刁云輝 劉 琳 沙金平 薛 萌

1.河南省南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (河南 南陽，473000) 2.河南省南陽市中心醫(yī)院心內(nèi)一科

肝癌是常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴重威脅人類生命健康[1]。長春新堿主要是從長春花葉中提取的二聚吲哚類化合物，具有良好的抗腫瘤作用。長春新堿通過作用于腫瘤細胞微管蛋白而干擾腫瘤細胞代謝，在臨床中主要用于治療急性淋巴細胞白血病、何金杰及非何金杰淋巴瘤[2]。磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路參與調(diào)控細胞的增殖、凋亡等生命過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3，4]。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活可促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[5]。目前，長春新堿能否通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗肝癌作用還未知。因此，本研究以肝癌Hep3B細胞為研究對象，旨在探究長春新堿對Hep3B細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及是否通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 肝癌細胞系Hep3B購自中國科學(xué)院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；胰島素樣生長因子-1(IGF-1)購自美國Sigma公司；兔抗人Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和β-肌動蛋白(β-actin)抗體購自北京中杉金橋生物試劑公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hep3B細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為溫度37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%。當(dāng)細胞融合至80%時，0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶2～1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組處理 Hep3B細胞分為對照組(NC組)、不同濃度(0.02、0.04、0.08 μmol/L)[6]長春新堿組、長春新堿+IGF-1組。對照組細胞常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)24 h；不同濃度長春新堿組細胞分別用含終濃度為0.02、0.04、0.08 μmol/L長春新堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；長春新堿+IGF-1組細胞用含終濃度為0.04 μmol/L長春新堿和100 ng/ml IGF-1[7]的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 調(diào)整Hep3B細胞濃度為2.5×104個/ml，每孔200 μl接種于96孔板中。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，加入10 μl CCK-8試劑，酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 調(diào)整Hep3B細胞濃度為2.5×104個/ml，每孔1.0 ml接種于24孔板中。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，胰蛋白酶消化，收集細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，加入10 μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min。加入5 μl PI，避光孵育10 min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 調(diào)整Hep3B細胞濃度為5×104個/ml。遷移實驗：取Transwell上室加入100 μl細胞懸液，下室加入500 μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基。取出小室，以4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，拍照并計數(shù)。侵襲實驗：Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后加入100 μl細胞懸液，后續(xù)操作同遷移實驗。

1.2.6 Western Blot法檢測細胞中相關(guān)蛋白表達 RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA法測定蛋白含量后進行定量，然后行10% SDS-PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉2 h。分別加入Ki-67(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗，4℃孵育過夜。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度長春新堿對Hep3B細胞增殖的影響 與NC組比較，不同濃度長春新堿作用Hep3B細胞后，細胞OD 450 nm值和Ki-67蛋白表達降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western Blot檢測不同濃度長春新堿對Hep3B細胞中Ki-67蛋白表達的影響

表1 不同組別對Hep3B細胞OD450nm值和Ki-67蛋白表達的影響

2.2 長春新堿對Hep3B細胞凋亡的影響 與NC組比較，不同濃度長春新堿作用Hep3B細胞后，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 長春新堿對Hep3B細胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達影響圖 (A.流式細胞儀檢測細胞凋亡；B.Western Blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白表達)

表2 不同組別對Hep3B細胞凋亡的影響

2.3 長春新堿對Hep3B細胞遷移和侵襲的影響 與NC組比較，0.04 μmol/L長春新堿作用Hep3B細胞后，細胞遷移和侵襲數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達降低(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 長春新堿對Hep3B細胞遷移和侵襲的影響圖 (A.Transwell檢測細胞遷移侵襲；B.Western Blot檢測MMP2和MMP9蛋白表達)

表3 不同處理方法組別對Hep3B細胞遷移和侵襲的影響

2.4 長春新堿對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與NC組比較，0.04 μmol/L長春新堿作用Hep3B細胞后，細胞中p-PI3K和p-Akt蛋白表達降低(P<0.05)，見表4、圖4。

圖4 Western Blot檢測p-PI3K、p-Akt蛋白的表達

表4 不同處理方法組別對JAK/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

2.5 IGF-1可以逆轉(zhuǎn)長春新堿對Hep3B細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與0.08 μmol/L長春新堿組比較，長春新堿+ IGF-1組長春新堿作用Hep3B細胞后，細胞OD 450 nm值、遷移和侵襲數(shù)及Ki-67、MMP2和MMP9蛋白表達升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，p-PI3K和p-Akt蛋白表達升高(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 不同處理方法組別對Hep3B細胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

圖5 Western Blot檢測Hep3B細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達圖

3 討論

長春新堿是從夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿，已被臨床用于治療白血病，且具有較好的治療效果，另外其對淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤也具有一定的治療療效。長春新堿的抗腫瘤靶點是微管蛋白，其主要抑制微管蛋白的聚合影響紡錘體的形成，抑制有絲分裂過程。此外，長春新堿還可抑制癌細胞內(nèi)RNA酶活性，導(dǎo)致細胞內(nèi)DNA、嘌呤等物質(zhì)無法正常合成，蛋白質(zhì)代謝紊亂，細胞膜受損等，最終使腫瘤細胞凋亡。

細胞增殖紊亂和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的重要機制之一，抑制腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是腫瘤治療的重要途徑[8]。Ki-67參與細胞有絲分裂過程，是細胞增殖的標(biāo)志性蛋白，可反映細胞增殖活性[9]。caspase-3是caspase家族的重要成員，其活化后進一步切割下游分子，誘導(dǎo)細胞發(fā)生不可逆的凋亡[10]。本研究顯示，長春新堿可劑量依賴性降低Hep3B細胞OD值及Ki-67蛋白表達，而促進Hep3B細胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達，與相關(guān)研究報道[11]結(jié)果一致，表明長春新堿可抑制Hep3B細胞增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用。腫瘤細胞遷移和侵襲是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因[12]，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲對于降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要意義。本研究顯示，0.08 μmol/L長春新堿可劑量依賴性降低Hep3B細胞的遷移和侵襲數(shù)及細胞中MMP2和MMP9蛋白表達，與相關(guān)報道結(jié)果一致[13]，表明長春新堿可抑制Hep3B細胞遷移和侵襲。

PI3K/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和代謝等過程，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。研究顯示，STYXL1可通過激活PI3K/Akt途徑下調(diào)CELF2來促進肝癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[15]。miR-616在肝癌組織和細胞系中表達升高，敲低miR-616通過抑制PI3K/AKT途徑減弱肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[16]。本研究顯示，0.08 μmol/L長春新堿可抑制Hep3B細胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達，提示長春新堿可能通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活發(fā)揮抗肝癌作用。IGF-1是一種促生長肽類激素，可激活PI3K/Akt信號通路[17]。研究顯示，IGF-1可通過促進早期生長反應(yīng)蛋白1(EGR1)表達增強肝癌細胞的遷移和侵襲能力[7]。本研究顯示，IGF-1與長春新堿共同作用Hep3B細胞后，細胞增殖、遷移和侵襲能力升高，而凋亡程度降低，表明IGF-1逆轉(zhuǎn)了長春新堿對Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進作用，進一步說明長春新堿通過抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，長春新堿可抑制肝癌Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用，其作用機制與抑制細胞中PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)。