徐 明，馬 軒，王夢雅,2，吳東霖，邵 凱，李 茹(.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 7200)

泌乳前期奶牛由于能量攝入無法滿足代謝需求，常處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，對機(jī)體健康和生產(chǎn)性能產(chǎn)生一定負(fù)面影響。淀粉是高產(chǎn)反芻動物重要的能量來源，但飼喂大量淀粉會誘發(fā)瘤胃酸中毒等代謝性疾病[1-2]。研究表明，反芻動物小腸降解淀粉的能量利用率比在瘤胃中發(fā)酵高42%[3-4]。但小腸消化淀粉的能力有限，胰腺α-淀粉酶分泌不足是限制小腸淀粉利用的關(guān)鍵因素[4-5]。因此，改善胰腺外分泌功能對提高反芻動物小腸淀粉的消化、滿足能量需求、維持機(jī)體健康具有重要意義。

Swanson等[6]發(fā)現(xiàn)，增加日糧蛋白質(zhì)含量可提高安格斯育肥牛胰腺α-淀粉酶的分泌，這與蛋白質(zhì)中的氨基酸組成有關(guān)。支鏈氨基酸(BCAAs)包括亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)和纈氨酸(Val)，這些氨基酸不能在動物體內(nèi)合成，只能通過飼糧獲取。BCAAs是蛋白質(zhì)合成的底物，還具有調(diào)節(jié)能量分配、葡萄糖代謝以及激素分泌等多種生物學(xué)功能[7-9]。前期試驗表明，十二指腸灌注亮氨酸可以增加關(guān)中青年山羊和荷斯坦青年牛胰腺消化酶的分泌[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)提高纈氨酸濃度可以提高草魚淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的分泌[12]。目前對3種BCAAs影響胰腺外分泌功能的具體劑量效應(yīng)及其交互作用尚無報道。

鑒于此，本試驗通過體外組織培養(yǎng)的方法，研究BCAAs對荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的影響及其交互作用，旨在為提高小腸淀粉利用效率、減少飼料資源浪費提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

1.1.1 試驗1 BCAAs濃度對奶牛胰腺消化酶分泌的影響 將5頭荷斯坦奶牛于呼和浩特北亞清真肉食品有限責(zé)任公司屠宰后，取出胰腺，用4 ℃的生理鹽水沖洗，并置于4 ℃的鹽水中迅速轉(zhuǎn)移至實驗室。將組織置于冰上進(jìn)行組織剝離，切成2×2 mm的小塊組織(約0.1 g)，用濾紙吸干，并用玻璃皿稱重。培養(yǎng)組織方法與Swanson等[13]方法相同。將組織塊放入分別含有0、2.62、5.24和10.48 mg/mL亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的Krebs Ringer bicarbonate buffer(KRB)溶液中進(jìn)行組織塊培養(yǎng)，每個處理5個重復(fù)，于39 ℃水浴搖床中培養(yǎng)，振蕩頻率90次/ min，培養(yǎng)60 min。將所有培養(yǎng)液的pH調(diào)至7.4。

1.1.2 試驗2 3種BCAAs對奶牛胰腺消化酶分泌的交互影響 將5頭荷斯坦奶牛屠宰后，收集胰腺組織，其處理方法與試驗1相同。采用2×2×2的3因素、2梯度試驗設(shè)計，3種BCAAs濃度分別為0和5.24 mg/mL，共8個處理，每個處理5個重復(fù)。培養(yǎng)方法同試驗1。

1.2 樣品收集與分析

培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板置于冰上。用移液槍從每個培養(yǎng)孔中吸取700 μL KRB培養(yǎng)液置于帶標(biāo)記的無菌無酶凍存管中，-20 ℃保存。將組織單獨取出在鹽水中勻漿，儲存于凍存管中標(biāo)記，于-20 ℃冰箱保存。

于1周內(nèi)用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分析消化酶的活性。酶活性以活性單位表示，1個單位定義為39 ℃下每分鐘釋放1 μmol產(chǎn)物。

組織釋放(IU/g)=(KRB培養(yǎng)液(mL)×酶活性(IU/mL))/組織重量(g)

1.3 統(tǒng)計分析

通過SAS 9.2 的一般線性模型程序分析消化酶活性數(shù)據(jù)。試驗1使用單因素方差分析(ANOVA)分析培養(yǎng)時間內(nèi)BCAAs對胰腺消化酶參數(shù)的影響；試驗2利用Duncan法對組均值之間的顯著性進(jìn)行多重比較及交互作用分析。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗

預(yù)試驗表明，組織培養(yǎng)時間為60、120和180 min時，α-淀粉酶的總活性隨時間增加而增加，但單位時間(每小時)釋放的α-淀粉酶活性隨時間增加而下降(結(jié)果未顯示)。因此，選擇60 min為培養(yǎng)時間。

2.2 BCAAs濃度對奶牛胰腺消化酶分泌的影響

2.2.1 亮氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度亮氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結(jié)果見表1。從表1可見，隨著亮氨酸濃度的升高，胰腺組織中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性和組織釋放α-淀粉酶的活性隨亮氨酸濃度提高呈二次曲線變化(P<0.01)，且在5.24 mg/mL時達(dá)到最高值。與對照組(0 mg/mL)相比，亮氨酸線性增加了組織釋放胰蛋白酶的活性(P<0.05)，但沒有增加糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表1 亮氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 1 Effects of Leu concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.2 異亮氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度異亮氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結(jié)果見表2。從表2可見，高濃度異亮氨酸(5.24和10.48 mg/mL)線性增加了組織中糜蛋白酶活性(P<0.05)和組織釋放α-淀粉酶的活性(P<0.01)。與對照組相比，異亮氨酸不影響組織中α-淀粉酶和胰蛋白酶分泌，也不影響組織釋放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表2 異亮氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 2 Effects of Ile concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.2.3 纈氨酸濃度對胰腺消化酶分泌的影響 不同濃度纈氨酸處理后，奶牛體外胰腺消化酶活性測定結(jié)果見表3。從表3可見，隨著纈氨酸濃度的增加，組織中和組織釋放的α-淀粉酶的活性呈二次曲線變化(P=0.05)，且在濃度為5.24 mg/mL時達(dá)到最高值；纈氨酸不影響胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P>0.05)。

表3 纈氨酸濃度對奶牛體外胰腺消化酶活性的影響Table 3 Effects of Val concentration on enzyme activity of bovine pancreas in vitro

2.3 3種BCAAs對奶牛胰腺消化酶分泌的交互影響

不同濃度亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸對奶牛體外胰腺消化酶活性的交互作用見表4。從表4可見，亮氨酸和纈氨酸顯著增加了組織中和組織釋放α-淀粉酶的活性(P<0.05)，極顯著降低了脂肪酶的活性(P<0.01);亮氨酸顯著增加了組織中胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性(P<0.05);異亮氨酸顯著增加了組織中糜蛋白酶的活性(P<0.01)，對α-淀粉酶，胰蛋白酶和脂肪酶的活性沒有影響(P>0.05);組織釋放胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性不受3種BCAAs的影響(P>0.05)，且3種BCAAs之間沒有交互作用(P>0.05)。

表4 支鏈氨基酸對體外胰腺消化酶的交互作用Table 4 Interaction of BCAAs on pancreatic enzyme activity in vitro

3 討 論

隨著奶牛生產(chǎn)性能的增加，更有效地滿足奶牛的營養(yǎng)需求是目前面臨的巨大挑戰(zhàn)。一般在生產(chǎn)中給奶牛供應(yīng)高淀粉型日糧以滿足奶牛的能量需求，但會引起瘤胃酸中毒，并導(dǎo)致過多的淀粉進(jìn)入小腸。越來越多的研究表明，胰腺消化酶分泌量不足限制小腸中淀粉的消化[4-5]。因此，需要確定營養(yǎng)因子是否影響胰腺消化酶的產(chǎn)生和分泌。增加肉牛小腸酪蛋白供應(yīng)量可增加動物胰腺重量和胰腺總α-淀粉酶分泌[13，15]。

Swanson等[6,16]發(fā)現(xiàn)，增加牛日糧蛋白質(zhì)含量或真胃灌注酪蛋白中可增加其胰腺α-淀粉酶的活性。蛋白質(zhì)中某些氨基酸的含量會對胰腺α-淀粉酶分泌產(chǎn)生影響[17-18]。

BCAAs是動物體內(nèi)無法合成的必需氨基酸，對動物的生長和發(fā)育起著重要作用。亮氨酸不僅是哺乳動物的必需氨基酸之一，而且還是蛋白質(zhì)合成的底物，它作為有效的營養(yǎng)因子，在蛋白質(zhì)合成和組織代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

BCAAs尤其是亮氨酸可以通過mTOR信號通路在翻譯水平影響胰腺消化酶的活性[20]，也可以改變基因的表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)其活性。當(dāng)豬口服或注射亮氨酸時，其胰腺、心臟、肝臟和骨骼肌等組織中的蛋白質(zhì)合成會增加[21-22]。已有研究報道，亮氨酸可通過mTOR信號傳導(dǎo)途徑刺激奶牛乳蛋白合成[23-25]。

本研究主要的目的是通過體外組織培養(yǎng)的方法，系統(tǒng)研究BCAAs影響荷斯坦奶牛胰腺消化酶分泌的劑量規(guī)律，以及3種BCAAs之間是否存在交互作用。

課題組前期研究已經(jīng)證明，十二指腸灌注亮氨酸可提高山羊胰腺分泌的及小腸食糜的胰蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶的活性[10,14]。楊昕澗[26]研究表明，牛奶中添加亮氨酸能夠提高奶公犢小腸胰腺α-淀粉酶的活性。此外也有報道，添加過量的亮氨酸不再增加α-淀粉酶分泌量[10,14,26]。本試驗表明，當(dāng)培養(yǎng)液中亮氨酸濃度升高時，胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，當(dāng)亮氨酸濃度為5.24 mg/mL時，酶分泌量達(dá)到最高值。這與前述試驗結(jié)果一致。

異亮氨酸與亮氨酸結(jié)構(gòu)相似，也是蛋白質(zhì)合成的底物，生物學(xué)功能相近。本試驗表明，當(dāng)培養(yǎng)液中異亮氨酸濃度升高時，胰腺α-淀粉酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，當(dāng)BCAAs濃度為5.24 mg/mL時，酶分泌量達(dá)到最高值，異亮氨酸對胰蛋白酶濃度沒有影響。Richert等[27]研究表明，增加日糧中異亮氨酸含量會增加泌乳母豬乳汁中的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂肪含量，并增加幼年建鯉腸、肝、胰腺的消化酶活性[28]。Liu等[29]報道，隨著異亮氨酸的小腸灌注量增加，奶牛胰腺α-淀粉酶和胰蛋白酶的活性呈線性增加。異亮氨酸可顯著增加奶山羊胰腺組織和培養(yǎng)液中α-淀粉酶的釋放速率[30]、胰腺組織糜蛋白酶和胰蛋白酶的總濃度[31]。這與本試驗一致。

本試驗結(jié)果表明，組織釋放的α-淀粉酶活性隨著纈氨酸濃度呈二次曲線變化，當(dāng)纈氨酸濃度為5.24 mg/mL時達(dá)到最高值，纈氨酸不影響糜蛋白酶和胰蛋白酶釋放量。Attaix等[32]研究表明，纈氨酸不影響羔羊體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。這與本試驗纈氨酸不影響蛋白酶分泌量相符。

目前，三種BCAAs對反芻動物胰腺消化酶分泌的交互影響方面的結(jié)果尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，三種BCAAs對α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的影響均沒有交互作用。亮氨酸顯著增加了胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性的活性，與前述結(jié)果一致。三種BCAAs對脂肪酶活性存在顯著的交互作用。亮氨酸顯著降低了脂肪酶活性，此方面未見類似報道，有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究證實，隨培養(yǎng)液中亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸濃度提高，體外胰腺組織α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶分泌量呈先升高、后降低的趨勢，分別均在5.24 mg/mL時達(dá)到最高值。3種BCAAs對α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的分泌量沒有交互影響。亮氨酸和纈氨酸降低胰腺組織脂肪酶分泌量，3種BCAAs之間存在交互影響。