尾草根提取物浸膏粉末適量，用體積分數(shù)為40%的乙醇超聲溶解，離心，取上清液，即得。

2.2.3樹脂的篩選 稱取1 g預(yù)處理后各種型號的大孔吸附樹脂，置于錐形瓶中，分別加入2.2.2項下制備的質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的供試品溶液10 mL，封口后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩8 h，抽濾后濾液離心，定容至10 mL，過濾，取續(xù)濾液，按照2.1.3項下色譜條件測定4種成分的質(zhì)量分數(shù)，并按照公式(1)計算樹脂的吸附率。

將上述吸附飽和的樹脂晾干后置于錐形瓶中，加入體積分數(shù)為40%的乙醇10 mL，封口后置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中振蕩8 h，抽濾后濾液離心，定容至10 mL，過濾，取續(xù)濾液，按照2.1.3項下色譜條件測定總酚酸質(zhì)量分數(shù)，并按照公式(2)計算樹脂的解吸附率。公式(1)：E=(C0-C1)÷C0×100%，公式(2)：D=[C2÷(C0-C1)]×100% (E為吸附率(%)；D為解吸附率(%)；C0、C1、C2分別為樣品溶液中總酚酸質(zhì)量濃度、吸附后溶液中總酚酸質(zhì)量濃度、解析液中總酚酸質(zhì)量濃度)。綜合考慮各型號樹脂的吸附與解吸附情況，選擇HPD600進行后續(xù)實驗。結(jié)果見表2。

表2 13種大孔吸附樹脂的吸附率和解吸附率

2.2.4單因素考察

2.2.4.1上樣質(zhì)量濃度考察 將48 mL(1 BV)按照2.2.2項下方法制備的不同質(zhì)量濃度的供試品溶液(1、10、20、30、40 mg·mL-1)分別通過HPD600樹脂柱(徑高比為1∶10)，以1 mL·min-1的流速進行動態(tài)吸附，收集流出液定容至48 mL，按照2.1.3項下色譜條件測定總酚酸的質(zhì)量濃度，計算吸附率。結(jié)果顯示，上樣液質(zhì)量濃度小于30 mg·mL-1時，吸附率隨著上樣液質(zhì)量濃度的增大而升高；而上樣液質(zhì)量濃度大于30 mg·mL-1時，吸附率隨著上樣質(zhì)量濃度的增大而下降，上樣液質(zhì)量濃度為30 mg·mL-1時吸附率達到最高，為83%。

2.2.4.2上樣量的考察 稱取處理好的30 g樹脂置于樹脂柱中(徑高比為1∶10)，取2.2.2項下制備的供試品溶液55 mL，上樣，吸附流速為1 mL·min-1。每10 mL收集1份流出液，按照2.1.3項下色譜條件測定4種成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，上樣量為40 mL時達到飽和吸附，以40 mL計算，1 g樹脂最大動態(tài)吸附約為39.10 mg總酚酸提取物。

2.2.4.3水洗用量考察 稱取適量HPD600置于樹脂柱中，取2.2.2項下制備的供試品溶液40 mL以1 mL·min-1的流速進行動態(tài)吸附，吸附完全后加6 BV蒸餾水洗脫水溶性雜質(zhì)及未吸附的提取液，收集洗脫液，每1個BV為1流份，按照2.1.3項下色譜條件進行測定，結(jié)果顯示，第3個BV中基本無酚酸，故確定水洗用量為3 BV。

2.2.4.4洗脫溶劑體積分數(shù)考察 稱取適量處理好的HPD600大孔吸附樹脂濕法裝柱，取2.2.2項下制備的供試品溶液40 mL，以1 mL·min-1流速進行動態(tài)吸附，吸附完全后加3 BV水洗脫除雜，再用10 BV體積分數(shù)分別為20%、40%、60%、80%、95%的乙醇以1 mL·min-1的流速洗脫，分別收集洗脫液并濃縮，按照2.1.3項下色譜條件測定4種成分的質(zhì)量濃度，計算洗脫率，結(jié)果顯示，乙醇體積分數(shù)為60%時，洗脫率達最大值，為51%，故選用體積分數(shù)為60%的乙醇進行洗脫。

2.2.4.5洗脫溶劑用量考察 稱取適量處理好的HPD600大孔吸附樹脂濕法裝柱，取2.2.2項下制備的供試品溶液40 mL，以1 mL·min-1的流速進行動態(tài)吸附，吸附完全后加3 BV水洗脫除雜，再用6 BV體積分數(shù)為60%的乙醇以1 mL·min-1的流速洗脫，收集洗脫液并濃縮，按照2.1.3項下色譜條件測定4種成分的質(zhì)量濃度，計算洗脫率，結(jié)果顯示，在3 BV時已基本洗脫完全，故選用3 BV體積分數(shù)為60%的乙醇進行洗脫。

2.2.4.6洗脫流速考察 稱取適量處理好的HPD600大孔吸附樹脂裝3根樹脂柱，取2.2.2項下制備的供試品溶液40 mL，以1 mL·min-1的流速進行動態(tài)吸附，吸附完全后加3 BV水洗脫除雜，再分別用3 BV體積分數(shù)為60%的乙醇以0.5、1、2 mL·min-1的流速洗脫，收集洗脫液并濃縮至50 mL，按照2.1.3項下色譜條件測定總酚酸質(zhì)量濃度，并精密量取各流速的洗脫液45 mL水浴蒸干，稱定質(zhì)量后計算得總酚酸質(zhì)量分數(shù)分別為2.70%、2.55%、2.69%。結(jié)果表明，洗脫流速為0.5 mL·min-1時，總酚酸質(zhì)量分數(shù)最高。

2.2.5響應(yīng)面法優(yōu)選純化工藝 根據(jù)單因素考察結(jié)果，以4種成分質(zhì)量分數(shù)為考察指標，選取上樣液質(zhì)量濃度、洗脫劑體積分數(shù)和洗脫流速3個因素，設(shè)計3因素3水平實驗方案，見表3。

表3 因素與水平

通過Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面分析軟件設(shè)計實驗，共17組。通過軟件對表3的數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到質(zhì)量分數(shù)與各因素水平間的二次多項式方程：R=0.035+1.887×10-3A-8.159×10-3B-2.212×10-3C-2.150×10-3AB+3.711×10-4AC+1.970×10-3BC-8.125×10-4A2+4.513×10-3B2-2.475×10-3C2。設(shè)計方案見表4。方差分析結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面設(shè)計方案

由表5可知，各因素對吸附率的影響順序依次為：B(洗脫劑體積分數(shù))>C(洗脫流速)>A(上樣液質(zhì)量濃度)。模型回歸分析結(jié)果顯示，模型P=0.000 7<0.01，表示差異極顯著，失擬項P=0.362 6>0.05，表示差異不顯著，說明實驗設(shè)計擬合度良好，誤差小；同時決定系數(shù)R2=0.953 0，說明實驗可靠性較好，模型可用于分析和預(yù)測大孔吸附樹脂吸附新疆鼠尾草總酚酸的能力。為更直觀地反映各因素與響應(yīng)值的關(guān)系，繪制了各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖2。通過軟件分析計算得出最佳純化條件為：上樣液質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1，洗脫劑體積分數(shù)為40%，洗脫流速為0.67 mL·min-1。在此條件下4種成分最大理論質(zhì)量分數(shù)之和為5.22%。

圖2 響應(yīng)面圖

表5 方差分析結(jié)果

2.2.6驗證實驗 按照響應(yīng)面法優(yōu)化出的純化工藝進行驗證實驗，即上樣液質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1，上樣體積為40 mL進行吸附，吸附飽和用3 BV水以1 mL·min-1流速洗脫，再用3 BV體積分數(shù)為40%的乙醇以0.67 mL·min-1流速洗脫，收集洗脫液后濃縮蒸干，即得總酚酸純化物，得率為67.6%。按照2.1.3項下方法測定丹參素、原兒茶醛、咖啡酸及迷迭香酸4種成分的質(zhì)量分數(shù)，平行測定3次，其質(zhì)量分數(shù)之和為5.92%，相較于純化前增加了4.4倍，表明HPD600大孔吸附樹脂對新疆鼠尾草總酚酸有純化作用，是有效的純化材料。

3 討論

據(jù)文獻報道，酚酸類化合物丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸等是鼠尾草屬植物的主要活性成分，都具有一定的抗炎、抗氧化作用，能較好地清除體內(nèi)自由基[19]。其中丹參素能降低H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞損傷中丙二醛(MDA)的質(zhì)量分數(shù)，提高超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加細胞清除氧自由基的能力[20]；原兒茶醛能顯著降低紫外線照射的人真皮成纖維細胞(HDF)細胞內(nèi)活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)和前列腺素(PGE2)的水平，還可抑制環(huán)氧合酶(COX-2)的表達[21]；咖啡酸、迷迭香酸因其具有鄰二酚羥基，可通過抑制ROS的產(chǎn)生，升高SOD和谷胱甘肽(GSH)水平，改善小鼠氧化性肺損傷中肺組織的病理變化，發(fā)揮保護作用[22-23]。結(jié)合DN的發(fā)病機制，推測新疆鼠尾草的酚酸類化學(xué)成分可能通過抗氧化具有一定防治DN的作用[11，14]。故本實驗采用HPLC法同時檢測上述4種具有代表性結(jié)構(gòu)的酚酸類化合物作為優(yōu)化純化工藝的指標。鑒于對新疆鼠尾草化學(xué)成分的研究尚不完善，本研究擬進一步闡明純化物的化學(xué)組成。

通過考察ADS-17、D3520、D301-12、HPD100、S-8、HPD722、HPD500、HPD600、AB-8、HPD400、HP20、DM130及HPD826 13種不同型號和極性的大孔吸附樹脂對新疆鼠尾草總酚酸的靜態(tài)吸附及解吸附功能，最終選擇HPD600大孔吸附樹脂進行單因素實驗。研究表明，新疆鼠尾草的有效成分包括水溶性化學(xué)成分和脂溶性化學(xué)成分[24]，水溶性化學(xué)成分中主要是極性較大的酚酸類化學(xué)成分，而HPD600為極性吸附樹脂，洗脫溶劑為極性較大的乙醇，便于酚酸類化學(xué)成分的洗脫，因此HPD600型大孔吸附樹脂適用于新疆鼠尾草酚酸類化學(xué)成分的純化。

在考察洗脫溶劑的體積分數(shù)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇體積分數(shù)達到60%時，洗脫率最高(51%)，當(dāng)乙醇體積分數(shù)從20%增加到60%時，洗脫率增加，當(dāng)乙醇體積分數(shù)大于60%時，解吸能力下降。因為水溶性酚酸需要一定的含水環(huán)境，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，酚酸很難被溶出，解吸率也較低。

本實驗篩選出的純化工藝能有效去除雜質(zhì)，純化有效成分。純化物中4種成分的質(zhì)量分數(shù)之和為5.92%。綜上所述，該純化工藝操作簡單，參數(shù)準確可靠，經(jīng)濟環(huán)保，為新疆鼠尾草總酚酸后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。