潘建萍，凌志杰，李明

贛南衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，江西 贛州 341000

2型糖尿病作為臨床目前多發(fā)、常見(jiàn)的慢性代謝疾病，發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、年齡因素、生活方式及飲食習(xí)慣等多種因素密切相關(guān)，其主要發(fā)病特點(diǎn)是糖代謝異常[1-4]。同時(shí)，由糖尿病引發(fā)的血脂異常，也是引發(fā)心腦血管等重要臟器疾病的重要因素[5-6]。其中胰島素受體底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路是胰島素調(diào)節(jié)血糖平衡的關(guān)鍵途徑，它在機(jī)體葡萄糖利用轉(zhuǎn)化等生理功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，具有改善機(jī)體血糖、血脂代謝等作用[7-8]?！侗静菥V目》中記載：山臘梅有清熱解毒、健胃消食之效，同時(shí)Chen Hui等[9]研究中發(fā)現(xiàn)山臘梅葉總乙醇提取物具有降血脂、降血糖和抗氧化等作用，這也預(yù)示著其可能具有降糖作用，但具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。該文基于IRS-1、PI3K、AKT傳導(dǎo)通路研究，探討山臘梅葉乙醇提取物對(duì)高脂高糖糖尿病大鼠血糖血脂的作用及機(jī)制，以期能夠?yàn)榕R床有效用藥提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

取Wistar雄性大鼠75只，年齡7周齡左右，體質(zhì)量平均（240±20）g，大鼠的大小、年齡、體重等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持安靜，室溫調(diào)節(jié)在22～30℃、濕度調(diào)控在40%～70%。

1.2 山臘梅葉提取

實(shí)驗(yàn)藥物取江西佑美山臘梅基地山臘梅葉進(jìn)行乙醇提取。將干燥山臘梅葉粉碎后，經(jīng)多功能提取罐熱回流提取，用10倍體積80%乙醇在60℃溫度條件下反復(fù)提取2次，3 h/次。提取液經(jīng)減壓回收溶劑后真空干燥，得到乙醇提取物浸膏。

1.3 構(gòu)建高脂高糖大鼠模型

利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)+腹腔注射小劑量STZ以此構(gòu)建高血糖、高脂血癥的2型糖尿病大鼠[10-11]。先用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周，使動(dòng)物處于糖尿病前期的輕微的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，后4周根據(jù)大鼠體質(zhì)量，高脂高糖飼料喂養(yǎng)組腹腔注射40 mg/kg檸檬酸緩沖液溶解（STZ），并持續(xù)喂養(yǎng)高脂高糖飼料。注射3 d后，自尾靜脈采血，連續(xù)3 d血糖濃度均>11.1 mmol/L視為造模成功。

1.4 分組與給藥

大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、山臘梅葉提取物低劑量、高劑量組及二甲雙胍組，每15只，各組大鼠體質(zhì)量、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低、高劑量藥物組大鼠分別灌胃給予乙醇提取物250 mg/kg和500 mg/kg，二甲雙胍組灌胃給予大鼠二甲雙胍100 mg/kg，正常組及模型組給予等體積生理鹽水。正常組以正常飼料喂養(yǎng)，其他組以高脂高糖飼料喂養(yǎng)+腹腔注射小劑量STZ處理。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清 膽固醇（TC），三酰甘油（TG）及低密脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量 給藥8周結(jié)束時(shí)，大鼠禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉動(dòng)物，從下腔靜脈缺血，注入離心管（4℃），以3 000 r/min離心20 min后提取血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清TC、TG、LDL-C水平。

1.5.2 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)血清胰島素水平檢測(cè)前先對(duì)樣品進(jìn)行低溫離心，取血漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。在反應(yīng)孔中加人100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)標(biāo)本，在空白孔中加入等量稀釋液，用37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行孵育，孵育后洗滌，最后加酶標(biāo)抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)，反應(yīng)終止后在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度值。

1.5.3 檢測(cè)肝臟相關(guān)蛋白表達(dá) 大鼠取血后處死，小心取出完整肝臟，進(jìn)行液氮預(yù)凍處理，并放到-80℃的冰箱中冷凍保存、待取用。使用蛋白免疫印跡法測(cè)定胰島素抵抗最主要的通路PI3K、AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路中胰島素受體底物（IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT-4）4種相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 山臘梅葉乙醇提取對(duì)大鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功；與模型組比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠空腹血糖及糖化血紅蛋白水平均明顯降低，胰島素水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和胰島素的測(cè)定結(jié)果對(duì)比

表1 各組大鼠血糖、糖化血紅蛋白和胰島素的測(cè)定結(jié)果對(duì)比

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 空腹血糖（mmol/L） 糖化血紅蛋白（%） INS（mU/L）正常對(duì)照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）5.64±0.72（14.76±1.94）a（6.86±0.85）c（8.04±1.06）c（6.48±0.93）c 5.91±1.12（17.56±3.59）a（7.57±1.52）c（10.02±2.96）b（8.43±2.56）c 91.36±19.79（21.25±5.02）a（52.58±11.35）c（38.42±7.82）c（49.38±9.16）c

2.2 山臘梅葉乙醇提取對(duì)大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的影響

與正常組比較，模型組糖尿病大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的測(cè)定結(jié)果對(duì)比[（），mmol/L]

表2 各組大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的測(cè)定結(jié)果對(duì)比[（），mmol/L]

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 TC TG LDL-C正常對(duì)照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）8.14±1.91（16.18±2.97）a（9.26±1.84）c（12.07±3.31）b（10.68±2.18）c 5.42±0.85（9.82±1.65）a（7.57±1.52）b（8.28±2.06）b（7.39±1.68）c 1.93±0.34（10.41±1.95）a（5.56±1.22）c（7.95±1.58）c（4.69±0.83）c

2.3 實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，其他組IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表達(dá)皆降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組及二甲雙胍組大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測(cè)定結(jié)果對(duì)比

表3 實(shí)驗(yàn)大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4測(cè)定結(jié)果對(duì)比

注：與模型組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 IRS PI3K AKT GLUT-4正常對(duì)照組（n=15）模型組（n=15）二甲雙胍組（n=15）低劑量組（n=15）高劑量組（n=15）（1.03±0.24）a 0.32±0.11（0.46±0.14）ab（0.55±0.16）a（0.62±0.21）ab（1.01±0.21）a 0.26±0.08（0.47±0.15）a（0.58±0.1）7ab（0.43±0.12）ab（1.01±0.21）a 0.36±0.13（0.79±0.34）a（0.61±0.21）ab（0.56±0.16）ab（1.00±0.20）a 0.25±0.06（0.68±0.24）ab（0.48±0.16）a（0.62±0.21）ab

3 討論

目前，人們生活水平有了很大的提高，糖尿病臨床發(fā)病率也呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡更見(jiàn)向著年輕化發(fā)展，成為繼腫瘤、心腦血管疾病后的第三大威脅人類(lèi)健康的慢性疾病。胰島素對(duì)體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。胰島素與靶器官細(xì)胞膜表面的胰島素受體結(jié)合，并通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)從而發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝功能[12-14]。IRS-1、PI3K、Akt信號(hào)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑。研究表明IRS-1在體內(nèi)以磷酸化的形式被激活后與下游受體蛋白相互作用，并能夠使其下游的PI3K活化，PI3K被激活后進(jìn)一步活化Akt，Akt活化后能夠進(jìn)一步激活下游蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)能量代謝，增加體內(nèi)葡萄糖消耗，從而抑制體內(nèi)脂質(zhì)的合成[15]。相反，該通路中任何一個(gè)因子或環(huán)節(jié)出現(xiàn)功能障礙或表達(dá)異常均可誘發(fā)胰島素抵抗，出現(xiàn)糖尿病和高脂血癥等多種疾病[16-18]。該次研究結(jié)果顯示，山臘梅葉乙醇提取物能夠上調(diào)IR3、PI3K、AKT水平，加速GLUT-4轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)其向細(xì)胞膜的移位與骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，繼而達(dá)到降低血糖、維持糖代謝平衡的作用。

山臘梅即亮葉臘梅，在江西廣泛分布，是畬族最常用的治療糖尿病的藥材。贛南山區(qū)稱(chēng)食涼茶，又稱(chēng)黃金茶。近年來(lái)，人們也逐漸加大了對(duì)山臘梅的開(kāi)發(fā)力度，山蠟梅單品或以其為主要原料的方劑已加工成山蠟梅葉顆粒，山蠟梅清感茶、山蠟梅滴丸、脾胃舒等成品藥。該研究結(jié)果顯示，與模型組大鼠比較，山臘梅葉乙醇提取物低、高劑量組大鼠空腹血糖、糖化血紅蛋白、血清TC，TG及LDL-C水平均改善，2 h餐后血清胰島素和肝臟IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4蛋白表達(dá)水平均明顯升高，表明山臘梅葉乙醇提取物調(diào)節(jié)血糖平衡，促進(jìn)胰島素分泌的機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路IRS-1、PI3K、Akt途徑磷酸化水平蛋白表達(dá)，提高GLUT4蛋白的表達(dá)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)大鼠對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用，減少脂質(zhì)的生成。