仇薪鑫，牛華鋒，賈燕青，張振倉(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著中國人民對牛肉需求量的不斷增加，肉牛養(yǎng)殖規(guī)模也逐年擴(kuò)大，而大規(guī)模養(yǎng)殖帶來的疾病風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。犢牛腹瀉是一種嚴(yán)重影響犢牛生長發(fā)育、成活的胃腸道疾病，具體表現(xiàn)為高熱、精神萎靡、持續(xù)腹瀉，發(fā)病率極高，死亡率可達(dá)50%以上[1-2]。而在肉牛養(yǎng)殖過程中，對犢牛腹瀉的有效防治能夠極大地減少其經(jīng)濟(jì)損失。2019年10月，楊凌示范區(qū)某肉牛養(yǎng)殖場發(fā)生犢牛腹瀉病例，臨床表現(xiàn)為犢牛排灰黃色水樣稀糞，混有血絲，體溫升高至40 ℃～41 ℃。剖檢發(fā)現(xiàn)，小腸黏膜點(diǎn)狀出血，腸系膜淋巴結(jié)出血腫大，肝腎顏色變淺。本試驗(yàn)通過無菌采集發(fā)生腹瀉的秦川犢牛糞樣，對其進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分離鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)分析，確定引起犢牛腹瀉的病原菌種類并為臨床合理應(yīng)用抗生素及制定防治措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源：陜西楊凌示范區(qū)某肉牛場腹瀉犢牛的糞樣。

藥敏紙片購于杭州濱河微生物試劑有限公司；沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)血清購于蘭州生物制品研究所；試驗(yàn)用小鼠源于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 無菌采集發(fā)病犢牛糞便樣品，用滅菌生理鹽水按1:1比例渦旋混勻，離心取上清，用于病原分離培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 所用培養(yǎng)基按照參考文獻(xiàn)[3]制備。

取病牛糞便涂片，無菌接種于血瓊脂平板上，記錄菌落特征。選擇單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察可疑致病菌的細(xì)菌形態(tài)。將單個(gè)可疑致病菌菌落分別培養(yǎng)于普通瓊脂平板和麥康凱平板上，再用亮綠膽鹽-四硫磺酸鈉肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，在腸道鑒定培養(yǎng)基上劃線分離，置37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取麥康凱平板上的紅色菌落或血平板上有溶血現(xiàn)象的典型菌落，以及鑒定培養(yǎng)基上疑似沙門氏菌的菌落進(jìn)行涂片和染色鏡檢，與之前觀察到的細(xì)菌進(jìn)行比較，如果相同，則進(jìn)行純培養(yǎng)；如果不同，則重新接種。將分離到的純培養(yǎng)物分別接種于普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、普通肉湯培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基和S.S培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察其生長表現(xiàn)。

1.2.3 生化鑒定 將分離的菌純培養(yǎng)物編號(C1、C2、C3)，分別進(jìn)行生化試驗(yàn)(糖發(fā)酵試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、MR與VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、三糖鐵瓊脂斜面試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn))，每個(gè)試驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 試驗(yàn)動(dòng)物為8只健康小白鼠，將其隨機(jī)分為試驗(yàn)組(G)4只和對照組(T)4只。試驗(yàn)組又分為2小組，G1組腹腔注射0.2 mL一定濃度的沙門氏菌血清肉湯純培養(yǎng)物，G2組腹腔注射0.3 mL一定濃度的大腸埃希氏菌血清肉湯純培養(yǎng)物，對照組腹腔注射等量的滅菌普通肉湯，隔離飼養(yǎng)12 h，觀察其生存狀態(tài)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將分離到的細(xì)菌純培養(yǎng)物制成懸液，用滅菌棉簽均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，選取多種抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，測量抑菌環(huán)直徑。

1.2.6 治療 結(jié)合發(fā)病牛場實(shí)際情況，將發(fā)病犢牛進(jìn)行隔離治療，全場實(shí)施緊急消毒計(jì)劃。采用給予適量有效抗生素并補(bǔ)糖、補(bǔ)液、限制飲水、補(bǔ)充維生素C等手段進(jìn)行綜合治療。分析對比治療效果，定義治療后臨床病例癥狀完全消失為顯著療效，治療后各種臨床癥狀基本消失(未完全恢復(fù)正常表現(xiàn))為基本好轉(zhuǎn)，治療后臨床癥狀并無明顯消失為效果不佳。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌的生化特性

C1菌株：鏡檢結(jié)果為G-桿菌，無芽孢，有莢膜。在普通瓊脂平板、血平板、S.S平板、伊紅美蘭平板上均為圓形、隆起、邊緣整齊、光滑、濕潤、半透明灰白色小菌落；在血平板上生長良好，不溶血；在麥康凱平板上形成無色透明，圓形小菌落。

C2菌株：鏡檢結(jié)果為G-卵圓形或桿狀菌，無芽孢，單個(gè)或成雙排列。普通瓊脂平板、血平板上均為中等大小、圓形隆起、光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落；血平板上生長良好，呈β溶血；麥康凱平板上呈光滑、濕潤、邊緣整齊的紅色菌落；S.S平板上為白色小菌落；伊紅美蘭平板上為圓形黑色、金屬光澤菌落。

C3菌株：鏡檢結(jié)果為G-桿菌，散在或成短鏈，無芽孢，有莢膜。普通瓊脂平板上為中等大小、表面光滑、邊緣稍整齊、濕潤微隆起的淡綠色菌落；血平板生長良好，出現(xiàn)溶血、有特殊氣味； 麥康凱平板上形成生長良好、圓形、邊緣整齊、光滑的小菌落，產(chǎn)生色素，有特殊氣味；S.S平板上整個(gè)培養(yǎng)基變成淡黃色，菌落生長良好，無色透明；伊紅美蘭平板上形成邊緣整齊、光滑、濕潤、隆起、中等大小的黑色菌落。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表中結(jié)果結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征，確定C1菌株為沙門氏菌，C2菌株為致病性大腸埃希氏菌，C3菌株為銅綠假單胞桿菌[4]。

表1 分離菌的生化特性Table 1 The results of biochemical test of isolated bacteria

Note：“+”means positive;“-”means negative;“⊕”means both acid and gas.

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

對試驗(yàn)組死亡小鼠的肝臟和脾臟進(jìn)行細(xì)菌回歸檢測，其結(jié)果與分離的3株生化試驗(yàn)結(jié)果相同，證實(shí)小鼠死亡由沙門氏菌和大腸埃希氏菌引起。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，分離到的沙門氏菌和大腸埃希氏菌均對先鋒噻肟、先鋒必、菌必治、阿米卡星等抗生素敏感。另外，沙門氏菌對卡那霉素、先鋒霉素V、頭孢呋肟等抗生素敏感，大腸埃希氏菌對氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟哌酸、氯霉素等抗生素敏感。

2.5 綜合防治結(jié)果

結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果，對10頭病情嚴(yán)重的犢牛進(jìn)行治療，采取疾病控制措施，通過隔離、消毒，給予適量抗生素(菌必治)和補(bǔ)液等綜合防治手段，其中8頭發(fā)病犢牛治療效果顯著，癥狀基本完全消失，另外2個(gè)病例腹瀉癥狀明顯減輕，但未完全恢復(fù)，病情基本穩(wěn)定。

表2 小鼠腹腔注射結(jié)果Table 2 Results of intraperitoneal injection in mice

表3 分離菌抗生素敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of antibiotic susceptibility test

表4 治療前后臨床癥狀對比Table 4 Comparison of clinical symptoms before and after treatment

3 討 論

本次發(fā)病犢牛表現(xiàn)為排水樣血便，有黏液，通過進(jìn)一步細(xì)菌分離鑒定，從腹瀉犢牛的糞便中分離到了3株細(xì)菌，分別為沙門氏菌、大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌。引起犢牛腹瀉的致病菌一般以大腸埃希氏菌和沙門氏菌為主，臨床表現(xiàn)為精神抑郁、高熱、腹脹、腹痛、糞便惡臭發(fā)黑，偶有血泡混入[5]。銅綠假單胞菌是一種條件性致病菌，在土壤和水中廣泛存在，一旦機(jī)體抵抗力降低或皮膚黏膜破損，則會引起全身或局部感染，犢牛往往因發(fā)生腹瀉，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，而引起銅綠假單胞菌感染發(fā)病[6]。通過對分離菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果表明，在臨床治療中可優(yōu)先選用菌必治、先鋒噻肟、先鋒必、阿米卡星等抗生素；分離到的沙門氏菌對環(huán)丙沙星具有耐藥性，很可能是因?yàn)殚L期應(yīng)用此藥治療犢牛腹瀉病，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[7]。經(jīng)過藥物篩選，確定使用菌必治、阿米卡星兩種抗生素，配合消毒、補(bǔ)液進(jìn)行綜合防治，80%病例治療效果顯著，20%病例癥狀明顯緩和，病情基本穩(wěn)定。引起犢牛腹瀉的病因很多，包括消化不良、病毒、寄生蟲或細(xì)菌感染等，在犢牛腹瀉病的診斷、治療和預(yù)防過程中也不能忽視這些因素的影響[8]。在臨床上應(yīng)該通過病原分離鑒定，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查分析確定腹瀉病因，進(jìn)一步提升犢牛自身抵抗力，做好環(huán)境衛(wèi)生工作來預(yù)防本病。