肖會(huì)敏，張 妍，楊 旭，李 捷，林 奮，羅定強(qiáng)，王四旺

(1.陜西鳳丹正元生物科技有限公司研發(fā)部，西安 710077；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽(yáng) 712046；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥與天然藥物教研室，西安 710032；4.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710061；5.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安 710069)

牡丹葉為毛茛科植物牡丹PaeoniaAndr.的干燥葉，其在歷代本草和現(xiàn)代醫(yī)藥著作中均未記載，民間常用于治療痢疾，主產(chǎn)于陜西、山東、安徽、河南等地，秋季采收[1]。牡丹葉中含有苷類(lèi)、多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)等成分，苷類(lèi)如芍藥苷、羥基芍藥苷等，多酚類(lèi)如沒(méi)食子酸、鞣花酸、沒(méi)食子酸甲酯等[2-6]。現(xiàn)代藥理研究表明，牡丹具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、降尿酸、抑菌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、清除自由基、抗氧化、緩解痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等多種藥理作用[7-13]。牡丹葉中芍藥苷對(duì)輻射損傷內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，可改善認(rèn)知功能障礙及抑郁焦慮等[14-16]。牡丹葉中的鞣花酸可改善阿爾茨海默病引起的學(xué)習(xí)和記憶障礙與腎缺血再灌注引起的大鼠腎損傷[17-18]?，F(xiàn)行山東省牡丹葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏含量檢測(cè)項(xiàng)，同時(shí)藥材薄層色譜法 (TLC) 鑒別項(xiàng)目在不同產(chǎn)地實(shí)驗(yàn)中難以重現(xiàn)，陜西省是牡丹種植大省，資源豐富。因此，亟需建立一種更加全面、科學(xué)的牡丹葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)其質(zhì)量。本文通過(guò)不同產(chǎn)地藥材建立定量指標(biāo)(芍藥苷與鞣花酸)與定性指標(biāo)(芍藥苷TLC鑒別)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UFLC-20AD-PDA型高效液相色譜儀，日本島津公司；Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典N(xiāo)OBEL公司；XPE105型電子分析天平，梅特勒-托利多公司；KQ-5200D型數(shù)控超聲波發(fā)生器，昆山超聲儀器有限公司；HWT-6B型恒溫水浴箱，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.2試藥 甲醇、乙腈(HPLC級(jí))，美國(guó)Fisher公司；超純水，自制；香草醛和硫酸(分析純)，均購(gòu)自天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司。對(duì)照品：芍藥苷(批號(hào)110736-202044，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%);鞣花酸(批號(hào)111959-201903，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.8%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。牡丹葉對(duì)照藥材(批號(hào)202105-001)，由陜西省食品藥品監(jiān)督研究院提供；牡丹葉(山東菏澤、陜西合陽(yáng)、陜西蒲城、陜西西安)，均由陜西鳳丹正元生物科技有限公司提供，經(jīng)羅定強(qiáng)主任藥師鑒定為毛茛科植物牡丹PaeoniaAndr.的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1牡丹葉中芍藥苷的TLC鑒別 取牡丹葉樣品粉末1 g，加石油醚(30～60 ℃)50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，棄濾液，收集藥渣，揮干石油醚，加丙酮50 mL，超聲(功率300 W，頻率50 kHz)處理30 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加丙酮制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。依據(jù)文獻(xiàn)方法[1，19-20]，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以體積分?jǐn)?shù)為5%的香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同藍(lán)紫色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 牡丹葉中芍藥苷的TLC鑒別

2.2牡丹葉的TLC鑒別 取牡丹葉樣品粉末，加石油醚(30～60 ℃)20 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，棄去濾液，藥渣揮去石油醚，加丙酮25 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，將濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取牡丹葉對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照TLC法(《中國(guó)藥典》2020年版四部通則0502)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吸取上述2種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，用碘蒸氣熏蒸2 min。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)[1]。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 牡丹葉TLC鑒別

2.3芍藥苷與鞣花酸的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈(A)-0.85 g·L-1磷酸 (B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，見(jiàn)表1。檢測(cè)波長(zhǎng)為234 nm；柱溫為30 ℃；流速為0.8 mL·min-1；理論塔板數(shù)按照芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取芍藥苷、鞣花酸對(duì)照品2.61、4.02 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 取牡丹葉樣品粉碎，過(guò)4號(hào)篩，精密稱(chēng)取1 g，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇50 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)60 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍 分別精密量取2.3.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 mL，分別置于2 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得系列混合對(duì)照品溶液1～5。進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，考察對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)與峰面積(y)的線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果芍藥苷、鞣花酸的線(xiàn)性方程分別為y1=9 837.2x1-5 905.7(r1=0.999 8)，y2=20 532x2+7 336.2(r2=0.999 8)；質(zhì)量濃度分別在2.53～126.32、3.57～178.49 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液3，連續(xù)測(cè)定6次，進(jìn)樣測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果芍藥苷、鞣花酸峰面積的RSD值分別為1.42%、1.09%，表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.3.4項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液3，分別于0、0.5、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果芍藥苷與鞣花酸的RSD值分別為1.12%、0.99%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取牡丹葉樣品(陜西合陽(yáng))1 g，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取含量已知的樣品(陜西合陽(yáng))9份，每份1 g，分別添加混合對(duì)照品溶液2.5、5.0、7.5 mL(取芍藥苷、鞣花酸對(duì)照品77.48、52.93 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻即得2種成分質(zhì)量濃度分別為1.50、0.94 mg·mL-1的混合對(duì)照溶液)，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明該方法回收率良好。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.3.9樣品含量測(cè)定 測(cè)定4個(gè)不同產(chǎn)地藥材中芍藥苷與鞣花酸的含量，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4、圖3和圖4。

圖3 HPLC圖

表4 4個(gè)不同產(chǎn)地藥材中芍藥苷與鞣花酸的含量

圖4 目標(biāo)物光譜圖

3 討論

3.1TLC鑒別 牡丹為毛茛科芍藥屬多年生落葉灌木，牡丹葉化學(xué)成分復(fù)雜，主要成分為苷類(lèi)、酚類(lèi)和黃酮類(lèi)等[3]。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[1]中牡丹葉的TLC鑒別的制樣方法、展開(kāi)方法及顯色方法，結(jié)果(見(jiàn)圖2)與文獻(xiàn)結(jié)果不一致，即TLC中間斑點(diǎn)未顯示或不清晰或不同產(chǎn)地不一致，表明該方法重復(fù)性不理想，因此未列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；再依據(jù)文獻(xiàn)[19]中白芍的TLC展開(kāi)系統(tǒng)與顯色方法，對(duì)制樣方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)果(見(jiàn)圖1)不同產(chǎn)地供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰明顯，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性較好，故將其列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2含量測(cè)定 對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行摸索，比較了不同柱溫(40、35、30、25、20 ℃)、不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)、不同色譜洗脫系統(tǒng)[不同質(zhì)量濃度的磷酸(0、0.85、1.70、3.40、6.80、8.50 g·L-1)-甲醇或乙腈酸]、不同進(jìn)樣量(20、10 μL)、不同制樣方法如超聲(15、30、45、60 min)、加熱回流(15、30、45、60 min)以及不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇或乙醇(40%、50%、60%、70%、80%、100%)，最終建立了制樣簡(jiǎn)單、靈敏可靠、操作方便、重復(fù)性與穩(wěn)定性良好的HPLC法測(cè)定牡丹葉中芍藥苷與鞣花酸的含量，可列入標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，把具有良好重復(fù)性與穩(wěn)定性的含量測(cè)定項(xiàng)(即芍藥苷與鞣花酸的含量測(cè)定)以及專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便的TLC鑒別項(xiàng)(即芍藥苷的鑒別)列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以很好地評(píng)價(jià)與控制牡丹葉的質(zhì)量。