韓國(guó)超，馬 崢，譚元生(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000 )

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)

1976年，sanger等[1]首次用電鏡觀察到植物類病毒顆粒中存有單鏈閉合環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)。1990年，Matsumoto等[2]在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀 RNA的蹤跡。此后，人們?cè)谛∈笾幸舶l(fā)現(xiàn)存在SRY[3]與P4502C24等[4]circRNAs。由于技術(shù)的局限性及circRNA分子的特殊性，當(dāng)時(shí)普遍認(rèn)為circRNA是外顯子錯(cuò)誤剪切的產(chǎn)物，只是生命活動(dòng)中的偶然事件，并未引起學(xué)術(shù)界重視。

近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與在RNA領(lǐng)域的不斷探索，研究者們發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)普遍存在circRNA，circRNA逐漸被重視并開(kāi)始了廣泛地研究。2012年，Danan等[5]開(kāi)發(fā)了環(huán)狀RNA測(cè)序(circRNA-seq)技術(shù)，并將其應(yīng)用于古細(xì)菌solfataricusP2中，發(fā)現(xiàn)circRNA在古生菌中大量存在且可能具有生物功能。同年，Salzman等[6]的研究結(jié)果表明，mRNA前體的反向剪接會(huì)形成多種環(huán)狀RNA，這種現(xiàn)象在基因表達(dá)程序中普遍存在。2013年，Jeck等[7]通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，人成纖維細(xì)胞中存有25 000多種circRNA。此外，還發(fā)現(xiàn)一些circRNA比其母源linear RNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，表達(dá)更豐富。Memczak等[8]的研究表明circRNA可作為miRNA的sponge，從而參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，circRNA也逐步被人們所了解，但仍有很多未知的黑匣子等待被打開(kāi)。

2 circRNA的形成

中心法則認(rèn)為遺傳信息首先從DNA傳遞給RNA(pre-mRNA)，再經(jīng)過(guò)經(jīng)典剪切形成傳統(tǒng)的線性RNA。此過(guò)程中，經(jīng)典剪切是指真核細(xì)胞的pre-mRNA在細(xì)胞核中經(jīng)過(guò)去除內(nèi)含子，連接外顯子等剪接得到linear RNA的過(guò)程。區(qū)別于linear RNA的形成方式，反向剪接是形成circRNA的重要機(jī)制。在2013年，套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化兩種重要的circRNA形成機(jī)制被Jeck等[7]所提出。其中，套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化是指pre-mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)生外顯子跳讀，拉近兩原本相離的外顯子，然后下游外顯子的3＇端通過(guò)共價(jià)鍵與上游外顯子的5＇端發(fā)生結(jié)合，所形成的套索結(jié)構(gòu)再經(jīng)過(guò)inter-lariat 剪切得到circRNA。在內(nèi)含子配套驅(qū)動(dòng)環(huán)化中，pre-mRNA的兩內(nèi)含子通過(guò)配對(duì)原則結(jié)合，隨后剪切配對(duì)的內(nèi)含子，進(jìn)而促進(jìn)環(huán)狀RNA分子的形成。

近年來(lái)，有研究表明，circRNA的形成還受RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein,RBPs)的調(diào)控，RBPs可通過(guò)與內(nèi)含子中的順式原件結(jié)合，使得上下游外顯子相互靠近，從而促進(jìn)外顯子環(huán)化[9]。另外，Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，位于內(nèi)含子之間和內(nèi)含子所含有的重復(fù)序列會(huì)對(duì)circRNA的形成數(shù)量與類型造成影響。套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化與內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化的最大不同在于前者先外顯子跳讀，形成套索結(jié)構(gòu)，最后通過(guò)反向剪切形成circRNA。后者是反向剪切后，直接生成circRNA。幾種模型如圖1所示。上述模型雖使得人們對(duì)circRNA的形成有更深入的理解，但尚需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖1 環(huán)狀RNA形成模式圖[11]A. 套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化；B. 內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化；C. RBP調(diào)控circRNA生成Fig. 1 Models of circRNA biogenesis[11]A. Lariat-driven circularization; B. Intron pairing-driven circularization; C. circRNA biogenesis mediated by RBP

3 circRNA的特征

研究人員對(duì)circRNA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的同時(shí)，歸納總結(jié)出circRNA具有以下的特征：(1)大部分的circRNA是非編碼RNA；(2)circRNA在不同生物體內(nèi)不同類型組織和細(xì)胞中廣泛且特異性表達(dá)；(3)大部分circRNA靠外顯子反向剪切構(gòu)成；(4)circRNA不存在5＇端和3＇端，是一種閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA，該結(jié)構(gòu)使其對(duì) RNase R不敏感[12]。用RNA外切酶 RNase R對(duì)RNA進(jìn)行處理，可判斷是否存在circRNA[13]；(5)circRNA的半衰期大多超過(guò)48 h[13]；(6)circRNA較其母源linear RNA更穩(wěn)定，且表達(dá)豐度是其10倍以上[6-7]；(7)大多數(shù)circRNA具有高度保守的序列[6-7]；(8)絕大多數(shù)circRNA會(huì)富集在細(xì)胞質(zhì)中，僅少數(shù)存在于細(xì)胞核[12]；(9)circRNA可充當(dāng)miRNA的海綿體進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8]。上述的特征使circRNA成為了RNA領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

4 circRNA的功能

近年來(lái)，隨著人們?cè)赾ircRNA領(lǐng)域不斷探索，越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，circRNA在多個(gè)生命過(guò)程中扮演了重要的角色，其功能主要包括以下幾個(gè)方面。

4.1 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄

circRNA對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程有調(diào)控作用。2013年，Zhang等[12]研究表明ci-ankrd52與PolII延伸有關(guān)，并充當(dāng)后者轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)劑，敲除ciRNA會(huì)導(dǎo)致其自身基因的表達(dá)下調(diào)。此外，Li等[14]發(fā)現(xiàn)EliciRNA能與UsnRNP相互作用并且促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄。他們認(rèn)為ElciRNA先與U1小分子核糖核蛋白體形成復(fù)合物，然后與RNAP II的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合并作用于親本基因，最終調(diào)控親本基因的表達(dá)。

4.2 與蛋白質(zhì)相互作用

circRNA也可與蛋白相結(jié)合從而發(fā)揮作用。在果蠅與人類中，剪接因子MBL的第二外顯子進(jìn)行內(nèi)含子間的相互配對(duì)，驅(qū)動(dòng)自身環(huán)化成circMBl，然后再識(shí)別并結(jié)合MBl蛋白。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)MBl蛋白水平過(guò)高時(shí)，會(huì)促進(jìn)其自身外顯子形成circMBl，繼而circMBl與MB1蛋白相互結(jié)合，使MB1蛋白含量降低[15]。另外，ID-1、E2F1、FAK和HID1a會(huì)被circ-Foxo3識(shí)別、結(jié)合并滯留在細(xì)胞質(zhì)中，使其抗衰老和抗應(yīng)激作用受到抑制，最終加快細(xì)胞衰老的進(jìn)程[16]。

4.3 作為miRNA sponge

ceRNA假說(shuō)認(rèn)為ceRNA可與miRNA結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地抑制miRNA與mRNA結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)[17-19]。近期的研究表明，circRNA 中含有大量能與miRNA結(jié)合的應(yīng)答原件，從而降低miRNA對(duì)靶基因的抑制作用。例如CDR1as(antisense to the cerebellar degeneration-related protein 1 transcript)就可作為miR-7 sponge。CDR1as是長(zhǎng)約1.5 kb，含74個(gè)miR-7應(yīng)答原件的circRNA。主要在人和鼠的腦中表達(dá)。它對(duì)miR-7起負(fù)調(diào)控的作用。即當(dāng)CDR1as表達(dá)量增加時(shí)，更多的miR-7被CDR1as結(jié)合，使得miR-7的含量降低，進(jìn)而間接調(diào)節(jié)miR-7靶基因的表達(dá)量[20]。此外，Memczak等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胚胎斑馬魚的中腦體積與CDR1as之間存有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。Hansen等[21]通過(guò)熒光素酶基因報(bào)告試驗(yàn)推斷出由SRY基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的SRYcircRNA可充當(dāng)miR-138的“sponge”，通過(guò)MRE與后者結(jié)合，從而抑制后者的活性。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)心臟環(huán)狀RNA(HRCR)可作為miR-223的海綿，調(diào)節(jié)并控制ARC(miR-223的下游靶點(diǎn))的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌的肥厚與衰竭。如今，越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)可充當(dāng)miRNA 的sponge，但得到驗(yàn)證的相對(duì)較少，這也表明此方面還需進(jìn)一步的研究。

5 circRNA在畜禽中的相關(guān)研究

畜禽的經(jīng)濟(jì)性狀和疾病防控始終受到人們的關(guān)注。隨著在circRNA領(lǐng)域進(jìn)一步的探索與研究，人們發(fā)現(xiàn)其在畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、生產(chǎn)性能和疾病等方面都扮演著重要的角色。

5.1 生長(zhǎng)發(fā)育方面

環(huán)狀RNA在畜禽生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用。Liang等[23]對(duì)貴州小型豬的骨骼肌進(jìn)行RNA-seq，確定了149個(gè)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的circRNAs。其中SSC-CIR-02753、SSC-CIR-04353、SSC-CIR-04335和SSC-CIR-04349等通過(guò)調(diào)控肌細(xì)胞的增殖來(lái)調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，推測(cè)SSC-CIR-01595、SSC-CIR-01592和SSC-CIR-03395等可能參與骨骼肌收縮過(guò)程[23]。Chen等[24]通過(guò)對(duì)雅南母豬的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)在骨骼肌老化的過(guò)程中，circRNA 014844、circRNA 011308和circRNA 018401與miR-493-5p呈正相關(guān)，與肌肉萎縮相關(guān)基因FGB負(fù)相關(guān)。推測(cè)以上circRNAs可能參與肌肉衰老過(guò)程的調(diào)節(jié)。Li等[25]采集胚胎期和成年期哈薩克羊的背部最長(zhǎng)肌組織，對(duì)circRNA進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，circRNA 0000385、circRNA 0000582和circRNA 0001099等含有多個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA的MREs。Wei等[26]研究表明，CircLMO7可促進(jìn)牛成肌細(xì)胞增殖，但會(huì)抑制其分化。在牛肌肉的發(fā)育過(guò)程中，過(guò)表達(dá)的CircLMO7可通過(guò)MRE與miR-378-3p結(jié)合，從而影響骨骼肌的發(fā)育。Ouyang等[27]對(duì)11胚齡、16胚齡、1日齡的杏花雞的腿肌進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)circRBFOX2可與miR-206相結(jié)合，從而促進(jìn)肌細(xì)胞增殖。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，circSVIL在雞胚發(fā)育后期高度表達(dá)，其可充當(dāng)miR-203的sponge來(lái)促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖和分化[28]。在雞胚骨骼肌發(fā)育過(guò)程中，研究發(fā)現(xiàn)FGFR2基因外顯子3～6環(huán)化形成的circFGFR2可通過(guò)吸附miR-133a-5b和miR-29b-1-5p間接調(diào)控骨骼肌細(xì)胞的增殖分化[29]。此外，circZBTB10在雞的肌肉組織中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)circZBTB10可促使肌細(xì)胞大量增殖，影響骨骼肌的發(fā)育[30]。

5.2 生產(chǎn)繁殖方面

環(huán)狀RNA在畜禽生產(chǎn)繁殖過(guò)程中起著重要的作用。Zhang等[31]對(duì)產(chǎn)后90 d和250 d的奶牛乳腺組織進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)circRNAs。功能富集分析表明，與250 d奶牛乳腺組織相比，90 d中來(lái)源于酪蛋白的circRNA高表達(dá)，且具有miR-2284的MRE。這表明它可能與酪蛋白的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。Song等[32]采集妊娠后5 d和15 d的山羊子宮內(nèi)膜，通過(guò)illumina Solexa測(cè)序發(fā)現(xiàn)circRNA的表達(dá)具有階段特異性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于CRIM1的circRNA8073通過(guò)結(jié)合miR-449a的靶位點(diǎn)抑制miR-449a的活性，進(jìn)而影響山羊的懷孕。此外，Zhang等[33]應(yīng)用RNA測(cè)序技術(shù)從綿羊的下丘腦中共鑒定出41 863個(gè)circRNAs，差異表達(dá)的有340個(gè)circRNAs。通過(guò)功能富集分析，推測(cè)oar-circ-0018794、oar-circ-0008291、oar-circ 0013788等可直接或間接調(diào)控促性腺激素釋放激素，進(jìn)而影響綿羊的生殖過(guò)程。Shen等[34]以京海黃雞小黃卵泡顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞為研究對(duì)象，推測(cè)來(lái)源于IGFIR基因和TOX2基因的circRNAs在等級(jí)前卵泡時(shí)期可與miRNA相互作用，共同調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，影響卵泡的發(fā)育，進(jìn)而影響雞的產(chǎn)蛋性能。

5.3 疾病研究方面

環(huán)狀RNA在畜禽疾病調(diào)控中扮演了重要的角色。Yan等[35]以感染了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的7 d仔豬為研究對(duì)象，通過(guò)KEGG等分析發(fā)現(xiàn)circ -0002287的母基因主要富集在病毒致癌和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b信號(hào)通路上，推測(cè)circ -0002287通過(guò)與miR378結(jié)合，在產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染過(guò)程中發(fā)揮海綿體的作用。Zhao等[36]研究發(fā)現(xiàn)，circEZH2可通過(guò)海綿吸附miR-22，抑制豬傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，從而降低炎癥的發(fā)生。Zhang等[37]用雞禽白血病J(ALV-J)亞型侵染 ALV 抗性和 ALV 敏感性雞，對(duì)肝組織進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)與免疫相關(guān)的circRNAs。目前，circRNA在動(dòng)物畜禽疾病方面的研究還較少，且主要集中在人類疾病領(lǐng)域，相信隨著研究的不斷深入，更多與疾病相關(guān)的circRNA在動(dòng)物中將被發(fā)現(xiàn)，為動(dòng)物疾病防控、抗病育種等提供科學(xué)指導(dǎo)。

6 展 望

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，circRNA的研究越來(lái)越多，circRNA的結(jié)構(gòu)與功能也逐漸被揭示。但circRNA在畜禽方面的研究還較少，大多數(shù)關(guān)于circRNA的研究還停留在初期，即發(fā)現(xiàn)并預(yù)測(cè)circRNA的功能。少數(shù)研究者做了其功能的深入驗(yàn)證，相信隨著生物技術(shù)的迭代更新及大量科學(xué)研究在畜禽circRNA領(lǐng)域的聚焦，circRNA在畜禽領(lǐng)域的潘多拉魔盒將會(huì)逐漸打開(kāi)，這將為畜禽分子育種及疾病防控提供有力科學(xué)依據(jù)，為畜牧業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)基礎(chǔ)。