龐丹丹 韋康

摘要：花青素是由類黃酮合成途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，含量高時(shí)會(huì)使茶樹(shù)新梢呈現(xiàn)紅色或紫色。同時(shí)，花青素相比兒茶素等具有更明顯的抗氧化、預(yù)防腫瘤等藥理保健作用。文章就茶樹(shù)花青素合成途徑、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面進(jìn)行綜述，以期更好地為高花青素茶樹(shù)的育種研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù);花青素;形成;調(diào)控

Research Advance on Molecular Mechanism of

Anthocyanin Formation in Tea Plants

PANG Dandan1， WEI Kang2*

1. Tea Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yunnan Provincial Key Laboratory for Tea Science/Yunnan

Technology Engineering Research Center of Tea Germplasm Innovation and Supporting Cultivation， Menghai 666201， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Center for Tea Improvement/Key Laboratory of

Tea Biology and Resources Utilization， Ministry of Agriculture， Hangzhou 310008， China

Abstract： Anthocyanins are crucial secondary metabolites produced by the flavonoid synthesis pathway. Their accu-mulations result in the formation of red or purple shoots in tea plants. Meanwhile， anthocyanins have many health?effects such as anti-oxidation and cancer prevention. In this paper， anthocyanin biosynthesis pathway， transcription?and post-transcriptional regulation in tea plants were reviewed， which would provide a better theoretical basis for theresearch of hype accumulation of anthocyanins in tea plants.

Keywords： tea plant （Camellia sinensis）， anthocyanins， formation， regulation

茶葉中含有大量具有保健功能的多酚類物質(zhì)，其中花青素是茶樹(shù)次生代謝產(chǎn)生的類黃酮化合物的一種，是天然食用色素的重要來(lái)源[1]?；ㄇ嗨赜兄谌梭w消除自由基，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病及抗癌等藥理保健作用[2-4]，因此，富含花青素的紫娟、紫嫣和紅芽佛手等紫芽茶越來(lái)越受人們的關(guān)注。茶樹(shù)芽葉紫化性狀是特色茶樹(shù)品種改良的重要內(nèi)容，探明茶樹(shù)芽葉花青素合成的分子機(jī)理在理論和應(yīng)用中均具有重要意義。

一、茶樹(shù)中花青素的種類

花青素，又名花色素，是一種重要的水溶性色素，為性質(zhì)穩(wěn)定的色原烯衍生物[5]。自然狀態(tài)下，花青素主要以花色苷的形式存在，通過(guò)形成糖苷鍵的方式與葡萄糖、半乳糖或鼠李糖等結(jié)合。紫化茶樹(shù)種質(zhì)資源中花青素含量相對(duì)常規(guī)的茶樹(shù)品種高，一般茶葉中花青素含量約占干物重的0.01%，紫芽茶中的含量可高達(dá)0.5%～1.0%。目前，對(duì)于紫娟、紫嫣等特異紫色芽葉茶樹(shù)花青素組分的研究已開(kāi)展較多。紫娟的花青素成分主要是飛燕草-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、飛燕草-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷和矢車菊素-3-O-（6-香豆酰）-半乳糖苷，且新梢紅紫化程度較高，主要集中于幼嫩芽葉，成熟葉片花青素含量較少[6]。紫嫣的花青素成分主要是矢車菊素和飛燕草素等[7]。在上述2個(gè)茶樹(shù)品種中，飛燕草素及其糖苷衍生物是最主要的色素組分，此外還有少量的天竺葵色素及其糖苷。

二、花青素在茶樹(shù)中的生物合成與轉(zhuǎn)運(yùn)

植物花青素生物合成途徑已被很好地鑒定，并且這一代謝途徑在不同物種中是高度保守的。茶樹(shù)中花青素的合成途徑主要包括苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑（圖1）[8]，其生物合成需要經(jīng)過(guò)一系列的酶促氧化反應(yīng)，其中涉及到多種酶類：苯丙氨酸脫氨酶（PAL）、肉桂酸羥化酶（C4H）、4-香豆酰CoA連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHS）、查耳酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮3-羥化酶（F3H）、類黃酮3'-羥化酶（F3'H）、類黃酮3'，5'-羥化酶（F3'5'H）、二氫黃酮醇還原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）等[9]。首先，苯丙氨酸作為花青素合成途徑的前體物質(zhì)，在PAL、C4H和4CL的作用下合成4-香豆酰CoA[10];然后，香豆酰CoA進(jìn)入類黃酮合成途徑，CHS催化香豆酰CoA和丙二酰CoA生成查爾酮，進(jìn)而在CHI和F3H的作用下合成柑橘素和二氫山柰酚（DHK），DHK被F3'H或F3'5'H進(jìn)一步催化產(chǎn)生二氫楊梅素（DHM）或二氫槲皮素（DHQ），其中F3'H和F3'5'H是花青素合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，兩者通過(guò)決定花青素B環(huán)羥基化類型從而決定花青素的種類[11];之后，底物DHK、DHM及DHQ可在DFR、ANS等酶的催化下生成不同顏色穩(wěn)定的花色苷;最終，花青素經(jīng)過(guò)各種修飾被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中儲(chǔ)存。目前，NCBI已登錄的茶樹(shù)中花青素合成途徑的基因搜索結(jié)果見(jiàn)表1，尚沒(méi)有登錄花青素糖基化修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)酶的編碼基因。

花青素合成后的運(yùn)輸主要包括囊泡運(yùn)輸及連接蛋白運(yùn)輸兩種模式，過(guò)程較復(fù)雜，細(xì)胞質(zhì)中合成的花色素苷通過(guò)幾種與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的途徑轉(zhuǎn)移到液泡中，如ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）等[12]。GST是目前研究最為深入的花色苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中GSTF和GSTU型是植物特有的，且GSTF是研究發(fā)現(xiàn)最多的與類黃酮物質(zhì)積累相關(guān)的家族，其直接作為配體蛋白，參與花青素、原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。前期，研究人員主要是利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的手段篩選獲得茶樹(shù)中花青素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的候選基因。通過(guò)對(duì)正常光照和遮陰處理的不同茶樣的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，張亞真等[13]發(fā)現(xiàn)CsGSTF1的基因表達(dá)量隨著芽葉的發(fā)育顯著下降，且與擬南芥中負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)花青素和原花青素的AtGSTF12高度相似，推測(cè)CsGSTF1可能與茶樹(shù)中花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，進(jìn)而造成花青素的積累。Wei等[14]對(duì)遺傳群體中分化的綠芽或紫芽茶樹(shù)的一芽二葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于綠芽茶樹(shù)，紫芽茶樹(shù)中花青素晚期生物合成基因3GT（3.2倍和2.1倍）、ANS（1.6倍）和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因CsGSTF1（4.6倍）的表達(dá)量相對(duì)較高，推測(cè)茶樹(shù)中花青素的積累與后期修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)能力的強(qiáng)弱息息相關(guān)。Wei等[15]進(jìn)一步基于代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及QTL定位等方法，驗(yàn)證了CsGSTF1表達(dá)與紫芽性狀的關(guān)聯(lián)性;在擬南芥tt19-8突變體（AtGSTF12缺陷型突變體）中過(guò)表達(dá)CsGSTF1發(fā)現(xiàn)，CsGSTF1能夠恢復(fù)tt19-8突變體的花青素缺失表型，但不能恢復(fù)其透明種皮的表型（與原花青素累積有關(guān)），證實(shí)了CsGSTF1是專一性參與花青素累積的關(guān)鍵基因，其表達(dá)水平直接決定茶葉中花青素的積累量。Liu等[16]通過(guò)體外重組試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)3個(gè)重組CsGSTs中，只有CsGSTF1對(duì)花青素表現(xiàn)出較高的親和力，進(jìn)一步說(shuō)明了該基因的重要性。

三、茶樹(shù)中花青素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

雖然類黃酮的合成途徑已經(jīng)清晰，合成途徑的相關(guān)酶類基因也基本明確，但由于花青素類化合物種類復(fù)雜，涉及到多個(gè)代謝途徑，如苯丙烷途徑、類黃酮合成途徑等，并形成多種產(chǎn)物，它們的合成途徑存在許多交叉點(diǎn)，也意味著合成調(diào)控的復(fù)雜性?；ㄇ嗨氐拇x途徑的關(guān)鍵酶類決定了最終形成的花青素種類，而轉(zhuǎn)錄因子則被認(rèn)為是調(diào)控花青素積累的主要因素之一。以往大量的研究表明，MYB、bHLH、WD40這3類蛋白是參與花青苷合成的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，上述3種轉(zhuǎn)錄因子自身特殊結(jié)構(gòu)的調(diào)控或者協(xié)同形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物（MBW復(fù)合物），與花青苷生物合成的結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子相結(jié)合，達(dá)到激活或抑制不同基因的表達(dá)，參與生物合成的多個(gè)酶促步驟，進(jìn)而調(diào)控花青素的合成[17-19]。

MYB是研究較多的茶樹(shù)中花青素、兒茶素等類黃酮化合物調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)也是花青素生物合成中MBW復(fù)合體的主要決定因子[20]。例如，擬南芥中MYB75（PAP1）、MYB90（PAP2）、MYB113（PAP3）和MYB114（PAP4）均可與TT8/GL3及TTG1（WD40）形成相應(yīng)的4種MBW復(fù)合物，激活晚期花青素生物合成基因AtDFR、AtANS/LDOX和AtUF3GT的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致野生型植株中花青素的大量積累[18];蘋果中MdMYB1、MdMYBA和MdMYB10等多個(gè)MYB家族基因被克隆與鑒定，并且相關(guān)研究表明上述基因是控制果皮花青苷合成的關(guān)鍵因子，它們的轉(zhuǎn)錄水平總是與果實(shí)花青苷的積累呈正相關(guān)[21-23]。在茶樹(shù)中，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方式，篩選得到多個(gè)與調(diào)控花青素積累相關(guān)的MYB候選基因。Wei等[14]對(duì)茶樹(shù)芽葉顏色分化遺傳群體中紫芽與綠芽單株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，其中CsMYB75與擬南芥中調(diào)控花青素合成的AtPAP1高度相似。近期，CsMYB75被證實(shí)可以作用花青素轉(zhuǎn)運(yùn)CsGSTF1基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)紫芽茶花青素的積累[15]。He等[24]發(fā)現(xiàn)CsMYB75的表達(dá)與AtMYB113最為相似，并且在調(diào)控花青素合成方面一致，特異性地使得CHS和花青素3-O-葡糖糖基轉(zhuǎn)移酶基因（A3T）顯著上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)紫色芽葉中類黃酮物質(zhì)的積累。Sun等[25]研究認(rèn)為1個(gè)與擬南芥MYB75同源的CsAN1（即CsMYB75）是紫娟茶樹(shù)芽葉紫化的關(guān)鍵因子，CsMYB75瞬時(shí)轉(zhuǎn)入本氏煙草，促進(jìn)了其花青素的積累;酵母雙雜及雙分子熒光互補(bǔ)等試驗(yàn)表明，該基因能夠與CsGL3、CsEGL3互作，通過(guò)形成MBW復(fù)合物調(diào)控花青素合成基因CsLDOX的表達(dá);同時(shí)CsAN1的表達(dá)水平也受表觀遺傳的調(diào)控，CsAN1的表達(dá)量與啟動(dòng)子的低甲基化水平呈正相關(guān)。該研究從轉(zhuǎn)錄水平上初步闡明了茶樹(shù)花青素合成的分子機(jī)制。近期，王留彬等[26]發(fā)現(xiàn)CsMYB75基因與前期控制茶樹(shù)新梢顏色的QTL實(shí)現(xiàn)共定位，該研究從遺傳學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)了CsMYB75參與茶樹(shù)花青素合成過(guò)程的調(diào)控。

除MYB之外，bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物中類黃酮相關(guān)的第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，WD40則屬于被認(rèn)識(shí)的較少的轉(zhuǎn)錄因子。茶樹(shù)中bHLH和WD40這2種轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控茶樹(shù)花青素生物累積方面的研究也較少。相關(guān)研究主要是利用基因芯片、茶樹(shù)基因組及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定得到了多個(gè)與茶樹(shù)中花青素富集的候選基因bHLH和WD40[27-28]，其具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

四、茶樹(shù)中花青素合成的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，除了參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫反應(yīng)外，miRNA對(duì)于初級(jí)和次級(jí)代謝也發(fā)揮著重要的作用。研究表明，在轉(zhuǎn)錄后水平上miRNA對(duì)植物花青素的合成具有不可替代的調(diào)控作用。植物中已報(bào)道的與花色素生物合成調(diào)控相關(guān)的家族有miR156、miR828、miR858和miR165/166等，不同miRNA家族對(duì)花色素生物合成的調(diào)控機(jī)制各異。miR828可誘發(fā)TAS4轉(zhuǎn)錄本的剪切，調(diào)節(jié)擬南芥和蘋果中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[29-30];miRNA156通過(guò)靶向SPL轉(zhuǎn)錄因子，影響MYB-bHLH-WD40復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄激活活性，從而抑制ANS和DFR等基因的表達(dá)，參與調(diào)控花青素的生物合成[31];miRNA858通過(guò)靶向MYB12轉(zhuǎn)錄因子基因參與調(diào)控CHS和FLS的表達(dá)影響黃酮醇的合成，間接影響花青素的含量[32];miRNA165/166主要是通過(guò)其靶基因負(fù)向調(diào)控花青素的生物合成來(lái)影響植物色澤[33]。

目前，關(guān)于茶樹(shù)花青素代謝的研究主要集中在MYB/bHLH/WD對(duì)花青素生物合成途徑轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，與其他植物相比，茶樹(shù)中miRNA的研究起步較晚，主要是利用高通量測(cè)序、生物信息學(xué)鑒定、植物芯片等技術(shù)篩選得到茶樹(shù)中大量miRNA，并發(fā)現(xiàn)其在生物、非生物脅迫及兒茶素、萜類物質(zhì)合成方面起著調(diào)控作用，而對(duì)于探究miRNA在紫化芽葉茶樹(shù)花青素積累中的作用的研究較少。陳林波等[34]對(duì)紫芽茶樹(shù)紫娟、綠芽茶樹(shù)云抗10號(hào)和福鼎大白茶進(jìn)行miRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miRNA828a在紫娟葉片中差異表達(dá)，基于測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)miRNA828a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR828a靶向MYB轉(zhuǎn)錄因子的多個(gè)基因，推測(cè)miR828a靶向MYB類轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控茶樹(shù)花青素的生物合成。

五、展望

花青素是一種具有保健功能的多酚類物質(zhì)，對(duì)人體具有較好的降壓、減肥、降脂、預(yù)防心腦血管疾病和改善視力、預(yù)防眼部疲勞等功效;同時(shí)，花青素作為一種天然抗氧化劑，在茶樹(shù)抵御過(guò)高光強(qiáng)、低溫等逆境脅迫中具有一定的保護(hù)作用。因此，人們對(duì)選育特異紫色芽葉茶樹(shù)品種、開(kāi)發(fā)富含花青素的功能性茶產(chǎn)品越來(lái)越關(guān)注[35]。

近年來(lái)，茶樹(shù)中花青素生物合成途徑較為清晰，相關(guān)的大部分結(jié)構(gòu)基因已得到分離與鑒定，茶樹(shù)紫化芽葉形成的調(diào)控研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但仍不足以揭示其復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理。因此，借助功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)及表觀遺傳學(xué)等技術(shù)手段，進(jìn)一步挖掘調(diào)控花青素合成的新基因，并對(duì)其功能和表達(dá)調(diào)控的內(nèi)在機(jī)理進(jìn)行探究，有助于為富含花青素的茶樹(shù)品種的培育及高花青素保健茶產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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