趙中霞，劉 宏，陳海霞，高向群，蔡亞琳

(1.石家莊市第八醫(yī)院精神五科，石家莊 050081；2.石家莊市第三醫(yī)院藥劑科，石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科，石家莊 050000)

慢性乙型肝炎是我國(guó)常見(jiàn)的慢性傳染病之一，嚴(yán)重危害人民健康，中藥制劑治療慢性乙型肝炎在我國(guó)應(yīng)用廣泛[1]。乙肝寧顆粒是由黃芪、金錢(qián)草、茵陳、蒲公英、制何首烏、牡丹皮和川楝子等13味藥材經(jīng)煎煮、過(guò)濾、濃縮、制粒等工藝加工制成的中藥顆粒劑，具有補(bǔ)氣健脾、活血化瘀、淸熱解毒的功效，臨床主治慢性肝炎，屬脾氣虛弱、血瘀阻絡(luò)、濕熱毒蘊(yùn)證，癥見(jiàn)脅痛、腹脹、乏力、尿黃，對(duì)急性肝炎屬上述證候者有一定療效；方中茵陳有清利濕熱、利膽退黃等功效[2-5]，金錢(qián)草有利濕退黃、利尿通淋、解毒消腫等功效[6-9]，蒲公英有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋等功效[10-13]；由于我國(guó)慢性乙型肝炎患者眾多，乙肝寧顆粒臨床應(yīng)用極為廣泛，因此加強(qiáng)對(duì)乙肝寧顆粒中藥制劑的質(zhì)量控制，具有積極意義[14-21]；乙肝寧顆粒收載于《中國(guó)藥典》2020年版中，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定[22]黃芪甲苷，含量測(cè)定項(xiàng)目單一，不能更好地控制乙肝寧顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量；故本研究采用RP-HPLC法測(cè)定乙肝寧顆粒中綠原酸、槲皮素和咖啡酸的含量。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，包括G1322A型在線(xiàn)脫氣機(jī)、G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B型PDA檢測(cè)器、OPEN-LAB 色譜工作站(美國(guó)安捷倫公司)；Phenomenex SuperLu C18液相色譜柱(美國(guó)菲羅門(mén)公司)；FA2104型電子分析天平(上海潤(rùn)昕公司)；KQ-600BY型超聲波清洗機(jī)(濟(jì)寧科強(qiáng)超聲檢測(cè)儀器有限公司)；Milli-Q A10 型超純水處理器(美國(guó)密理博公司)。

1.2試藥 乙肝寧顆粒(規(guī)格：17 g·袋-1，批號(hào)分別為20181106、20190305、20190415)，九芝堂股份有限公司。對(duì)照品：綠原酸(批號(hào)110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.8%)，槲皮素(批號(hào)100081-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%)，咖啡酸(批號(hào)110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Merck公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠(chǎng)；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Phenomenex SuperLu C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：乙腈(A)-3 mL·L-1磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，7%A；5～26 min，7%A～65%A；26～28 min，65%A～7%A；28～35 min，7%A)；檢測(cè)波長(zhǎng)：341 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 取3種成分對(duì)照品，加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇制備成質(zhì)量濃度分別為3 872、2 991、399.2 μg·mL-1的單一對(duì)照品溶液，精密移取3種單一對(duì)照品溶液各1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2混合對(duì)照品溶液 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液 取乙肝寧顆粒，研成細(xì)粉，混勻，精密稱(chēng)取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理20 min(超聲功率200 W，頻率60 Hz)，放冷至室溫，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液 根據(jù)乙肝寧顆粒制備方法和藥材配比比例，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備缺茵陳、金錢(qián)草和蒲公英的單一陽(yáng)性對(duì)照溶液以及分別缺少3種藥材的陰性對(duì)照溶液。

2.2.5空白溶液 按照2.2.3項(xiàng)下方法制備不含供試品的空白溶液。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)按照綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，分離度均大于1.5，基線(xiàn)分離良好。見(jiàn)圖1。

2.3.2專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照溶液在與綠原酸、槲皮素和咖啡酸相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明該方法專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

2.3.3線(xiàn)性關(guān)系考察 精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別加體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇定容至刻度，搖勻，制成系列混合對(duì)照品溶液；按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖；以待測(cè)成分峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種成分線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.3.4回收率實(shí)驗(yàn) 取乙肝寧顆粒(批號(hào)20181106)，研成細(xì)粉，混勻，精密稱(chēng)取1.0 g，共6份，置于具塞錐形瓶中；分別加入2.2.1項(xiàng)下制備的3種單一對(duì)照品溶液，后續(xù)按照2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行前處理，得加標(biāo)供試品溶液6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算3種成分的平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取乙肝寧顆粒(批號(hào)20181106)，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置0、2、4、6、12、24 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算得3種成分峰面積RSD值分別為1.5%、1.2%、1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次乙肝寧顆粒(批號(hào)20181106)，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算3種待測(cè)成分的含量，根據(jù)6次檢測(cè)結(jié)果計(jì)算RSD值。結(jié)果3種成分含量的RSD值分別為1.9%、1.6%、2.1%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖；根據(jù)6次峰面積測(cè)定值計(jì)算RSD值，結(jié)果3種成分峰面積RSD值分別為1.7%、1.3%、2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4樣品含量檢測(cè) 取乙肝寧顆粒，按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積計(jì)算樣品中3種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別取3種成分對(duì)照品，按照2.2.1項(xiàng)下方法配制成質(zhì)量濃度均為5.0 μg·mL-1的單一對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果3種成分分別在328、324、359 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液和供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，設(shè)定采集波長(zhǎng)范圍為320～360 nm，分別采集色譜圖；實(shí)驗(yàn)證明，檢測(cè)波長(zhǎng)為341 nm時(shí)，3種待測(cè)成分響應(yīng)良好，定量結(jié)果準(zhǔn)確，陰性對(duì)照無(wú)干擾。光譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 紫外光譜圖

3.2流動(dòng)相的選擇 保持其他色譜條件不變，分別選擇甲醇-水、乙腈-水、甲醇-3 mL·L-1磷酸和乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相體系進(jìn)行比較，結(jié)果采用等度條件時(shí)，待測(cè)成分與未知雜質(zhì)峰重疊，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，故實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫法。選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相時(shí)，3種成分色譜峰峰形尖銳，分離度均大于1.5，陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-3 mL·L-1磷酸作為流動(dòng)相。

3.3提取方法的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選擇甲醇以及體積分?jǐn)?shù)分別為95%、75%、50%的甲醇作為提取溶劑，超聲10、15、20、25、30 min進(jìn)行提取效果比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用體積分?jǐn)?shù)為75%的甲醇超聲20 min時(shí)，對(duì)乙肝寧顆粒中3種成分的提取效果最佳，提取率大于90%，且基質(zhì)干擾較小，定量結(jié)果準(zhǔn)確。

綜上所述，本研究建立了能同時(shí)測(cè)定乙肝寧顆粒中3種成分含量的RP-HPLC法，該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，可用于乙肝寧顆粒的質(zhì)量控制，為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。