李 格，張 靜，韓福國，郝艷麗，范雪梅，趙重博，劉清飛*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046；2.清華大學(xué)藥學(xué)院，北京 100084)

紫姜為多年生姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的根莖，主產(chǎn)于泰國北部和東北部、老撾、東南亞一帶，又稱泰國人參，因其呈深紫色至黑色，故又稱為黑姜[1]。紫姜具有悠久的應(yīng)用歷史，主治炎癥、潰瘍、痛風(fēng)、變態(tài)反應(yīng)、胃腸功能紊亂等多種疾病[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，紫姜的藥理作用主要包括抗炎、抗癌、抗變態(tài)反應(yīng)、抗菌和抗高血壓等，這與其所含活性成分甲氧基黃酮類成分有關(guān)[3-4]，但關(guān)于紫姜中黃酮類成分的提取工藝未見相關(guān)報道。

為了進(jìn)一步對紫姜中黃酮類成分進(jìn)行深入研究，有效開發(fā)利用紫姜資源，本實驗采用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論，進(jìn)行多指標(biāo)綜合評價，對紫姜黃酮類成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。其優(yōu)點在于響應(yīng)面法可連續(xù)對實驗各因素水平進(jìn)行分析，能夠?qū)⒏饕蛩鼐哂写硇缘臈l件進(jìn)行組合實驗，回歸擬合各因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系并進(jìn)行分析，給出三維立體曲面圖[5-6]，更直觀地觀察出優(yōu)化區(qū)域，選擇實驗設(shè)計中的優(yōu)化條件[7]。信息熵理論作為一種客觀評價提取工藝的新方法，將多項評價指標(biāo)綜合成單一的度量指標(biāo)，對多指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，從而確定最佳工藝參數(shù)[8]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RT-12SF型粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；MS104S型分析天平(寧波新芝生物科技股份有限公司)；LD5-2B型離心機(北京京立離心機有限公司)；Milli-Q型超純水儀(美國Milipore公司)。

1.2試藥 紫姜藥材購于廣西楷泰生物科技有限公司(批號201805)，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳曦研究員鑒定為姜科植物小花山柰(Kaempferiaparviflora)的干燥根莖。對照品：3′，4′，5，7-四甲氧基黃酮(批號A13O11W127279，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)；3，5，7-三甲氧基黃酮(批號Y06N11W130397，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)；3，5，7，4′-四甲氧基黃酮(批號Y16O11W127642，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。5，7，4′-三甲氧基黃酮對照品(批號C116685430，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，上海麥克林生化科技有限公司；5，7-二甲氧基黃酮對照品(批號201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%)，上海一基實業(yè)有限公司；3，5，7，3′，4′-五甲氧基黃酮對照品(批號DL019201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%)，北京盈澤納新化工技術(shù)研究院與北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司聯(lián)合研制；乙腈(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；甲酸(色譜純)，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 紫姜中6種黃酮類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1HPLC法測定6種黃酮類成分含量

2.1.1色譜條件 Lichrospher RP-18 endcapped色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：0.5 mL·L-1甲酸(A)-0.5 mL·L-1甲酸乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，38%B；10～20 min，38%B～40%B；20～35 min，40%B；35～50 min，40%B～44%B；50～55 min，44%B～38%B；55～60 min，38%B)。流速：0.8 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm，進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

圖2 HPLC圖

2.1.2混合對照溶液的制備 精密稱取6種成分的對照品適量，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為102.00、296.25、213.00、262.50、102.50、86.80 μg·mL-1的混合對照品溶液，混勻后置于4 ℃冰箱中冷藏，備用。

2.1.3供試品溶液的制備 取紫姜干燥藥材，粉碎，過4號篩，精密稱定藥材粉末1 g，置于具塞錐形瓶中，按照液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，超聲提取2次，以3 500 r·min-1離心10 min，合并上清液，上清液即為供試品溶液，4 ℃冷藏保存。取供試品溶液適量，置于2 mL EP管中稀釋一定倍數(shù)，用0.45 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

2.1.4線性關(guān)系考察 精密稱取6種對照品適量，加乙醇制成質(zhì)量濃度分別為200.0、592.5、426.0、523.0、205.0、108.5 μg·mL-1的混合對照品溶液，用乙醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)行檢測分析，記錄峰面積值。將所得峰面積(y)與各對照品質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 甲氧基黃酮類成分的回歸方程及線性范圍

2.1.5精密度實驗 精密吸取2.1.2項下制備的混合對照品溶液，按照2.1.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各組分峰面積。計算6種成分峰面積RSD值依次為0.69%、0.68%、0.50%、0.71%、0.78%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性實驗 精密稱取同一批供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。計算6種成分峰面積RSD值分別為0.36%、0.15%、0.27%、0.72%、0.27%、0.13%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復(fù)性實驗 取紫姜藥材粉末，按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，并按照2.1.1項下色譜條件依次進(jìn)樣6次。計算6種成分峰面積RSD值分別為0.35%、0.45%、0.34%、0.44%、0.79%、0.15%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8回收率實驗 精密稱取含量已知的紫姜粉末6份，每份1 g，按照2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，精密加入等量的對照品，按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣3次。計算6種成分的平均回收率依次為101.17%、100.98%、107.54%、101.50%、104.81%、101.34%。RSD值分別為0.03%、0.03%、0.00%、0.02%、0.01%、0.01%，表明該方法回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

2.2甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝單因素考察 為了優(yōu)化紫姜中6種主要甲氧基黃酮類成分超聲提取工藝，分別對乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時間進(jìn)行單因素考察，按照2.1.3項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進(jìn)樣分析。

2.2.1乙醇體積分?jǐn)?shù)考察 固定液料比為25∶1，超聲時間為50 min，設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。以各成分的含量對乙醇體積分?jǐn)?shù)作圖，見圖3A。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，各成分含量趨勢基本一致，乙醇體積分?jǐn)?shù)在20%～50%時，各成分含量呈上升趨勢，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%時，各成分含量趨平。故選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%進(jìn)行優(yōu)化考察。

2.2.2液料比考察 固定超聲時間為50 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，設(shè)置液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1，各成分的含量對液料比作圖，見圖3B。由圖3B可知，隨著液料比的增大，各成分含量趨勢基本一致。當(dāng)液料比在5∶1～10∶1時，各成分含量呈上升趨勢，當(dāng)液料比在10∶1～40∶1時，各成分含量幾乎未變。故選取液料比在5∶1～15∶1范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化考察。

2.2.3超聲時間考察 固定液料比為10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，設(shè)置超聲時間分別為20、30、40、50、60、70、80、90 min，各成分的藥材百分含量對超聲時間作圖，見圖3C。由圖3C可知，當(dāng)超聲時間在20～30 min時，只有3種成分含量有明顯的增加，當(dāng)超聲時間在30～90 min時，只有1種成分在70 min時含量有明顯的增加，其他化合物的含量幾乎不變。出于實際生產(chǎn)考慮，選擇超聲時間在30 min較為合適，故選取超聲20～40 min進(jìn)行優(yōu)化考察。

圖3 不同因素對提取效果的影響

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化紫姜中甲氧基黃酮類成分 參考有關(guān)中藥中總黃酮的提取工藝[9-14]，結(jié)合單因素考察結(jié)果，設(shè)定各因素最佳取值范圍，采用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論對該工藝進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3.1響應(yīng)面實驗設(shè)計 根據(jù)響應(yīng)面組合實驗原理，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)和超聲時間(C)為考察因素，以6種甲氧基黃酮類成分在的含量計算所得綜合評分(M)為評價指標(biāo)，采用三因素三水平響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化實驗設(shè)計，因素與水平見表2，方案與結(jié)果見表3。由于提取次數(shù)不是連續(xù)變量因素[14]，故將其設(shè)置為2次。

表2 響應(yīng)面實驗因素與水平

2.3.2M值的計算 以紫姜中6種主要的甲氧基黃酮類成分的含量為指標(biāo)，采用信息熵法[15]，計算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)和M值，建立原始評價指標(biāo)矩陣(Xij)mn，對表中數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，建立概率矩陣(Pij)mn，將原始評價矩陣轉(zhuǎn)為“概率矩陣”。

計算每項指標(biāo)的信息熵，得到評價指標(biāo)的信息熵Hi={0.999 8、0.997 3、0.998 2、0.998 3、0.997 9、0.998 0}；計算第i項指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Wi={0.019 0、0.257 1、0.171 4、0.161 9、0.200 0、0.190 5}；計算M值。

(Mi為6種成分含量，Mimax為各成分的最高含量，Wi為各成分權(quán)重系數(shù))。結(jié)果見表3。由表3可知M值在0.670～0.987之間。

2.3.3模型擬合與方差分析 通過Design-Expert 10.0.7軟件分析實驗結(jié)果，以M作為響應(yīng)值，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)和超聲時間(C)的二項式回歸擬合方程。

M=0.96+0.06A+0.089B-0.012C-0.016AB-9.325×10-3AC-8.45×10-3BC-0.013A2-0.1B2-0.019C2

方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，模型F值為62.19，整體模型的顯著水平為P<0.000 1，表示此回歸模型極顯著，說明各指標(biāo)和M值的關(guān)系可以運用此模型來函數(shù)化；失擬項F=6.85，P=0.047 0<0.05，可用該方程代替真實實驗進(jìn)行分析，同時從軟件分析數(shù)值可以得到模型的R2為0.987 6，Radj2為0.971 8，說明回歸方程的擬合度良好；差異系數(shù)為1.79，實驗精確度良好，以上數(shù)據(jù)表明，該模型可以很好地被用來預(yù)測紫姜中主要黃酮類成分的提取工藝的優(yōu)化。因素A、B、B2以及C2對M值的影響極為顯著(P<0.000 1)，而因素C、A2以及交互項AB、AC、BC對M值影響無顯著差異(P>0.05)。

2.3.4兩兩因素交互作用分析 利用Design-Expert 10.0.7軟件對表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到兩兩因素的交互作用對M值影響的響應(yīng)面圖與等高線圖，結(jié)果見圖4。利用響應(yīng)面圖可以對影響M值的任意2個因素的交互效應(yīng)進(jìn)行分析與評價，曲面陡峭呈鐘罩形即表示交互作用顯著，曲面平滑則相反，等高線圖的形狀可反映交互效應(yīng)的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反。

圖4 各因素交互作用對綜合評分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖4可知，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，隨著液料比的增加，M值呈先升后降的趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%、液料比為11∶1～15∶1時，M值最高。固定液料比，M值隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加呈增高趨勢，而提取時間對M值的影響并不明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%、提取時間為20～25 min時，M值最高。由相應(yīng)的等高線圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)所呈現(xiàn)的等高線分布較為密集，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)對M值的影響較提取時間大，根據(jù)等高線的橢圓規(guī)則來判斷乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間有較為顯著的交互作用，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)不變時，提取時間的增加對M值大小的影響并不明顯，可能原因是部分甲氧基黃酮類化合物在超聲過程中結(jié)構(gòu)受到了破壞或發(fā)生轉(zhuǎn)變，故提取時間不宜過長。固定提取時間，隨著液料比的增加，M值呈先升后降的趨勢，在液料比為11∶1～15∶1、提取時間為20～25 min時，M值最高。通過模擬分析優(yōu)化工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，液料比為11.93∶1，提取2次，每次23.41 min，預(yù)測M值為1.024，考慮到生產(chǎn)實際操作，最終將其確定為乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，液料比為12∶1，提取2次，每次25 min。

2.3.5優(yōu)化工藝驗證 精密稱取3份藥材，每份1.0 g，按照2.3.4項下優(yōu)化工藝提取，其驗證結(jié)果M值為0.994，RSD值為0.34%，在此條件下，6種成分的提取率分別為0.09%、0.71%、2.89%、1.22%、0.40%、0.49%，總提取率為5.80%，驗證實驗M值與模型預(yù)測值高度接近，表明模型準(zhǔn)確可信，可用此方法提取紫姜中6種甲氧基黃酮類成分。

3 討論

黃酮類化合物是一大類天然有機產(chǎn)物，廣泛存在于植物中，是許多中草藥的有效成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎鎮(zhèn)痛、抗衰老[16]等多種生物活性，是國內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點[17]。甲氧基黃酮類化合物是紫姜的主要成分[18-19]，脂溶性較好，易吸收，含有多個甲氧基獨特結(jié)構(gòu)，在抗癌活性的篩選過程中較其他黃酮顯現(xiàn)出更強的抗癌活性[20]。為了更好地開發(fā)利用紫姜資源，有必要對紫姜中甲氧基黃酮進(jìn)行更加深入、系統(tǒng)地研究。

文中運用響應(yīng)面法結(jié)合信息熵理論對紫姜中的主要成分進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化。響應(yīng)面法通過擬合二次多項數(shù)學(xué)方程構(gòu)建響應(yīng)曲面，用較少的實驗次數(shù)對其交互作用進(jìn)行全面的分析[21]，通過對乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時間的多元回歸及二項擬合建立M值與各因素的回歸方程，計算紫姜中各指標(biāo)的含量變化規(guī)律。但對于多變量的研究，單純的運用響應(yīng)面法并不能精確地構(gòu)造用于確定性分析的近似多項式。因此，本實驗聯(lián)合運用信息熵理論，分析各因素的交互作用，更加客觀、清楚地反映出各成分在不同提取條件下的變化規(guī)律，篩選出優(yōu)化工藝，提高了實驗的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性，實驗結(jié)果進(jìn)一步表明篩選出的優(yōu)化工藝能有效提高紫姜中甲氧基黃酮類成分的提取率，為紫姜的進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考。