劉揚(yáng) 張妮 羅俊 王苗苗 潘衛(wèi)東

摘 要： 鉤藤富含生物堿類成分且資源豐富，具有清熱平肝、息風(fēng)定驚等作用。為明確鉤藤莖、葉的物質(zhì)基礎(chǔ)，該文采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20及半制備 HPLC 等色譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，并采用 MTT 法對(duì)人白血病細(xì)胞株 K562、HEL 進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選。從鉤藤莖中分離得到7個(gè)化合物，分別鑒定為3，4，5-三甲氧基苯酚（1），東莨宕素（2），異去氫鉤藤堿（3），去氫鉤藤堿（4），Vallesiachotamine（5），異鉤藤堿（6），鉤藤堿（7）。從鉤藤葉中分離得到12個(gè)化合物，分別鑒定為二十八烷醇（8），β-谷甾醇（9），三十烷酸（10），2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside（11），齊墩果酸（12），槲皮素（13），常春藤苷元（14），山柰酚（15），（6R， 9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16），熊果酸（17），表兒茶素（18），大黃素甲醚（19）。結(jié)果表明：（1）化合物3、5對(duì)HEL細(xì)胞有抑制作用，IC50值分別為17.96、73.01 μg·mL-1;化合物5對(duì)K562細(xì)胞有抑制作用，IC50值為16.45 μg·mL-1，表明鉤藤莖化學(xué)成分有一定的抗腫瘤活性。（2）化合物1， 8， 10， 16均為首次從鉤藤植物中分離得到。該研究可為鉤藤植物資源的合理開發(fā)與可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 鉤藤， 化學(xué)成分， 分離純化， 結(jié)構(gòu)鑒定， 抗腫瘤活性

中圖分類號(hào)： Q946.91 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2021）07-1061-09

Abstract： Uncaria rhynchophylla contains large amount of alkaloids and abounds in natural resources， and has the function of heat-clearing for calming liver and wind-calming for calming frightened. In order to make clear the material basis of stems and leaves of U. rhynchophlla， in this paper， the chemical constituents of stems and leaves from U. rhynchophylla and their antitumor activities were studied. The extracts were isolated and purified by using silical gel， Sephadex LH-20， semi-HPLC， and the structures of the compounds were identified by physicochemical property and spectrum analysis. The antitumor activities of chemical constituents against K562， HEL cell lines were assessed by MTT method. Seven compounds were isolated and identified from stems of U. rhynchophylla as 3， 4， 5-trimethoxyphenol（1），scutellarin（2）， isohydrohydrogenine（3）， dehydroramine（4）， Vallesiachotamine（5）， isorhynchophylline（6）， rhynchophylline（7）. Twelve compounds were isolated and identified from leaves of U. rhynchophylla as octadecanol（8）， β-sitosterol（9）， tridecanoicacid（10）， 2-methyl-5，7-dihydroxy-chroone-7-O-β-D-glucopyranoside（11）， oleanolic acid（12）， quercetin（13）， ivy aglycone（14）， kaempferol（15）， （6R， 9R ）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16）， ursolic（17）， epicatechin（18）， emodin methylether（19）. The results of antitumor activities were as follows： （1） Compounds 3 and 5 inhibited the activities of HEL cell lines， and IC50 values were 17.96 and 73.01 μg·mL-1; Compound 5 inhibited the activities of K562 cell lines， and IC50 values were 16.45 μg·mL-1， which indicate that some compounds from stems of U. rhynchophylla have certain antitumor activities. （2） Compounds 1， 8 ，10 and 16 were isolated from this plant for the first time. This study shed the scientific light on reasonable utilization and sustainable development of plant resources.

Key words： Uncaria rhynchophylla， chemical constituents， isolation and purification， structure identification， antitumor activity

鉤藤，是茜草科植物鉤藤（Uncaria rhynchophylla）、大葉鉤藤（U. macropylla）、毛鉤藤（U. hirsute）、華鉤藤（U. sinensis）或無柄果鉤藤（U. sessilifucus）的干燥帶鉤莖枝，常用以眩暈欲仆、癲癇抽縮、高燒驚厥、傷風(fēng)夾驚、兒童驚啼、受孕子癇等癥狀（國(guó)家藥典委員會(huì)，2015）。其主要產(chǎn)自于我國(guó)的贛、粵、桂、湘、滇、黔等省（區(qū)）（高曉宇等， 2017）。鉤藤作為貴州省的道地藥材之一，在貴州的劍河、丹寨、錦屏、榕江、開陽等30多個(gè)縣市均有種植（楊琳等， 2014）。

鉤藤的化學(xué)成分類型較為多樣，包括生物堿類、黃酮類、三萜類、甾醇類、多酚類、揮發(fā)油類以及糖苷類等（Wang & Sun，2010;Zhang & Huang，2020）。其中，生物堿類為鉤藤最主要的有效成分，按照結(jié)構(gòu)類型可進(jìn)一步分成吲哚類以及氧化吲哚類兩大類（Cai et al.， 2019）。前人對(duì)其藥用部位研究比較多，而對(duì)于非藥用部位報(bào)道較少。為了更進(jìn)一步開發(fā)利用，避免資源的浪費(fèi)，本文針對(duì)鉤藤非藥用部位莖、葉化學(xué)成分展開了初步的探究，從鉤藤的莖中分離總共得到7個(gè)化合物（圖1），分別鑒定為3，4，5-三甲氧基苯酚（1），東莨宕素（2），異去氫鉤藤堿（3），去氫鉤藤堿（4），Vallesiachotamine（5），鉤藤堿（6），異鉤藤堿（7）。從鉤藤的葉中分離總共得到12個(gè)化合物，分別鑒定為二十八烷醇（8），β-谷甾醇（9），三十烷酸（10），2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside（11），齊墩果酸（12），槲皮素（13），常春藤苷元 （14），山柰酚（15），（6R，9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one（16），熊果酸（17），表兒茶素（18），大黃素甲醚 （19）?；衔?， 8，10，16均為首次從該植物中分離得到?？鼓[瘤活性結(jié)果表明，化合物3和5 對(duì)HEL細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，化合物5對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)。本研究豐富了鉤藤的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，也為更加全面系統(tǒng)地開發(fā)以及合理利用鉤藤資源提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

儀器：INOVA-400 MHz 核磁共振波譜儀（美國(guó)Varian公司，WIPM-500 MHz 核磁共振儀（中科院武漢數(shù)學(xué)物理研究所），600 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國(guó)布魯克公司），Waters 2545高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），美國(guó)HP-5973型質(zhì)譜儀，HP1100-MSD型液質(zhì)聯(lián)用儀，Sephadex LH-20凝膠（40 ～ 70 μm， 默克），混勻機(jī)（IKA公司），凍存管（Corning）細(xì)胞培養(yǎng)皿（NEST），超低溫冰箱（Thermo 公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司），96孔板（NEST），超凈工作臺(tái)（Thermo 公司），熒光倒置顯微鏡（Zeiss公司），F(xiàn)etal bovine serum（Hyclone），控溫?fù)u床（IKA公司），Milli-Q 超純水儀（Millipore 公司），水浴鍋（Grant公司），DEME。柱層析硅膠（200～300目和300～400目），薄層層析硅GF254（0.20～0.25 μm）（青島海洋化工工廠），Sephadex LH-20 （MERCK 公司），低溫離心機(jī)（BECKMAN 公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（NEST），超凈工作臺(tái)（Thermo 公司），移液管（Fischer），離心管（NEST），細(xì)胞培養(yǎng)皿（NEST），高壓滅菌鍋（上海申博化工有限公司）。

試劑：甲醇、乙醇、石油醚（上海泰坦科技股份有限公司），多功能酶標(biāo)儀（Gene 公司），Trypsin（Gibico），雙抗（青霉素+鏈霉素），MTT（Sigma），MCI GEL CHP20P（日本三菱化學(xué)公司）。

材料由貴州省丹寨縣興仁鎮(zhèn)昌昊金煌（貴州）中藥有限公司種植基地提供，經(jīng)賀定翔中藥師鑒定為茜草科（Rubiaceae）鉤藤屬（Uncaria Schreb.）鉤藤（Uncaria rhynchophylla）的莖枝及葉。

1.2 提取和分離

干燥鉤藤的莖15.0 kg，粉碎后用濃度為90%的乙醇（每次50 L）加熱回流提取3次，合并提取液，減壓蒸餾濃縮除去有機(jī)溶劑后得粗提物。用濃度為5%的鹽酸溶解浸膏，過濾得到濾液;用飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)濾液的pH，使其至 pH=9;分別用氯仿萃取4次，合并氯仿層，減壓回收溶劑，得氯仿層200.0 g。取氯仿部位浸膏200.0 g，加適量溶劑溶解，用60～80目、質(zhì)量約為350.0 g的硅膠拌樣，經(jīng)300～400目、質(zhì)量約為2.0 kg的硅膠進(jìn)行柱層析，用（氯仿-甲醇100∶1 → 0∶1）進(jìn)行梯度洗脫。每次接餾分約為800 mL，減壓濃縮回收溶劑。將濃縮后的組分用薄層色譜（TLC）展開，分別觀察組分在紫外燈下的熒光顯色和濃度為5%磷鉬酸的顯色情況，合并相似的部分，一共分成9段（Fr.1～ Fr.9）。第Fr.2 段（5.0 g）經(jīng) MCI 柱層析（甲醇-水20∶80 → 100∶0）洗脫分為 6 段。Fr.2-1（505.2 mg）反復(fù)經(jīng)過硅膠柱梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯10∶1 → 1∶1），得化合物1（6.0 mg）和2（7.0 mg）。將Fr.2-6（240.3 mg）進(jìn)行重結(jié)晶后得化合物3（5.0 mg）。將Fr.2-5（1.3 g）部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析及半制備高效液相色譜分離后得化合4（3.2 mg）和5（6.0 mg）。將Fr.3（4.0 g）經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱（甲醇-水 1∶1）、硅膠柱梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯8∶1 → 2∶1）的過程，再經(jīng)過半制備高效液相分離，得化合物6（15.3 mg）和7（4.0 mg）。

干燥鉤藤的葉7.5 kg，粉碎后，用90% 的乙醇（每次25 L）回流提取3次，合并提取液。減壓蒸餾濃縮除去有機(jī)溶劑后得粗提物，將得到的總浸膏加入適量的水混懸。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，再減壓回收溶劑。分別獲得石油醚部位浸膏（5.0 g），乙酸乙酯部位浸膏291.0 g，正丁醇部位浸膏330.0 g。稱取鉤藤葉乙酸乙酯部位的浸膏（291.0 g），加入適量的有機(jī)溶劑，使其充分溶解，稱60～80目的硅膠約為500.0 g拌樣，稱300～400目的硅膠約3 kg進(jìn)行柱層析分離，用（氯仿-甲醇100∶1 → 0∶1）進(jìn)行梯度洗脫。每次接餾分約為800 mL，減壓濃縮，用薄層色譜展開，將相似組分合并。將氯仿的萃取部分總共分成11段（Fr.1～ Fr.11）。把第Fr.3段（3.0 g）經(jīng)MCI柱層析（甲醇-水 20∶80 →100∶0）洗脫，共分為6段。把Fr.3-1（820.1 mg）段用硅膠柱洗脫（石油醚-乙酸乙酯 20∶1→ 5∶1），得化合物 8（20.0 mg），9（15.2 mg）。Fr.4段（6.0 g）經(jīng)硅膠柱梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯 100∶1→ 10∶1），共分為7段（Fr.4-1～Fr.4-7）。Fr.4-5（1.5 g）段經(jīng)硅膠柱洗脫（石油醚-乙酸乙酯10∶1），得化合物10（8.0 mg），11（5.0 mg）。將Fr.4-7（602.4 mg），經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得化合物12（6.1 mg）。Fr.6段（5.0 g）經(jīng)硅膠柱梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯50∶1→ 10∶1），共分為 9 段（Fr.6-1～Fr.6-9）。Fr.6-4（1.6 g）段經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇-氯仿1∶1）洗脫，得到化合物13（6.3 mg）。Fr.6-9（ 803.2 mg）段經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇-氯仿 1∶1）洗脫，后經(jīng)高效液相半制備分離，得化合物14（6.3 mg）、15（6.2 mg）和16（3.0 mg）。Fr.7段（6.0 g）經(jīng)MCI柱層析（甲醇-水30∶70→ 100∶0）后，再通過反復(fù)硅膠柱梯度洗脫（石油醚-乙酸乙酯20∶1→ 0∶1）和Sephadex LH-20凝膠柱（50% 甲醇）分離以及半制備高效液相分離，得化合物17（25.1 mg）、18（20.3 mg）、19（8.2 mg）。

1.3 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法測(cè)定鉤藤莖、葉中化合物對(duì)人白血病細(xì)胞株K562、HEL的增殖抑制作用。選用對(duì)數(shù)期細(xì)胞，選用10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸液。接種于96孔板，使每孔細(xì)胞為8 000個(gè)，將96孔板置于5% CO2培養(yǎng)箱中，過夜，待細(xì)胞完全適應(yīng)環(huán)境。將待測(cè)化合物用DMSO配成5個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)基。陽性對(duì)照用紫杉醇，阿霉素，長(zhǎng)春新堿，順鉑和5-氟尿嘧啶配置成等濃度梯度。陰性對(duì)照為等體積0.25% DMSO的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥后，培養(yǎng)48 h。離心去除上清液，加入5 mg·mL-1MTT的培養(yǎng)基。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。取出96孔板，棄除上清液，加入DMSO，恒溫?fù)u床37 ℃避光，至甲瓚晶體充分溶解。于酶標(biāo)儀490 nm處，測(cè)OD值。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD-空白對(duì)照組OD）/（對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD）×100;抑制率（%）=100%-細(xì)胞存活率（%）;半數(shù)抑制濃度IC50=lg-1[Xm-i×（P-0.5）]，式中：i表示（最大劑量/相鄰劑量）的對(duì)數(shù)值;Xm表示最大濃度對(duì)數(shù)值;P表示各濃度抑制率之和。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1： 白色無定形粉末。ESI-MS m/z： 207 [M + Na]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 6.09（2H， s， H-2， 6）， 3.81（6H， s， 3， 5-OCH3）， 3.78（3H， s， 4-OCH3）. 13C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 153.8（C-3， 5）， 152.3（C-1）， 131.9（C-4）， 92.9（C-2， 6）， 61.1（4-OCH3）， 56.0（3， 5-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（DE Oliveira et al.， 2014）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為3，4，5-三甲氧基苯酚。

化合物2： 白色粉末。ESI-MS m/z： 215 [M + Na]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 7.60（1H， d，J=9.5 Hz， H-4）， 6.92（1H， s， H-5）， 6.85（1H， s， H-8）， 6.27（1H， d，J= 9.5 Hz， H-3）， 3.96（3H， s， 6-OCH3）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 161.5（C-2）， 149.7（C-6， 9）， 144.0（C-7）， 143.3（C-4）， 113.4（C-5）， 111.5（C-3）， 107.5（C-10）， 103.2（C-8）， 56.4（6-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Ma et al.， 2009）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為東莨宕素。

化合物3： 白色粉末，以碘化鉍鉀顯色，呈陽性反應(yīng)。ESI-MS m/z： 383 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.44（1H， s， 1-NH）， 7.47（1H， d，J=7.3 Hz， H-9）， 7.28（1H， s， H-17）， 7.17（1H， m， H-11）， 7.05（1H， t， J=7.1 Hz， H-10）， 6.89（1H， d，J=7.7 Hz， H-12）， 5.52（1H， m， H-19）， 4.94（2H， m， H-18）， 3.70（3H， s， OCH3）， 3.58（3H， s， COOCH3）， 3.31（1H， m， H-3）， 3.21（1H， d， J=10.9 Hz， H-15）， 2.07～1.97（2H， m， H-6a，6），1.08（1H， d，J= 11.4 Hz， H-14a）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 184.3（C-2）， 170.8（C-22）， 162.0（C-17）， 142.5（C-19）， 142.1（C-13）， 136.4（C-8）， 130.0（C-11）， 127.7（C-9）， 124.9（C-10）， 117.9（C-18）， 114.5（C-16）， 111.8（C-12）， 74.6（C-3）， 63.8（C-21）， 61.2（C-OCH3）， 59.3（C-7）， 56.5（C-5）， 53.5（C-COOCH3）， 45.0（C-20）， 40.1（C-15）， 38.0（C-6）， 32.1（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Kim et al.， 2011）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為異去氫鉤藤堿。

化合物4： 白色粉末，以碘化鉍鉀顯色，呈陽性反應(yīng)。ESI-MS m/z： 383 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.20（1H， s， 1-NH）， 7.27（1H， s， H-17）， 7.23（1H， d，J=2.8 Hz， H-9）， 7.04（1H， t，J=7.6 Hz， H-10）， 6.87（1H， d，J=7.7 Hz， H-12）， 5.51（1H， m， H-19）， 4.99～4.85（2H， m， H-18）， 3.73（3H， s， OCH3）， 3.62（3H， s， COOCH3）， 3.39（1H， t，J=6.8 Hz， H-3）， 3.28（1H， dd，J=10.8， 4.0 Hz， H-15）， 3.00（1H， m， H-20）， 2.07～1.98（2H， m， H-6a， 6b）， 1.90（1H， m， H-14b）， 1.24（1H， t，J=7.2 Hz， H-14a）. 13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 181.2（C-2）， 159.7（C-17）， 140.8（C-19）， 139.5（C-13）， 133.7（C-8）， 127.9（C-11）， 123.3（C-9）， 122.6（C-10）， 115.4（C-18）， 111.6（C-16）， 109.3（C-12）， 75.0（C-3）， 58.7（C-OCH3）， 56.6（C-7）， 54.8（C-5）， 51.2（C-COOCH3）， 42.6（C-20）， 34.7（C-6）， 28.8（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Chen et al.， 2009）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為去氫鉤藤堿。

化合物5： 棕色粉末，以碘化鉍鉀顯色，呈陽性反應(yīng)。ESI-MS m/z： 373 [M+Na]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 9.38（1H， s， H-21）， 8.02（1H， s， H-1）， 7.68（1H， s， H-17）， 7.49（1H， d，J=7.7 Hz， H-10）， 7.31（1H， d，J=7.9 Hz， H-11）， 7.20～7.09（2H， m， H-9， 12）， 6.68（1H， q，J=7.3 Hz， H-19）， 4.48（1H， d，J=11.5 Hz， H-3）， 4.02（1H， d，J=4.9 Hz， H-15）， 3.65（3H， s， OCH3）， 2.93（1H， m， H-6α）， 2.82（1H， d， H-6β）， 2.17（1H， d， H-14α）， 2.10（3H， d，J=7.5 Hz， H-18）， 1.93（1H， m， H-14β）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC：195.9（C-21）， 168.3（C-228）， 152.9（C-19）， 147.4（C-17）， 146.4（C-16）， 136.2（C-13），132.4（C-2）， 126.8（C-8）， 122.1（C-9）， 119.8（C-12）， 118.1（C-10）， 111.0（C-10）， 108.4（C-7）， 94.1（C-20）， 51.1（C-5）， 50.7（OCH3）， 49.3（C-3）， 34.1（C-14）， 28.3（C-15）， 22.0（C-6）， 15.1（q， C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（田麗娜等， 2014）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為Vallesiachotamine。

化合物6： 白色粉末，以碘化鉍鉀顯色，呈陽性反應(yīng)。ESI-MS m/z： 393 [M + Na]+， 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.23（1H， s， NH-1）， 7.46（1H， s， H-9）， 7.18（1H， td，J=7.7， 1.2 Hz， H-11）， 7.04（1H， t，J=6.1 Hz， H-10）， 6.87（1H， d，J= 7.7 Hz， H-5a）， 3.35（1H， dd，J= 10.8， 3.6 Hz， H-12b）， 3.30（1H， dd，J= 8.4， 1.5 Hz， H-5b）， 0.83（1H， t，J=7.1 Hz， H-18）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC： 134.0（C-8）， 109.2（C-12）， 72.4（C-3）， 58.2（C-21）， 56.8（C-7）， 35.5（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Chou et al.， 2009）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為異鉤藤堿。

化合物7： 白色粉末，以碘化鉍鉀顯色，呈陽性反應(yīng)。ESI-MS m/z： 385 [M + H]+， 1H-NMR（400 MHz， CDCl3） δH： 8.46（1H， s， NH-1）， 7.27（1H， s， H-9）， 7.17（1H， d，J=7.7 Hz， H-11）， 7.04（1H， t，J=7.5 Hz， H-10）， 6.90（1H， d，J=7.4 Hz， H-12）， 3.72（3H， s， OCH3）， 3.62（3H， s， COOCH3）， 2.44（1H， dd，J=17.1， 8.4 Hz， H-5a）， 2.02（1H， dd，J=12.6， 7.1Hz， H-6a）， 1.66（1H， t，J=10.4 Hz， H-21a）， 0.82（3H， t， J = 7.2Hz， H-18）。13 C-NMR（100 MHz， CDCl3） δC： 181.5（C-2）， 159.8（C-17）， 140.9（C-13）， 133.8（C-8），127.7（C-11）， 123.1（C-10）， 109.3（C-12）， 58.2（C-21）， 56.0（C-7）， 55.0（C-5）， 37.8（C-15）， 34.8（C-6）， 31.9（C-14）， 24.2（C-19）， 11.3（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（孫安盛等， 1995）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為鉤藤堿。

化合物8： 白色顆粒狀結(jié)晶。1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 3.64（2H， dd，J=11.2， 6.4 Hz， CH2OH）， 1.56（2H， m， CH2CH2OH）， 1.27（50H， m）， 0.88（3H， t，J=7.0 Hz， CH3）。13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 63.1（C-1）， 32.8（C-2）， 31.9（C-26）， 29.7（C-3， 25）， 25.7（C-3）， 22.7（C-27）， 14.1（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（蔣艷芳和徐慧， 2011）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為二十八烷醇。

化合物9： 無色晶體。ESI-MS： m/z 415 [M + H]+， 1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 5.40（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）， 3.57（1H， m， H-3）， 1.06（3H， s， H-19）， 0.97（3H， d，J= 6.2Hz，H-21）， 0.73（3H， s， H-18）. 13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 140.8（C-5）， 121.7（C-6）， 71.8（C-3）， 56.1（C-14）， 56.1（C-17）， 50.1（C-9）， 42.3（C-4， 13）， 39.8（C-12）， 37.3（C-1）， 36.5（C-10）， 36.1（C-20）， 34.0（C-22）， 32.0（C-7）， 31.7（C-8）， 29.7（C-2）， 29.2（C-25）， 28.2（C-16）， 26.1（C-23）， 24.3（C-15）， 23.1（C-28）， 21.1（C-11）， 19.8（C-19）， 19.4（C-27）， 19.0（C-26），18.8（C-21）， 12.0（C-18， 29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（何康等， 2021）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物10： 白色無定形晶體。1H-NMR（500 MHz， CDCl3） δH： 2.39（2H， t，J=7.3Hz， 29-CH2）， 1.65（2H ， m，J= 4.8 Hz， 28-CH2）， 1.30（52H ， s， 2-27-CH2）， 0.93（3H， t， J= 6.3 Hz， -CH3）。13 C-NMR（125 MHz， CDCl3） δC： 33.8（C-2）， 31.6（C-3）， 29.7（C-4-27）， 24.7（C-28）， 22.7（C-29）， 14.1（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（張恒和饒坤林， 2016）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為三十烷酸。

化合物11： 白色針晶。ESI-MS m/z： 353 [M - H]-， 1H-NMR（500 MHz， DMSO-d6） δC： 12.86（1H， s， 5-OH）， 6.68（1H， d，J=1.4 Hz， H-8）， 6.45（1H， d，J=1.4 Hz， H-6）， 6.29（1H， s， H-3）， 5.11（1H， d，J=5.1 Hz， H-1″）， 2.42（3H， s， CH3）。13 C-NMR（125 MHz， DMSO-d6） δC： 182.5（C-4）， 168.9（C-9）， 163.3（C-7）， 161.6（C-5）， 157.9（C-2）， 108.8（C-3）， 105.5（C-10）， 99.9（C-6）， 94.9（C-8）， 77.6（C-3′）， 76.8（C-5′）， 73.5（C-2′）， 70.0（C-4′）， 61.0（C-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（郭星和曾常青， 2010）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為2-methyl-5，7-dihydroxy-chromone-7-O-β-D-glucopyranoside。

化合物12： 白色粉末。ESI-MS m/z： 455 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 5.30（1H， t，J=3.5 Hz， H-12）， 3.24（1H， dd，J=11.3， 4.2 Hz， H-3）， 2.84（1H， dd，J=13.8， 4.2 Hz， H-18）， 1.15（3H， s）， 1.01（3H， s）， 0.95（3H， s）， 0.93（3H， s）， 0.92（3H， s）， 0.79（3H， s）， 0.77（3H， s）。 13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 183.2（C-28）， 143.6（C-13）， 122.6（C-12）， 79.1（C-3）， 55.2（C-5）， 47.6（C-9）， 46.5（C-17）， 45.9（C-19）， 41.6（C-14）， 41.0（C-18）， 39.3（C-8）， 38.8（C-4）， 38.4（C-1）， 37.1（C-10）， 33.8（C-21）， 33.1（C-7）， 32.6（C-22）， 32.4（C-29）， 30.7（C-20）， 28.1（C-23）， 27.7（C-15）， 27.2（C-2）， 26.0（C-27）， 23.6（C-11）， 23.4（C-30）， 22.9（C-16）， 18.3（C-6）， 17.1（C-26）， 15.6（C-24）， 15.3（C-25）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（劉清華和葛爾寧， 2010）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為齊墩果酸。

化合物13： 黃色粉末。ESI-MS m/z： 301 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 7.75（1H ， d，J=2.1 Hz， H-2′）， 7.65（1H， dd，J=8.5， 2.2 Hz， H-6′）， 6.90（1H， d，J=8.5 Hz， H-5′）， 6.41（1H， d， 2.1 Hz， H-8）， 6.19（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC： 175.9（C-4）， 164.2（C-7）， 161.1（C-5）， 156.8（C-9）， 147.4（C-2）， 146.6（C-4′）， 144.8（C-2′）， 135.8（C-3）， 122.7（C-1′）， 120.27（C-6′）， 114.82（C-5′）， 114.59（C-2′）， 103.11（C-10）， 97.83（C-6）， 93.01（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（許彥， 2003）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為槲皮素。

化合物14： 白色粉末。ESI-MS m/z： 471 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） δH： 4.17（1H， d，J=4.9 Hz， H-3）， 3.07（1H， dd，J=10.3， 3.4 Hz， H-3）， 2.74（1H， dd，J=13.8， 4.1 Hz， H-18）， 1.10（3H， s， Me）， 0.72（3H， s， Me）， 0.53（3H， s， Me）。13 C-NMR（150 MHz， DMSO-d6） δC： 179.1（C-28）， 144.3（C-13）， 122.0（C-12）， 70.7（C-3）， 64.9（C-23）， 47.6（C-5）， 46.8（C-9）， 45.9（C-19）， 42.3（C-14）， 41.8（C-18）， 41.3（C-4）， 38.4（C-1）， 36.8（C-10）， 33.8（C-21）， 33.3（C-29）， 32.6（C-7）， 32.5（C-22）， 30.9（C-20）， 27.7（C-15）， 26.1（C-2）， 23.9（C-30）， 23.4（C-16）， 23.1（C-11）， 17.9（C-6）， 17.4（C-26）， 16.0（C-25）， 13.1（C-24）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（劉小梅等， 2001）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為常春藤苷元。

化合物15： 黃色粉末。ESI-MS m/z： 285 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH：8.10（2H， d，J=8.9 Hz， H-2′，6′）， 6.92（2H， d，J=8.9 Hz， H-3′， 5′）， 6.41（1H， d，J=2.1 Hz， H-8）， 6.20（1H， d，J=2.1 Hz， H-6）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC：176.0（C-4）， 164.2（C-7）， 161.1（C-9）， 159.2（C-4′）， 156.9（C-5）， 146.6（C-2）， 135.7（C-3）， 129.3（C-2′， 6′）， 122.3（C-1′）， 114.9（C-2）， 103.1（C-10）， 97.9（C-6）， 93.1（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（劉興文等， 2003）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為山柰酚。

化合物16： 白色固體。ESI-MS m/z： 247 [M + Na]+， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 5.84（1H， s， H-1）， 3.72（1H， dd，J=12.3， 6.2 Hz， H-9）， 2.48（1H， d，J=17.4 Hz， H-4a）， 2.07（3H， d，J= 1.1 Hz， H-13）， 2.03（1H， d，J=14.4 Hz， H-4b）， 1.98（1H， m， H-6）， 1.94（1H， m， H-7a）， 1.55（2H， m， H-8）， 1.46（1H， m， H-7b）， 1.19（3H， d，J=6.2Hz， H-10）， 1.12（3H， s， H-11）， 1.05（3H， s， H-12）。13 C-NMR（150 MHz， MeOD） δC： 200.8（C-3）， 168.3（C-5）， 124.0（C-4）， 67.2（C-2）， 51.0（C-6）， 46.7（C-2）， 38.4（C-8）， 35.9（C-1）， 27.6（C-12）， 26.1（C-11）， 25.8（C-7）， 23.5（C-13）， 22.2（C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Wang et al.， 2018） 對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為（6R， 9R）-9-hydroxymegastigman-4-en-3-one。

化合物17： 白色粉末。ESI-MS m/z： 455 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） δH： 5.27（1H， s， H-12）， 3.08（1H， dd，J=11.7， 4.2 Hz， H-3）， 2.22（1H， d，J=10.9 Hz， H-18）。13 C-NMR（150 MHz， DMSO-d6） δC： 138.9（C-13）， 127.25（C-12）， 80.1（C-3）， 57.0（C-5）， 54.4（C-18）， 43.7（C-9， 7）， 40.7（C-14）， 40.6（C-8）， 40.4（C-4）， 39.9（C-19）， 38.2（C-1）， 31.8（C-7）， 30.7（C-21）， 29.2（C-10）， 28.5（C-15， 23）， 25.4（C-2）， 24.3（C-16）， 24.1（C-11）， 21.6（C-30）， 19.1（C-6）， 17.6（C-26）， 17.4（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（薛梅等， 2004）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為熊果酸。

化合物18： 白色粉末。ESI-MS m/z： 289 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， MeOD） δH： 6.97（1H， d，J=1.5 Hz， H-2′）， 6.80（1H， dd，J=8.1， 1.5 Hz， H-5′）， 6.76（1H， d，J=8.1 Hz， H -6′）， 5.94（1H， d，J=2.2 Hz， H-8）， 5.92（1H， d，J=2.2 Hz， H-6）， 4.18（1H， s， H-3）， 2.86（1H， dd，J=16.7， 4.4 Hz， H-4）， 2.74（1H， dd，J=16.7， 2.4 Hz， H-4）。13C- NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 158.0（C-5）， 157.6（C-7）， 157.4（C-9）， l45.9（C-3′）， l45.7（C-4′）， 132.3（C-1′）， 119.4（C-6′）， 115.8（C-2′）， 115.3（C-5′）， l00.1（C-10）， 96.4（C-6）， 95.9（C-8）， 79.9（C-2）， 67.5（C-3）， 29.2（C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（徐東升等， 2015）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為表兒茶素。

化合物19： 橙黃色粉末。ESI-MS m/z： 283 [M - H]-， 1H-NMR（600 MHz， CDCl3） δH： 12.32（1H， s， 8-OH）， 12.13（1H， s， 1-OH）， 7.64（1H， s， H-4）， 7.38（1H， d， J=2.4 Hz， H-5）， 7.10（1H， s， H-2）， 6.70（1H， d， J=2.3 Hz， H-7）， 3.96（3H， s， OCH3）， 2.47（3H， s， CH3）。13 C-NMR（150 MHz， CDCl3） δC： 190.8（C-9）， 182.0（C-10）， 166.5（C-1）， 165.2（C-8）， 162.5（C-3）， 148.4（C-6）， 135.2（C-4a）， 133.2（C-10a）， 124.5（C-7）， 121.3（C-5）， 113.7（C-9a）， 110.3（C-8a）， 108.2（C-2）， 106.8（C-4）， 56.1（OCH3）， 22.2（CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（Huang et al.， 2016）對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為大黃素甲醚。

2.2 抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

化合物3和5對(duì)人白血病細(xì)胞HEL、K562的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，化合物3對(duì)人白血病細(xì)胞HEL有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為17.96 μg·mL-1，然而對(duì)人白血病細(xì)胞K562沒有抑制作用?；衔?對(duì)人白血病細(xì)胞K562的抑制作用較強(qiáng)，IC50值為16.45 μg·mL-1，對(duì)人白血病細(xì)胞HEL顯示有較弱的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

貴州作為中國(guó)四大藥材的主產(chǎn)區(qū)之一，其獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候特征造就了豐富而獨(dú)特的中藥和民族藥資源，貴州民族道地藥材鉤藤是抗腫瘤的重要藥材，雖然鉤藤入藥部位為帶鉤莖枝，但是其占整個(gè)藥材的比例較低，資源浪費(fèi)較為嚴(yán)重。近來研究顯示，鉤藤非藥用部位的化學(xué)成分與藥用部位成分相似，課題組前期利用HPLC測(cè)定了黔產(chǎn)鉤藤不同藥用部位鉤藤堿和異鉤藤堿的含量?；谇捌诨A(chǔ)，本研究對(duì)鉤藤非藥用部位莖和葉進(jìn)行化學(xué)成分的分離和純化，從中分離得到19個(gè)化合物，運(yùn)用核磁、質(zhì)譜等波譜技術(shù)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，其中，化合物 1， 8， 10， 16 均為首次從鉤藤植物中分離得到。同時(shí)，采用MTT法對(duì)化合物3和5進(jìn)行了抗腫瘤活性篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化合物3對(duì)人白血病細(xì)胞HEL有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為17.96 μg·mL-1，然而其對(duì)人白血病細(xì)胞K562并無抑制作用?；衔?對(duì)人白血病細(xì)胞K562的抑制作用較強(qiáng)，IC50值為16.45 μg·mL-1，對(duì)人白血病細(xì)胞HEL具有較弱的抑制作用。盡管化合物3和5對(duì)人白血病細(xì)胞株K562和HEL 2株癌細(xì)胞的增殖抑制作用比陽性對(duì)照紫杉醇、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、順鉑和5-氟尿嘧啶的抑制作用弱，但從一定角度上表明，鉤藤中生物堿類化合物具有抗腫瘤活性，為后續(xù)鉤藤生物堿類化合物的分離以及活性篩選提供思路。

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（責(zé)任編輯 李 莉）