隗陽 水燕 朱光艷 徐鋼春

摘要：克氏原螯蝦是世界上分布最廣、養(yǎng)殖最普遍的淡水螯蝦。該蝦肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外市場歡迎，消費量巨大?？耸显r具有廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景，然而苗種供應不足的問題一直制約著克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，規(guī)模化的人工繁殖是克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)化的起點和突破口。本文概述了克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的形態(tài)結構變化、生化組成及營養(yǎng)代謝、酶活研究、分子和組學研究以及生態(tài)因子對克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的影響，并且概述了胚胎離體孵化的相關技術進展，探討了克氏原螯蝦離體孵化的思路和方法以及對未來克氏原螯蝦育種的展望。

關鍵詞：克氏原螯蝦;胚胎發(fā)育;離體孵化;甲殼動物;人工繁殖

中圖分類號： S917? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）15-0025-07

收稿日期：2020-12-21

基金項目：中國水產(chǎn)科學研究院科技創(chuàng)新團隊（長江特色水生動物繁養(yǎng)創(chuàng)新團隊）;國家重點研發(fā)計劃“藍色糧倉科技創(chuàng)新”重點專項（編號：2019YFD0900305）。

作者簡介：隗 陽（1996—），男，湖北襄陽人，碩士研究生，研究方向為克氏原螯蝦種質(zhì)資源利用。E-mail：1652687478@qq.com。

通信作者：徐鋼春，博士，研究員，研究方向為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖技術。E-mail：xugc@ffrc.cn。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）別稱淡水龍蝦、小龍蝦，隸屬于甲殼綱（Crustacea）螯蝦科（Cabaridae），現(xiàn)已分布至全國十幾個省市，成為歸化于我國自然水體的一個種[1-3]?？耸显r生長迅速，在池塘養(yǎng)殖條件下，幼蝦5～6個月即可達性成熟[4]。自20世紀90年代以來，隨著克氏原螯蝦消費量的快速增加，其經(jīng)濟利益和營養(yǎng)價值逐漸被人們了解，野生蝦被狂捕濫撈，使其資源急劇下降。目前，克氏原螯蝦的野生資源已遠遠不能滿足市場的需求，人們對克氏原螯蝦消費需求的快速上升加速了其養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其人工養(yǎng)殖與苗種繁育受到人們的廣泛重視[5]。

克氏原螯蝦是當今世界范圍內(nèi)最主要的淡水螯蝦養(yǎng)殖種類，其產(chǎn)量占所有螯蝦產(chǎn)量的70%～80%[6-8]。目前來說，克氏原螯蝦的人工繁殖技術已基本成熟，但規(guī)?；绶N繁育技術尚未突破，尤其是苗種問題無法得到有效解決。苗種的緊缺制約了克氏原螯蝦規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，克氏原螯蝦苗種可控化、規(guī)?；a(chǎn)勢在必行[9-11]。

克氏原螯蝦的受精卵及第一期幼體都要附著在母體的腹肢上，故人工孵化時需精心飼養(yǎng)抱卵蝦，科學調(diào)節(jié)水質(zhì)，這不僅增加了親蝦的管理成本，并且不能保證孵化蝦苗的可控性。若能將克氏原螯蝦受精卵離體孵化，則可減少抱卵蝦的飼養(yǎng)管理成本，實現(xiàn)低成本、可控化、規(guī)模化、高效益培育蝦苗。因此，掌握克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程，了解其胚胎發(fā)育所需要的條件，分析提高離體孵化率及成活率的措施，針對性地開展克氏原螯蝦的離體孵育技術研究變得極為重要。

1 胚胎發(fā)育的研究進展

1.1 受精作用和胚胎形態(tài)結構

克氏原螯蝦受精卵形成之前，精子發(fā)生在輸精管中，包括精子原體轉化為精子的一系列事件。克氏原螯蝦精子細胞的組織結構與其他動物群體中典型的鞭毛精子有顯著差異。在研究充分的十足目動物中，精子不僅不典型，而且不能運動[12]。Niksirat等對螯蝦科叉肢螯蝦屬（Orconectes）、原螯蝦屬（Procambarus）和螯蝦屬（Astacus）3屬精子的超微結構進行了觀察比較。頂端帶的形成、頂體穗的存在或突出是精子成熟的標志?？耸显r精囊由包裹著3層精囊壁的精子團組成，精囊中間層的基質(zhì)呈網(wǎng)狀，其中的顆粒釋放出內(nèi)容物。隨著受精的開始，精囊壁被雌性腺體的釉狀分泌物溶解，胞外包膜、質(zhì)膜和膜片等被除去，精子從頂體前部釋放出成束的絲[13]。此外，精子從包膜中釋放后形成細絲/水滴結構，有助于克氏原螯蝦（非運動精子動物的代表）卵子-精子的結合，形成受精卵[14]。也有研究顯示，克氏原螯蝦的卵母細胞被第1層包膜所包圍，其皮層內(nèi)有3種類型的囊泡，受精卵活化過程中，形態(tài)發(fā)生了廣泛的變化。受精時，克氏原螯蝦卵子的皮層反應至少持續(xù)24 h。其卵子的受精外殼由第1層和第2層包膜組成，分別由卵巢和皮層反應構成。此外，還發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦卵母細胞的附著柄來源于卵母細胞的第1層包膜[15]。

克氏原螯蝦的生活史從受精卵開始，緊接著是胚胎發(fā)育，達到性成熟后繁衍后代，最后衰老死亡?？耸显r產(chǎn)卵量較少（200～800粒），單個卵粒較大，卵徑達2.0 mm。其胚胎發(fā)育速度較快，受精卵經(jīng)6～10周可孵出幼苗，幼苗吸附于母體1～2周，3周后可獨立生活，從孵出到幼蝦要經(jīng)過11次蛻殼，幼蝦再經(jīng)過多次蛻殼才能達到性成熟[16]。其胚胎發(fā)育過程的分期并沒有一個統(tǒng)一的劃分方法。目前，大多數(shù)研究中將克氏原螯蝦的胚胎發(fā)育劃分為9期，即受精卵期（fertilized eggs）、卵裂期（cleavage stage）、囊胚期（blastula stage）、原腸期（gastrula stage）、前無節(jié)幼體期（egg-nauplius stage）、后無節(jié)幼體期（egg-metanauplius stage）、復眼色素期（eye pigment stage）、預備孵化期（prehatching stage）和孵化期（hatching stage）[16-17]，也有研究將其劃分為7期[18-19]和12期[20-22]。當心跳頻率約為200次時，幼體很快破殼而出，即為第1期幼體。初孵幼體體型與成體基本相同，腹部卷曲，活動能力很弱，依靠卵黃為營養(yǎng)物質(zhì)，附著在母體腹足上生活。第1期幼體須附著在母體上15 d左右，期間完成2次蛻殼，將卵黃完全消耗殆盡，待環(huán)境條件適宜，才完全脫離母體，在水中營自由生活[17]。

克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中，其胚胎顏色產(chǎn)生了一系列變化。最初受精卵為橄欖綠色，隨后顏色加深，囊胚期呈灰綠色，原腸期胚胎呈灰褐色，隨后的幾個發(fā)育時期，胚胎顏色依次呈棕褐色、紅褐色、暗紅色。這種胚胎外部顏色的變化與其胚胎不同發(fā)育階段具有一定的對應性。許多淡水螯蝦類的胚胎發(fā)育均呈現(xiàn)類似的顏色變化[23-24]。從卵的顏色變化可以進一步判斷其所處的發(fā)育時期，有利于指導克氏原螯蝦的人工育苗生產(chǎn)。

1.2 胚胎的生化組成及營養(yǎng)代謝

通常甲殼動物受精卵的卵黃中含有豐富的可供胚胎發(fā)育所需的蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物，而蛋白質(zhì)是卵黃中含量最高的物質(zhì)之一，在胚胎發(fā)育過程中不僅是構成組織的物質(zhì)基礎，也是維持胚胎發(fā)育新陳代謝的重要能源物質(zhì)。研究表明，甲殼動物抱卵孵化的過程中，主要依靠卵子成熟過程中所積累的卵黃提供結構和能量物質(zhì)，親本和胚胎之間不存在營養(yǎng)物質(zhì)交換[1-2]。近10年來，對甲殼動物胚胎發(fā)育營養(yǎng)需求的研究有很多，包含甲殼動物對脂質(zhì)、脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、類胡蘿卜素、維生素和礦物質(zhì)等的營養(yǎng)需求[25]。

戴穎在克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的研究中指出，可溶性蛋白質(zhì)含量在胚胎發(fā)育過程中總體呈下降趨勢，胚胎發(fā)育早期快速降低，從受精卵期到原腸期下降了24%，這可能是因為早期的細胞分裂須要消耗大量卵黃中的蛋白質(zhì)，以及為胚胎發(fā)育提供組織或器官的構建物質(zhì)，而在隨后的發(fā)育期中可溶性蛋白質(zhì)含量下降比較緩慢，表明胚胎已進入胚胎組織或器官的形成階段[19]。這與姚俊杰在羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）胚胎發(fā)育主要營養(yǎng)物質(zhì)代謝的研究中發(fā)現(xiàn)的可溶性蛋白含量變化類似，可溶性蛋白含量隨著胚胎發(fā)育的進行逐漸降低[24]。研究中還發(fā)現(xiàn)，總蛋白的含量也呈下降趨勢，表明蛋白質(zhì)是主要的能源物質(zhì)，卵內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)應該進行著異化和同化作用，一部分的蛋白質(zhì)用于構建組織和器官，另一部分的蛋白質(zhì)則被分解，為胚胎提供能量[19]。羅文對紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）胚胎營養(yǎng)代謝的研究和田華梅等對中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）的研究也得到了類似的結果，即紅螯螯蝦和中華絨螯蟹胚胎發(fā)育過程中，蛋白質(zhì)含量隨著胚胎發(fā)育的進行而不斷下降。在中華絨螯蟹的整個胚胎發(fā)育過程中，在對幾種水解酶的活力測定中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)水解酶和胃蛋白酶的比活力遠遠高于脂肪酶的比活力，因此表明蛋白質(zhì)不僅是作為中華絨螯蟹胚胎發(fā)育的結構物質(zhì)，而且也是主要能源物質(zhì)[26-27]。

董衛(wèi)軍研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦的胚胎發(fā)育與其他甲殼動物相類似，隨著胚胎發(fā)育的進行，構成組織和器官的細胞增多，水分含量呈上升趨勢，發(fā)育到孵化期達到最高點，增加了自身的體積，以便突破卵膜，從卵內(nèi)孵出[28]。在克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中，總糖含量基本呈下降趨勢?？偺窃诳耸显r整個胚胎發(fā)育階段總體含量偏低，這說明它不是克氏原螯蝦胚胎發(fā)育的主要能源物質(zhì)。卵裂期、原腸期總糖含量快速下降，可能與糖參與形成各種蛋白質(zhì)、脂類復合物有關;無節(jié)幼體期糖含量回升可能是為以后甲殼的形成做準備，而隨著甲殼的形成消耗，到最后時期糖含量又逐漸下降[28]，這與姚俊杰等的研究結果[24，29]類似。克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中，氨基酸含量的變化呈拋物線狀，即從受精卵期、卵裂期到孵化期，氨基酸含量先上升后下降，在必需氨基酸中異亮氨酸的含量很高，非必需氨基酸中谷氨酸的含量最高。但在胚胎發(fā)育的代謝組學研究中，氨基酸易轉化成其他物質(zhì)，因此變異系數(shù)較大。董衛(wèi)軍的研究表明，克氏原螯蝦各期胚胎發(fā)育過程中，脂肪酸的組成結構沒有顯著變化，其中單不飽和脂肪酸（MUFA）含量最高，其次為多不飽和脂肪酸（PUFA），飽和脂肪酸（SFA）含量最低[28]，這與姚俊杰對羅氏沼蝦胚胎發(fā)育的研究結果有所不同，在羅氏沼蝦中，油酸是主要的能源物質(zhì)[24]。由此可見，蝦類胚胎中主要脂肪酸的組成含量存在種間差異，這可能與不同蝦類所經(jīng)歷的胚胎發(fā)育時間的長短有關。

營養(yǎng)對十足目甲殼動物性腺成熟、繁殖性能及胚胎發(fā)育等具有至關重要的作用，營養(yǎng)不足會導致性腺不成熟，精子和卵子的質(zhì)量變差，進而影響胚胎發(fā)育。Muzaffer等通過分析輸精管和精包囊中的精子數(shù)、精子活力、精包囊大小等參數(shù)，來確定十足綱甲殼動物精子質(zhì)量，進而闡述影響十足目甲殼動物精子產(chǎn)生和精子質(zhì)量的因素，如精巢營養(yǎng)對甲殼動物性腺成熟和精子質(zhì)量具有不可或缺的作用[30]。Oraporn等研究比較了野生斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）與飼料喂養(yǎng)的斑節(jié)對蝦中花生四烯酸（AA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的含量以及繁殖性能對比。結果發(fā)現(xiàn)，野生斑節(jié)對蝦的精子囊中AA含量高于人工飼料喂養(yǎng)的對蝦。天然活飼料的一個顯著特點是具有較多的長鏈脂肪酸，即n3和n6高不飽和脂肪酸（HUFA），高不飽和脂肪酸參與生殖和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展、生物膜的生產(chǎn)、類固醇激素的合成和卵黃形成。在所有的自然生物體中，多毛綱動物（Polychaeta）被認為是最好的天然餌料，多毛綱不僅含有高水平的蛋白質(zhì)、脂類和HUFA，而且還具有幾種激素活性化合物。但是，生產(chǎn)多毛綱作為飼料來源并不總是可靠的，存在營養(yǎng)價值波動、可能的疾病傳播、自然棲息地和動物數(shù)量減少、日益上漲的價格等問題。該研究模擬了多毛綱動物的營養(yǎng)特性，特別是其油脂含量的實用膳食，建立了一種促進對蝦繁殖成熟的配方飼料。結果顯示，AA（而不是DHA）對雄蝦生殖組織發(fā)育成熟具有促進作用。精子囊中AA水平顯著對蝦的精子總數(shù)較多。飼料中脂肪酸的不平衡會對繁殖產(chǎn)生負面影響，會造成異常精子比例較高，活精子比例較低。在飼料中尋找最佳AA濃度對提高對蝦雄性繁殖質(zhì)量有重要意義[31]。這與Binh等對海洋多毛綱動物提取物對日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）卵巢成熟及組織脂質(zhì)成分[32]影響的研究類似。該研究表明，日糧中添加海洋多毛綱動物提取物n3高不飽和脂肪酸對日本對蝦卵巢成熟至關重要，多毛綱中脂質(zhì)提取物對日本對蝦卵巢成熟最有效，以游離氨基酸和多肽為主的可溶性提取物次之[32]。Xu等對膳食油脂來源對中國對蝦（Penaeus chinensis）育苗繁殖力、卵孵化力及脂肪酸組成的影響進行了研究，結果表明，以豬油飼糧喂養(yǎng)的中國對蝦繁殖能力差、卵孵化率低。飼喂亞麻籽和玉米油日糧的產(chǎn)卵率有所提高，然而，孵化性沒有明顯改善。以鳳尾魚油飼糧喂養(yǎng)，其繁殖力和卵孵化力均有顯著提高。以鳳尾魚油為唯一膳食脂質(zhì)的對蝦中n3高不飽和脂肪酸含量最高。結果表明，n3高不飽和脂肪酸在甲殼動物繁殖過程中可能發(fā)揮著不同的和特定的作用，必須包含在繁育飼料中[33]。

1.3 胚胎發(fā)育的酶活性研究

克氏原螯蝦以抱卵的方式進行孵化，而抱卵孵化蝦蟹的胚胎發(fā)育僅依靠自身儲存的豐富卵黃作為營養(yǎng)物質(zhì)，在胚胎發(fā)育過程中卵黃物質(zhì)的分解、運輸和利用與酶的種類及活性變化密切相關。戴穎研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦胚胎中的4種消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）從受精卵期開始就有活力，表明母體在卵母細胞形成過程中已將相關的酶或卵源性mRNA轉運并儲存在卵黃中，能為胚胎發(fā)育早期卵內(nèi)物質(zhì)的水解提供保障[19]。胚胎發(fā)育的基因調(diào)控受卵源性mRNA和自身合子基因的雙重影響，在胚胎發(fā)育初期主要依賴卵源性mRNA合成各種蛋白質(zhì)，而合子基因影響甚微。然而，隨著胚胎發(fā)育的不斷深入，卵源性mRNA持續(xù)消耗，母體提供的相關酶類隨之減少，而此時的胚胎尚未形成完整的消化系統(tǒng)，自身不能合成相關酶類，從而導致隨后的發(fā)育期（卵裂和囊胚期、原腸期）胃蛋白酶活性不斷降低。原腸期后隨著細胞快速分化和組織、器官的出現(xiàn)，尤其是肝胰腺及消化系統(tǒng)的逐漸形成，胃蛋白酶的比活力出現(xiàn)小高峰，胰蛋白酶的比活力達到最高值，這與姚俊杰對羅氏沼蝦的研究結果[24]類似，胃蛋白酶活力原腸期最低，隨后的胚胎發(fā)育時期里胃蛋白酶活力逐漸上升。此外，胃蛋白酶和胰蛋白酶活力在出膜前期的升高，表明胚胎已為幼體的攝食作好準備，這也表明消化酶的產(chǎn)生是受基因控制而不是餌料刺激所致[19]。

此外，在克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中，淀粉酶有活力，且酶活性有顯著變化，原腸期最高，其他時期活性都較低且活力相差不大，原腸期后，3種比活力較高的消化酶（淀粉酶、類胰蛋白酶和胃蛋白酶）活性都有較明顯的下降，其原因可能是隨胚胎發(fā)育卵源性mRNA持續(xù)消耗，而合子本身合成的mRNA較少，尚未完全發(fā)揮功用，以及消化系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，即胚胎自身還不能合成相關酶類，導致隨后的胚胎發(fā)育階段酶活性不斷下降。綜合來看，整個胚胎發(fā)育過程可以根據(jù)生化物質(zhì)和酶類活力變化分為2個階段：母型控制階段和合子型控制階段[19]。這與趙艷民對日本沼蝦胚胎發(fā)育的研究類似[29]。該研究對日本沼蝦胚胎發(fā)育過程中4種消化酶類胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶活性進行了測定。其中，類胰蛋白酶和胃蛋白酶在受精卵期就已經(jīng)表現(xiàn)出比較強的活性，隨著胚胎發(fā)育至原腸期，2種消化酶活力達到最高，隨著母源mRNA逐漸被合子型基因所取代，消化酶活性開始下降，直到后無節(jié)幼體期開始，有所升高[29]。

Mohd等對羅氏沼蝦幼體發(fā)育過程中消化酶活性的變化研究顯示，羅氏沼蝦早期幼蟲為專食肉食性，羅氏沼蝦幼體發(fā)育過程中消化酶的活性似乎與肝胰臟的發(fā)育過程具有一致性[34]。Genodepa等對青蟹（Scylla serrata）胚胎發(fā)育期間和新孵化幼體饑餓后的主要消化酶進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)是青蟹胚胎發(fā)育早期利用的第1個能量儲備，這可以從酯酶活性早期顯著增加而淀粉酶和蛋白酶活性相對較低且穩(wěn)定可以看出。隨著現(xiàn)成的脂質(zhì)儲備逐漸枯竭，不足以滿足胚胎發(fā)育末期日益增加的能量需求，蛋白質(zhì)和某種程度上的碳水化合物被越來越多地利用。這可以通過酯酶活性水平來證明，與蛋白酶和酯酶活性在胚胎發(fā)育的最后階段顯著增加相一致[35]。這些結果強調(diào)了脂質(zhì)儲備在青蟹胚胎發(fā)育中的重要性，以及適當均衡的營養(yǎng)和管理的重要性，以確保這些儲備的積累，以生產(chǎn)高質(zhì)量的青蟹苗種。

1.4 生態(tài)因子對胚胎發(fā)育的影響

甲殼動物生境（生態(tài)因子）對甲殼動物的生長和胚胎發(fā)育具有至關重要的作用。在自然環(huán)境下，甲殼動物在特定的季節(jié)，水溫、光照周期、鹽度等生態(tài)環(huán)境適宜的時候，其性腺才會成熟，會儲藏能量交配產(chǎn)卵，集中繁育后代;當環(huán)境惡劣時，甲殼動物的性腺可能發(fā)育殘缺或營養(yǎng)不良，出現(xiàn)交配少、產(chǎn)卵率低、孵化率低等情況。關于生態(tài)因子對甲殼動物胚胎發(fā)育影響的研究已經(jīng)有很多。徐加元在物理因子對克氏原螯蝦繁殖和生長的研究中指出，健康蝦類親本的性腺發(fā)育、繁殖力、受精率、胚胎孵化及其后續(xù)自營養(yǎng)階段幼體的質(zhì)量和存活率不僅與其所處生態(tài)環(huán)境中的物理因子息息相關，還與親本的營養(yǎng)狀況關系密切相關，該研究表明，在水溫、光周期和飼料組成的3個因素中，對雌蝦成活率的影響大小順序為水溫>飼料組成>光周期;對雌蝦性腺發(fā)育的影響大小順序為飼料組成>水溫>光周期[36]?？梢娝疁睾凸庹罩芷诓粌H對克氏原螯蝦性腺發(fā)育有影響，甚至會造成克氏原螯蝦死亡。

王慶等通過增加水溫來刺激克氏原螯蝦性腺發(fā)育及交配抱卵，結果顯示，經(jīng)過38 d的加溫刺激，在26 ℃下陸續(xù)觀察到抱卵，而18 ℃以下未觀察到，但該水溫能促進雌蝦卵巢發(fā)育。雌蝦經(jīng)加溫刺激后所抱卵在18、21、26 ℃水溫下均能正常孵化出幼蝦，而且孵化所需時間隨著溫度的提升而縮短[37]。這與李庭古等的研究類似，在一定溫度范圍內(nèi)（20～30 ℃），溫度越高，孵化時間越短[22，38]。Jin等在通過控制水溫優(yōu)化克氏原螯蝦繁殖性能和胚胎發(fā)育的研究中同樣指出，控制水溫是誘導產(chǎn)卵和優(yōu)化胚胎發(fā)育以提高克氏原螯蝦產(chǎn)量的有效途徑[39]，這對可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。在該研究中，提高克氏原螯蝦繁殖性能的最佳溫度為21～25 ℃，而胚胎發(fā)育的最佳溫度為25 ℃，可以縮短胚胎發(fā)育時間，避免胚胎異常和死亡，同時還建立了一個依賴于溫度的發(fā)育模型[39]。這與Carmona-Osalde等的研究類似，溫暖的水溫能夠加速克氏原螯蝦產(chǎn)卵和胚胎發(fā)育[40-41]。甲殼動物的生長、脫皮、生殖無不受光照和溫度的影響與調(diào)控，越是低等動物，受光照和溫度的影響越大[42]。宋光同等研究了光照度對克氏原螯蝦繁殖效果的影響，結果表明，利用遮陽網(wǎng)將白天光照度調(diào)控在100 lx以下時，克氏原螯蝦的抱卵率顯著高于對照組（2.5倍）[43]。這與強曉剛等利用水草等遮蔽物促進克氏原螯蝦繁殖、受精卵孵化具有一致性[44-45]。張龍崗等研究了光照和餌料對克氏原螯蝦親蝦性腺發(fā)育的影響，結果顯示，光照和餌料對克氏原螯蝦雌蝦的性腺發(fā)育均具有重要影響。在這2個試驗因子中，餌料對克氏原螯蝦性腺發(fā)育影響最大，光照的影響次之。在投喂動物性餌料的2組中，遮光組的克氏原螯蝦性腺系數(shù)（4.02%）要明顯高于不遮光組（3.58%），而投喂顆粒配合餌料的試驗組中沒有遮光的池塘，克氏原螯蝦性腺成熟系數(shù)也是最低的（2.34%）。光照時間太長會降低克氏原螯蝦雌蝦的性腺成熟系數(shù)，說明過長的光照會抑制雌蝦的性腺發(fā)育[46]。這一研究結果與羅文等對紅螯螯蝦的研究結果相類似，該試驗結果同樣佐證，相同投餌條件下，設置遮陽網(wǎng)有利于克氏原螯蝦性腺的發(fā)育[47-48]。

國外也有關于生態(tài)因子對甲殼動物影響的研究，Aiken對溫度和光周期對克氏原螯蝦卵巢成熟和產(chǎn)卵的影響進行了更進一步的研究，結果表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中存在一種刺激排卵的物質(zhì)，一些跡象表明，神經(jīng)分泌與季節(jié)性生殖活動之間存在相關性，只有當溫度和光周期在規(guī)定的時間內(nèi)達到適當比例時，才能保證克氏原螯蝦卵巢完全成熟并產(chǎn)卵[49]。這在Fanjul-moles等對光周期和光強度變化對克氏原螯蝦耗氧量、乳酸濃度和行為的影響研究中也得到證明，光對控制行為和代謝功能的神經(jīng)和內(nèi)分泌結構有影響[50]。Ardavan等在光周期影響雄性細趾小螯蝦（Pontastacus leptodactylus）的配子產(chǎn)生、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，黑暗會增加雄性細趾小螯蝦的配子產(chǎn)量，長光照則會降低配子的產(chǎn)量。此外，恒定的光照會提高肝胰臟的總蛋白含量，光周期影響肝胰臟的氨基酸和脂肪酸譜[51]。這與Harliogˇlu等在黑暗（無光照條件）對淡水螯蝦交配和產(chǎn)卵時間影響的研究中類似，黑暗 24 h 無光照條件下，雌性淡水螯蝦產(chǎn)卵率較高，交配和產(chǎn)卵時間要早于其他暴露于光照下的組[52]。

鹽度、pH值、密度、農(nóng)藥殘留等也會對克氏原螯蝦的胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響，pH值、鹽度和堿度之間還有毒性共同作用。李庭古在鹽度對克氏原螯蝦孵化率的影響研究中發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦受精卵孵化過程中對鹽度要求較為嚴格，鹽度高低直接影響克氏原螯蝦受精卵胚胎的滲透壓調(diào)節(jié)。鹽度低于4時，克氏原螯蝦受精卵孵化率較高且穩(wěn)定。高于此鹽度時，隨著鹽度升高，孵化率急劇下降，鹽度10時無幼體孵出。由試驗數(shù)據(jù)可知，克氏原螯蝦受精卵孵化的適宜鹽度范圍為0～4[22]。Barki等研究了雌性紅爪小龍蝦（Cherax quadricarinatus）在擁擠的小罐孵化場條件下的密度極限。結果表明，繁殖的紅爪雌性小龍蝦對大范圍密度的擁擠不太敏感。在室內(nèi)孵化場條件下，孵化密度高于60只/m2是可行的[53]。Vogt研究發(fā)現(xiàn)，在克氏原螯蝦胚胎時期，將卵暴露于甲基睪丸素中，會降低孵化成功率和生長，并引發(fā)致畸效應[54]。

1.5 分子和組學研究

隨著傳統(tǒng)遺傳學、分子生物學及電鏡技術等現(xiàn)代研究方法的引入，從分子結構和組學層面對于甲殼動物胚胎發(fā)育的研究成為了熱點。Jiang等對克氏原螯蝦的轉錄組分析，從小龍蝦睪丸和卵巢文庫中共獲得1 134 993條高質(zhì)量序列，揭示了參與性腺發(fā)育的基因（卵黃蛋白原、周期蛋白B、周期蛋白依賴性激酶2、Dmc1和泛素等）[55]。這些數(shù)據(jù)將有助于發(fā)展人工調(diào)控克氏原螯蝦繁殖的新思路。Kang等研究了來自克氏原螯蝦卵巢的轉錄組信息，共讀取了31 080 133個基因，組裝了69 261個基因序列，獲得了卵巢的深度覆蓋轉錄組測序數(shù)據(jù)。對PcRDH11基因進行敲除，可導致克氏原螯蝦卵巢中的卵黃蛋白原（Vg）和卵黃蛋白原受體（VgR）表達水平降低，導致胚胎發(fā)育停滯[56]。Ngernsoungnern等研究了斑節(jié)對蝦卵巢中促性腺激素釋放激素（GnRH）對卵巢成熟的影響，發(fā)現(xiàn)促性腺激素釋放激素促進了蝦的受精和產(chǎn)卵，促性腺激素釋放激素可能是高度保守的肽，在誘導蝦卵巢成熟的過程中發(fā)揮著重要作用[57]。

2 克氏原螯蝦胚胎離體孵化技術的發(fā)展

克氏原螯蝦胚胎離體孵化是將親蝦與受精卵分離，然后對受精卵給予特定的孵化條件，使之破膜成為幼蝦的過程。目前，克氏原螯蝦胚胎離體孵化的相關研究并不多。對日本米蝦胚胎發(fā)育及離體孵化的研究中，將各時期的胚胎分別置于自制的離體孵化裝置中，同時在孵化裝置的玻璃缸中放入胚胎發(fā)育至相應時期的抱卵親蝦，孵化期間鹽度為 17.0±1.0，溫度為（25.5±1.0） ℃。結果顯示，各期離體胚胎均能孵化出幼體，但膜內(nèi)溞狀幼體期離體胚胎孵化率最高，為（80.7±2.4）%，與非離體孵化的對照組（79.1±49）%相比，二者差異不顯著。卵裂期離體胚胎孵化率最低，為（28.2±2.6）%，與對照組差異顯著。其中，溫度對離體胚胎孵化時間、孵化率和離體孵化出幼體的質(zhì)量具有影響。在15.0～32.5 ℃范圍內(nèi)，隨著水溫升高孵化時間逐漸縮短。但溫度高于29.0 ℃時，孵化出的幼體變態(tài)率開始下降[58]。

波紋龍蝦（Panulirus homarus）胚胎的離體培養(yǎng)及發(fā)育觀察的研究結果表明，各期胚胎在相同條件下分別進行離體培養(yǎng)，均能孵化出健康幼體。卵裂期、原腸期、中眼色素形成期、復眼色素形成期和心跳期的胚胎平均孵化率依次為 35.0%、38.4%、546%、71.0%和80.0%[59]。可見，初始培養(yǎng)胚胎越接近出膜期，其孵化率越高。中華絨螯蟹胚胎離體孵化方面也有研究，將中華絨螯蟹不同發(fā)育期的胚胎從腹肢基部剪下后在室溫下孵化。結果表明，處于卵裂期、囊胚期和原腸期的胚胎離體孵化率（42.16%～54.90%）無顯著性差異;從原腸期開始，離體孵化的孵化率隨著離體時間的縮短呈升高的趨勢，即眼點期（68.95%±589%）和心跳期（77.47%±5.45%）極顯著高于前3個時期，對外界環(huán)境的適應性也增強。試驗證明，剪掉抱卵腹肢進行胚胎離體孵化，不但促進了親蟹卵巢的快速發(fā)育，而且還降低了投喂、調(diào)節(jié)水質(zhì)等費用[60-61]。

隨著對各種生態(tài)因子如水溫、光照、鹽度、營養(yǎng)等的深入研究，為摸索克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程最適宜的外在條件提供了理論基礎。而克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中形態(tài)結構、生理變化的研究，展示了其中物質(zhì)能量的轉移變化。對胚胎發(fā)育過程中各種激素的研究，能為控制誘導繁殖產(chǎn)卵和胚胎發(fā)生提供理論支撐。對卵巢發(fā)育和胚胎發(fā)生中分子生物學的研究，揭示了甲殼動物卵巢發(fā)育的分子調(diào)控機制，同時，將有助于開發(fā)人工調(diào)節(jié)克氏原螯蝦繁殖產(chǎn)卵的新技術。這些外在條件和內(nèi)在機制的研究都將為選擇離體培養(yǎng)時期、找到最適的生態(tài)因子、提高孵化率和成活率提供理論支撐。

3 趨勢與展望

甲殼動物多為體外受精，且有許多種類的受精卵須附著在母體腹部的附肢剛毛上完成孵化過程，這就為觀察其形態(tài)發(fā)育提供了方便。但是，想要突破表面進行深層面的研究往往需要研究技術的突破創(chuàng)新。借助于早期的顯微鏡技術，初步了解了部分甲殼動物發(fā)育過程中的外部形態(tài)特征為甲殼動物胚胎發(fā)育學的研究奠定了基礎。之后，隨著石蠟切片技術、電子顯微鏡技術、生化和分子生物學技術的發(fā)展引入，關于甲殼動物胚胎發(fā)育的研究得到深入發(fā)展，不再停留于觀察表面形態(tài)變化的層面。目前，借助于新的研究手段，很多學者在觀察精子和卵子的細微結構、觀察胚胎發(fā)育過程中各個階段的內(nèi)在結構變化、生態(tài)因子對胚胎發(fā)育的影響、揭示甲殼動物胚胎發(fā)育過程中相關激素和基因調(diào)控機制等方面做了大量深入的工作。

隨著克氏原螯蝦胚胎發(fā)育過程中，結構形態(tài)發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)代謝、相關酶學、激素、基因調(diào)控、生境影響等的研究，克氏原螯蝦完整的胚胎發(fā)育過程包括調(diào)控機制等等已經(jīng)越來越清晰地呈現(xiàn)在我們面前。加上新的研究手段日新月異，預計不久的將來，我們將能夠精準控制包括克氏原螯蝦在內(nèi)的甲殼動物的繁殖和胚胎發(fā)育，最終實現(xiàn)克氏原螯蝦的全人工規(guī)?；?，使苗種問題不再成為制約克氏原螯蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

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