宋昌梅 杲春陽 付燕來 張晉 陳寶貴

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討淫羊藿-五味子藥對治療非酒精性脂肪肝的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）獲取淫羊藿和五味子的化學(xué)成分和靶點(diǎn)，并構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，其中化學(xué)成分的篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18。通過GenCards和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出淫羊藿-五味子治療非酒精性脂肪肝的潛在作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-成分-靶點(diǎn)之間網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：共篩選出藥效成分31個(gè)，藥物與疾病作用交集靶點(diǎn)69個(gè)，涉及109條通路，顯示“淫羊藿-五味子”可能通過作用于IL6、AKT1、CXCL8等關(guān)鍵靶點(diǎn)，主要參與轉(zhuǎn)錄正調(diào)控DNA模板、免疫應(yīng)答、細(xì)胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)等生物學(xué)過程，從而調(diào)節(jié)AGE-RAGE、NAFLD等通路，達(dá)到治療作用。結(jié)論：通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，初步探討出“淫羊藿-五味子”治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制，為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 淫羊藿-五味子;溫陽化氣;非酒精性脂肪肝;經(jīng)驗(yàn)藥對;作用機(jī)制;靶點(diǎn);通路;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Abstract Objective：To explore the action target and mechanism of drug pairs Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis in the treatment of nonalcoholic fatty liver based on network pharmacology.Methods：The chemical components and targets of Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis were obtained from TCMSP and TCMID databases，and the component-target network was constructed.Among them，the screening conditions of chemical components were oral bioavailability （OB）≥30% and drug-like properties （DL）≥0.18.The potential targets of Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis in the treatment of non-alcoholic fatty liver were screened through GenCards and OMIM databases.Cytoscape software was used to construct a network diagram between disease-components-targets，and we further performed gene ontology （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） enrichment analysis.Results：A total of 31 efficacy components，69 drug and disease intersection targets，involving 109 pathway，were obtained，showing that Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis may works by acting on vital targets such as IL6，AKT1，CXCL8.They mainly involved in the transcriptional positive regulation of DNA template，immune response，cell response to tumor necrosis factor and other biological processes，thereby regulating AGE-RAGE，NAFLD and other pathways to achieve therapeutic effects.Conclusion：This study preliminarily explores the mechanism of drug pairs Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis in the treatment of non-alcoholic fatty liver through the pharmacology of traditional Chinese medicine network，to provide a basis for the next step of experimental verification.

Keywords Herba Epimedii-Fructus Schisandrae Chinensis; Warm yang to form qi; Nonalcoholic fatty liver disease; Experiential couplet medicinals; Mechanism of action; Target; Pathways; Network pharmacology

中圖分類號：R285;R575文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.002

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是與胰島素抵抗等密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷疾病，與2型糖尿病、肥胖、心血管疾病有密切關(guān)系[1-2]。研究表明，NAFLD已成為我國第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生物化學(xué)指標(biāo)異常的首要原因，但目前臨床尚缺乏療效確切的防治藥物[3]。中醫(yī)學(xué)從癥狀、病因病機(jī)等方面將非酒精性脂肪肝歸屬于“積證”“痰證”等范疇[4]，病性屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛為陽氣不足，標(biāo)實(shí)涉及氣滯、痰濕、瘀血等。《金匱要略》載“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之”，溫陽化氣是非酒精性脂肪肝重要的治療思路[5-6]。五味子-淫羊藿是陳寶貴教授臨床常用的溫陽化氣、調(diào)補(bǔ)脾腎的經(jīng)驗(yàn)藥對[7]，淫羊藿溫腎陽以暖脾胃，五味子斂陰陽入脾腎，一散一斂，調(diào)節(jié)氣機(jī)升降出入，以化痰濕、消脹滿，補(bǔ)虛祛邪，達(dá)到治療非酒精性脂肪肝的目的[8]。實(shí)驗(yàn)研究表明五味子中木脂素類、黃酮類等成分可抑制肝臟脂肪沉淀，減少肝臟轉(zhuǎn)氨酶的釋放，抗纖維化[9-10]，淫羊藿中的淫羊藿苷等物質(zhì)可調(diào)節(jié)脂代謝，抑制炎癥介質(zhì)，改善肝纖維化[11]。

目前關(guān)于探索淫羊藿、五味子治療非酒精性脂肪肝的作用，多從單一藥物成分或單個(gè)靶點(diǎn)、通路進(jìn)行，缺少對二者合用多成分、多靶點(diǎn)途徑的研究。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)藥物研究從單一靶點(diǎn)到多信號通路的多途徑調(diào)節(jié)[12]。網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)充分考慮到中藥成分的多樣性及關(guān)聯(lián)性，將病證生物分子網(wǎng)絡(luò)當(dāng)做靶標(biāo)，以預(yù)測中藥治療疾病的作用機(jī)制，這一概念的提出和方法的建立大大推動了中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理研究的進(jìn)展[13-14]。本研究旨在通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立“藥對-靶點(diǎn)-通路-疾病”多層次生物作用網(wǎng)絡(luò)，探討“淫羊藿-五味子”治療非酒精性脂肪肝的作用機(jī)制，為今后的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿-五味子藥對藥效成分篩選及靶點(diǎn)獲取 ?通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID）（http：//www.megabionet.org/tcmid/），結(jié)合文獻(xiàn)查閱，得到淫羊藿、五味子所有化學(xué)成分，再設(shè)定篩選條件為口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，篩選出淫羊藿、五味子的活性成分。同時(shí)在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取相關(guān)化合物靶點(diǎn)蛋白，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）將預(yù)測出的靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名，對應(yīng)相應(yīng)的人源基因名稱。

1.2 非酒精性脂肪肝相關(guān)作用靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）中輸入關(guān)鍵詞“Non-alcoholic fatty liver disease”搜索已報(bào)道的與非酒精性脂肪肝相關(guān)的基因，去除重復(fù)基因和假陽性基因，與藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到藥物與疾病的交集靶點(diǎn)，即淫羊藿-五味子藥對治療非酒精性脂肪肝的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將淫羊藿-五味子的活性成分和非酒精性脂肪肝的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，繪制藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將交集靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果保存成TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，再利用“Network Analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，依?jù)其Degree（節(jié)點(diǎn)度值）重要的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，明確“淫羊藿-五味子”治療非酒精性脂肪肝關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)蛋白。同時(shí)運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件Cluster Maker插件，將上述PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行模塊化分析。

1.5 基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 利用DAVIAD數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO富集分析，分析靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)意義。利用Cytoscape軟件中ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路富集分析，進(jìn)而分析淫羊藿-五味子藥對治療非酒精性脂肪肝的可能通路及機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿-五味子藥對藥效成分篩選 共得到31個(gè)藥效成分，其中淫羊藿藥效成分23個(gè)，五味子藥效成分8個(gè)，及藥對活性成分相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白189個(gè)。見表1。

2.2 淫羊藿-五味子藥對成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖 ? 檢索GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取非酒精性脂肪肝相關(guān)聯(lián)的基因靶點(diǎn)，與“淫羊藿-五味子”有效活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲得交集靶點(diǎn)69個(gè)，并運(yùn)用Cytoscape3.7.1軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖?？梢娨蜣?五味子藥對中一個(gè)活性成分可作用于多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)也可與多種活性成分相對應(yīng)，從而提示“淫羊藿-五味子”能夠通過31個(gè)藥效成分，作用于69個(gè)靶點(diǎn)達(dá)到治療非酒精性脂肪肝的作用，體現(xiàn)了“淫羊藿-五味子”治療非酒精性脂肪肝具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。見圖1。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果見圖2。PPI網(wǎng)絡(luò)共包含45個(gè)節(jié)點(diǎn)，164條邊，其中節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)蛋白，每條邊表示靶點(diǎn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，邊的粗細(xì)代表相互作用力強(qiáng)弱。根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）大小，獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。結(jié)果顯示前15個(gè)靶點(diǎn)蛋白見表2，其中，與細(xì)胞炎癥有關(guān)的靶點(diǎn)蛋白包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、細(xì)胞趨化因子2（CCL2）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）;與細(xì)胞增殖分化相關(guān)靶點(diǎn)蛋白包括蘇氨酸激酶1（AKT1）、環(huán)氧化酶2（PTGS2）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1/JUN、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、MYC原癌基因蛋白質(zhì)（MYC）、表皮生長因子受體（EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、血紅素加氧酶1（HMOX1）;與脂質(zhì)代謝、胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的有：雌激素受體1（ESR1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、蘇氨酸激酶1（AKT1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）。據(jù)此推測，淫羊藿-五味子藥對可通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶點(diǎn)蛋白改善脂質(zhì)代謝、改善胰島素抵抗、抗炎、抗細(xì)胞增殖達(dá)到綜合治療非酒精性脂肪肝的作用。

2.4 GO富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示，共富集21個(gè)分子功能、7個(gè)細(xì)胞組分和30個(gè)生物學(xué)過程。見圖3～5。淫羊藿-五味子藥對治療非酒精性脂肪肝涉及的細(xì)胞組分主要有膜筏、投射神經(jīng)元、細(xì)胞器膜、細(xì)胞內(nèi)面上細(xì)胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等;分子功能主要有RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、藥物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇激素受體活性等;參與的生物學(xué)過程主要有轉(zhuǎn)錄正調(diào)控DNA模板、免疫應(yīng)答、細(xì)胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖的正調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路等。

2.5 KEGG通路分析 利用Cytoscape軟件中ClueGO插件進(jìn)行KEGG通路分析，共富集109條通路。見圖6～7。其中較為重要的通路有糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE Signaling Pathway in Diabetic Complications）、PI3K-AKT信號通路（PI3K-AKT Signaling Pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、查加斯?。–hagas disease）、松弛信號通路（Elaxin Signaling Pathway）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）等通路，表明“淫羊藿-五味子”藥效成分可能通過作用于以上通路實(shí)現(xiàn)對非酒精性脂肪肝的治療作用。

3 討論

目前非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中胰島素抵抗、肝臟脂肪細(xì)胞蓄積、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物脂毒性作用，是非酒精性脂肪肝肝炎發(fā)生的重要過程[15]。《素問·經(jīng)脈別論》曰：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精。”脾胃虧虛、陽氣不足不能將飲食化為人體所需的蛋白質(zhì)、葡萄糖等精微物質(zhì)，引起血液中血糖、血脂升高以供能，導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂，可能是胰島素抵抗發(fā)生的中醫(yī)病因病機(jī)[16]。《玉楸藥解》釋淫羊藿：“味辛，苦，微溫，入足少陰腎、足厥陰肝經(jīng)?！笨伞皽匮a(bǔ)肝腎”“消瘰疬”;《本草經(jīng)集注》載五味子：“酸，溫……主益氣……養(yǎng)五臟?！倍幣湮椋嵝敛⒂?，陰陽并濟(jì)，以調(diào)整臟腑陰陽，促進(jìn)氣血津液正常的濡養(yǎng)及代謝功能。中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢，能通過改善胰島素抵抗、抗氧化應(yīng)激、減少炎癥介質(zhì)釋放等方面達(dá)到綜合治療非酒精性脂肪肝的目的[17]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，淫羊藿-五味子藥對的藥效成分共31個(gè)，藥物-疾病交集靶點(diǎn)69個(gè)，以上藥效成分通過調(diào)控IL6、AKT1、CXCL8、VEGFA、PTGS2、IL1B、JUN、MAPK8、IL10、PPARγ等靶點(diǎn)，作用于AGE-RAGE、丙型肝炎、松弛信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等通路達(dá)到治療NAFLD的療效。目前已有研究表明，在非酒精性脂肪肝發(fā)病機(jī)制中，IL-6、IL-1β不僅是重要的炎癥介質(zhì)，還能促進(jìn)胰島素抵抗、改變脂質(zhì)代謝[18-19]，而阻斷二者的表達(dá)水平可降低炎癥反應(yīng)，改善肝纖維化;JNK活性降低可改善脂肪變性、抑制肝組織炎癥反應(yīng)[20]，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的“未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)”（UPR）;血清中炎癥標(biāo)志物IL-10[21]、IL-8[22]的水平與非酒精性脂肪肝嚴(yán)重程度相關(guān)，而VEGFA、EGFR靶點(diǎn)蛋白則通過干擾核糖體、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、局灶性黏附等通路影響非酒精性脂肪肝疾病進(jìn)程[23];PTGS2抑制劑可以抑制PPARγ的表達(dá)和激活，從而改善肝臟脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗[24]。

GO富集分析結(jié)果顯示，淫羊藿-五味子治療非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要分布在膜筏、投射神經(jīng)元、細(xì)胞器膜、細(xì)胞內(nèi)面上細(xì)胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等細(xì)胞組分，具有RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性配體激活的序列特異性DNA結(jié)合、細(xì)胞因子活性、藥物結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、類固醇激素受體活性等分子功能，主要參與轉(zhuǎn)錄正調(diào)控DNA模板、免疫應(yīng)答、細(xì)胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖的正調(diào)控、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程。可見“淫羊藿-五味子”治療非酒精性脂肪肝是通過多種細(xì)胞組分、結(jié)合多種分子功能、參與多種生物學(xué)過程而發(fā)揮作用的。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，淫羊藿-五味子藥對通過AGE-RAGE信號通路、丙型肝炎、查加斯病、松弛信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等通路達(dá)到治療NAFLD的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE信號通路在非酒精性脂肪肝的發(fā)病過程中有重要的作用，胰島素抵抗、脂代謝受損促進(jìn)糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的生成，而AGEs與RAGE結(jié)合后，激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶等靶點(diǎn)，相關(guān)細(xì)胞因子活化后，促進(jìn)活性氧生成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化，抑制AGE-RAGE信號通路可在一定程度上改善NAFLD[25-26]。PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)肝臟胰島素的葡萄糖代謝功能有關(guān)鍵作用，胰島素與其受體（IR）結(jié)合后，會觸發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)并激活關(guān)鍵下游靶點(diǎn)如IRS2、PI3K和AKT，PI3K/AKT活化后引起糖原合成酶激酶3α（GSK3α）、糖原磷酸化酶（GP）等失活，從而誘導(dǎo)糖原合成，上調(diào)PI3K/AKT信號通路可增加肝臟中IR的表達(dá)[27]，及下游血紅素氧合酶1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）等表達(dá)[28]，從而達(dá)到改善糖代謝、脂質(zhì)代謝、抗氧化損傷的作用。此外，“淫羊藿-五味子”還作用在NAFLD疾病通路發(fā)揮治療作用，其機(jī)制可能是抑制依賴于LKB1/AMPK/mTOR通路的SREBPs激活，以及激活Nrf2等因子，阻斷核因子κB及MAPK等信號通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、相關(guān)氧化應(yīng)激等信號通路有關(guān)蛋白的表達(dá)，降低血清ALT、AST水平，促進(jìn)肝星形細(xì)胞凋亡，從而改善脂質(zhì)代謝、減輕肝損傷，延緩肝纖維化[10，29-31]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)較低的雌激素水平影響非酒精性脂肪肝的發(fā)病及程度[32-33]，這與雌激素影響肝臟脂代謝，減少肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積有關(guān)[34]，而淫羊藿、五味子中所含有的黃酮類、木脂素類有較好的擬雌激素作用[35-37]?！耙蜣?五味子”藥效成分可作用于雌激素受體（ESR1），參與類固醇激素介導(dǎo)的信號通路，達(dá)到調(diào)節(jié)人體雌激素的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，結(jié)合已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道，初步探索了淫羊藿-五味子藥對治療NAFLD多層次的作用機(jī)制，同時(shí)也體現(xiàn)中醫(yī)藥治療的整體觀念。該結(jié)果為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)，也為淫羊藿和五味子單一成分治療NAFLD的研究提供不同的思路。但是，本研究存在一定局限性，首先劑量是中藥發(fā)揮作用的關(guān)鍵之處，不同劑量的配伍可達(dá)到不同的治療目的;其次，復(fù)方煎煮后是否產(chǎn)生新的化合物，從而作用于其他的靶點(diǎn)和通路，尚不能確定;最后采用數(shù)據(jù)庫的不同，也可能給研究結(jié)果帶來一定影響。因此，上述結(jié)果尚需本研究組進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（2019-12-01收稿 責(zé)任編輯：張雄杰）