陳曉江，董芙羽，劉曉峰

（1.忻州師范學(xué)院生物系，山西 忻州 034000；2.山西臭冷杉省級自然保護(hù)區(qū)，山西 忻州 034000）

隨著工業(yè)化和農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化，生活污水和工農(nóng)業(yè)廢水排入水環(huán)境中的量日益增多，導(dǎo)致水體中氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)也隨排放量不斷增加，造成了水體富營養(yǎng)化［1，2］。富營養(yǎng)化水體充足的氮磷營養(yǎng)鹽促使藻類暴發(fā)式增殖，發(fā)生水華現(xiàn)象，水質(zhì)降低［3］。水華形成的機(jī)理是水生態(tài)修復(fù)研究的熱點(diǎn)問題，而通過對外源氮磷污染物總量的控制及運(yùn)用脫氮除磷技術(shù)減少內(nèi)源污染來治理水體富營養(yǎng)化，以防治水華危害，是水生態(tài)修復(fù)的主要措施。

目前，對于水華形成機(jī)理較好的解釋是N/P（氮磷比）學(xué)說［3］。Schindler［4］通過控制加拿大安大略實(shí)驗(yàn)湖區(qū)營養(yǎng)鹽試驗(yàn)，研究不同氮磷比（N/P）對藻類生長的影響，得出低N/P能促進(jìn)魚腥藻和束絲藻暴發(fā)生長。Smith［5］研究了17個(gè)湖泊水體的資料提出了通過改變湖泊N/P來減少藍(lán)藻水華的發(fā)生，提出營養(yǎng)物質(zhì)中磷為藻類增殖的關(guān)鍵因子，在不同的氮磷比條件下，不同藻類繁殖速率具有差異性。在水體中，由于N或P的濃度都會導(dǎo)致N/P的變化，所以藻類暴發(fā)式生長究竟是N/P還是N、P濃度的作用還需要深入研究。有研究報(bào)道對藻類暴發(fā)式生長的水華現(xiàn)象是由于水體中P濃度升高引起的，在易暴發(fā)水華的富營養(yǎng)化水體中，浮游植物有充足的營養(yǎng)鹽支持，而P營養(yǎng)鹽由于易形成磷酸鹽沉積，所以在水體中，P營養(yǎng)鹽濃度降低趨勢顯著［6］。在劉俊鵬等［7］對地表水體藻類生長增殖的情況研究中，分析得知總磷是限制該地表水體藻類生長的關(guān)鍵因子，且當(dāng)營養(yǎng)鹽磷濃度為0.1 mg/L時(shí)會形成輕度硅藻水華，而營養(yǎng)鹽磷濃度為0.3 mg/L時(shí)會形成重度硅藻水華。王俊等［8］研究說明了磷對杜氏鹽藻生長的影響，試驗(yàn)中增加氮和磷都可以促進(jìn)其繁殖，隨著磷濃度含量增加，藻類生長速度提高。唐匯娟［9］綜合分析了國內(nèi)35個(gè)湖泊的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生水華現(xiàn)象的23個(gè)湖泊中，水體中N/P變化為13～35，在沒有發(fā)生水華現(xiàn)象的12個(gè)湖泊中，水體中N/P則小于13。因此有研究者提出水華現(xiàn)象是由于P濃度上升的結(jié)果，與N/P的下降無關(guān)。以斜生柵藻（Scenedesmusobliquus）為研究對象，通過測定藻類密度值以分析斜生柵藻的生長曲線，并研究適合其生長的磷濃度范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)藻種為斜生柵藻。

試驗(yàn)所用試劑有1.74 g/L硝酸鈉、磷酸二氫鈉、3 g/L檸檬酸、3 g/L檸檬酸鐵胺、0.5 g/L乙二酸四乙酸二鈉、1.5 g/L硫酸鎂、1.9 g/L氯化鈣、20 g/L碳酸鈉、2.86 g/L硼酸、1.86 g/L氯化錳、0.22 g/L硫酸鋅、0.08 g/L硫酸銅、0.021 g/L鉬酸鈉。

1.2 方法

采用BG-11培養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，以磷酸二氫鈉為添加磷源，通過改變磷酸二氫鈉的用量控制培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽磷濃度，設(shè)置5組不同磷濃度梯度，分別為A1（0.01 mg/L）、A2（0.05 mg/L）、A3（0.1 mg/L）、A4（0.15 mg/L）和A5（0.20 mg/L），如表1所示，并以不添加磷酸二氫鈉的培養(yǎng)液為對照組（CK）。配制BG-11培養(yǎng)液需先配制5個(gè)Stock，Stock1為分別稱取0.3 g檸檬酸、0.3 g檸檬酸鐵胺及0.05 g乙二酸四乙酸二鈉，用去離子水定容至100 mL；Stock2為分別稱取1.74 g硝酸鈉、1.5 g硫酸鎂，用去離子水定容至1 000 mL；Stock3為稱取0.19 g氯化鈣溶于去離子水，定容至100 mL；Stock4為稱取2 g碳酸鈉溶于去離子水中，定容至100 mL；Stock5為分別稱取2.86 g硼酸、1.86 g氯化錳、0.22 g硫酸鋅、0.021 g鉬酸鈉以及0.08 g硫酸銅，并用去離子水將其定容至1 000 mL［10］。

表1 6種不同磷濃度的培養(yǎng)液

分 別 量 取2 mL Stock1、20 mL Stock2、2 mL Stock3、1 mL Stock4和1 mL Stock5，用去離子水定容至1 000 mL，將配制好的6種不同磷濃度的培養(yǎng)液分別量取300 mL備用。

1.3 培養(yǎng)條件

準(zhǔn)備18個(gè)已經(jīng)清洗、烘干及滅菌過的250 mL錐形瓶，分為3組，即每個(gè)濃度設(shè)置3次重復(fù)，將配制好的不同磷濃度的培養(yǎng)液分別倒入其中，每個(gè)錐形瓶平均倒入150 mL，并加入1 mL藻液。充分搖勻后，用封口膜封住錐形瓶瓶口，放入智能培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。環(huán)境條件設(shè)置為光暗比為12 h∶12 h，光照為80%，溫度為28℃，濕度為60%，培養(yǎng)時(shí)間為7 d，培養(yǎng)期間每日早、中、晚各選取固定時(shí)間進(jìn)行人工搖瓶3次，并隨機(jī)調(diào)換錐形瓶位置。

1.4 藻的計(jì)數(shù)

分別從0、0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L這6個(gè)不同磷濃度梯度下取樣，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察，3個(gè)重復(fù)組均要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。取樣時(shí)間為每天16：00，測量取樣時(shí)，首先搖勻每瓶樣液，然后利用移液槍吸取0.1 mL藻液，讓藻液滲入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，在顯微鏡下觀察斜生柵藻的形態(tài)，記錄藻密度及藻細(xì)胞形態(tài)的變化，設(shè)置3次重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

藻密度計(jì)算公式［11］：

式中，D為藻密度；N為計(jì)數(shù)板5個(gè)中方格的細(xì)胞總數(shù)；N/5×25為中央大方格細(xì)胞總數(shù)；n為稀釋倍數(shù)。

式中，X2為培養(yǎng)某一時(shí)間末的藻類密度；X1為培養(yǎng)某一時(shí)間開始的藻類密度；（t2-t1）為某一時(shí)間段。

數(shù)據(jù)記錄采用Excel 2013軟件；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS17.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷濃度對斜生柵藻生長的影響

試驗(yàn)組藻密度隨培養(yǎng)天數(shù)的變化結(jié)果如表2所示，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，各組藻密度呈增長趨勢。在培養(yǎng)1 d后，在磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最高，達(dá)30.72×104個(gè)細(xì)胞/mL，對照組藻密度最低，為11.78×104個(gè)細(xì)胞/mL；在試驗(yàn)培養(yǎng)2 d、磷濃度0.20mg/L條件下藻密度最大，為36.68×104個(gè)細(xì)胞/mL，在磷濃度0.05 mg/L條件下藻密度最小，為8.65×104個(gè)細(xì)胞/mL；在培養(yǎng)3 d、磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，為35.78×104個(gè)細(xì)胞/mL，在磷濃度0.05 mg/L條件下藻密度最小，為20.68×104個(gè)細(xì)胞/mL；在培養(yǎng)4 d、磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最大，為42.60×104個(gè)細(xì)胞/mL，在磷濃度0.01 mg/L條件下藻密度最小，為16.58×104個(gè)細(xì)胞/mL，比培養(yǎng)3 d后的藻密度減少了37.74%；在培養(yǎng)5 d、磷濃度0.10 mg/L條件下藻密度最大，為85.03×104個(gè)細(xì)胞/mL，在磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最小，為44.25×104個(gè)細(xì)胞/mL；在培養(yǎng)6 d、磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，為107.8×104個(gè)細(xì)胞/mL，對照組藻密度最小，為70.72×104個(gè)細(xì)胞/mL；在培養(yǎng)7 d、磷濃度0.20 mg/L條件下藻密度最大，為129.38×104個(gè)細(xì)胞/mL，對照組藻密度最小，為105.42×104個(gè)細(xì)胞/mL。

表2 不同磷濃度下斜生柵藻的密度 （單位：104個(gè)細(xì)胞/mL）

2.2 不同磷水平下斜生柵藻比生長速率

由圖1可見，在培養(yǎng)周期內(nèi)對照組比生長速率最大，為0.44，在磷濃度0.01 mg/L條件下比生長速率次之，為0.38，其中，在磷濃度0.20 mg/L條件下比生長速率最低，為0.26。分析可知，在培養(yǎng)初期，磷濃度對藻類生長有明顯的影響，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，磷濃度對藻類生長的影響明顯降低，在磷濃度為0.15 mg/L時(shí)，藻類生長較好，表明藻類生長較適宜的磷濃度為0.15 mg/L。

圖1 培養(yǎng)周期內(nèi)對照組（CK）與試驗(yàn)組（A1、A2、A3、A4和A5）比生長速率比較

由圖2可以看出，在藻類培養(yǎng)周期內(nèi)，試驗(yàn)組相對于對照組每天藻類生長速率波動(dòng)較大，說明藻類生長受多種條件影響，其生長過程呈非線性。在磷濃度0.20 mg/L條件下藻類比生長速率波動(dòng)幅度最大，說明在磷濃度較高的條件下，藻類出現(xiàn)暴發(fā)式生長。培養(yǎng)5～6 d，除磷濃度0.20 mg/L外，其他各濃度比生長速率均上升，在培養(yǎng)6～7 d、磷濃度0.15 mg/L條件下的比生長速率高于其他濃度，說明磷濃度0.15 mg/L較適宜于藻類生長。

圖2 試驗(yàn)組相對于對照組的斜生柵藻比生長速率的變化

2.3 單因素方差分析

為了深入分析磷濃度對藻類生長的影響，對試驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，從表3可以看出，組間離差平方和所占比例較小，僅為1.5%，組內(nèi)離差平方和所占比例較大，為98.5%，據(jù)此，說明磷濃度梯度在培養(yǎng)周期內(nèi)對藻類密度影響不顯著，藻類密度受其他相關(guān)因子影響較大。

表3 單因素方差分析

從單因素方差分析均值（圖3）可以看出，在磷濃度0.15 mg/L條件下，培養(yǎng)周期內(nèi)藻類密度均值最大，對照組中藻類密度均值最小，磷濃度的增加對藻類生長有促進(jìn)作用，當(dāng)磷濃度增加值達(dá)0.15 mg/L時(shí)，藻類生長密度達(dá)到最大，繼續(xù)提高磷濃度到0.20 mg/L時(shí)，藻類生長密度下降，說明磷濃度達(dá)0.15 mg/L對藻類生長較為充足，繼續(xù)提高營養(yǎng)鹽磷濃度，藻類生長受到限制。

圖3 不同磷濃度梯度下藻類密度均值分析

3 小結(jié)與討論

一般情況下，藻類生長受氮磷比影響，根據(jù)研究資料得知，N/P為16∶1稱作Redfield比率，在諸多研究中，Redfield比率作為區(qū)分藻類生長的營養(yǎng)鹽限制類型［13-15］。斜生柵藻是一種在水中對污染物有一定耐受性的單細(xì)胞綠藻，常用于檢測水環(huán)境質(zhì)量的指示物種［16-18］，本試驗(yàn)選斜生柵藻為試驗(yàn)培養(yǎng)對象，在不同磷濃度梯度條件下培養(yǎng)藻類，結(jié)果表明，在營養(yǎng)鹽氮充足的條件下，磷濃度對藻類生長初期有促進(jìn)作用，斜生柵藻在磷濃度0.15 mg/L條件下藻密度最大，磷濃度提高到大于0.15 mg/L時(shí)，藻類生長受到限制。陳永川等［19］在研究滇池藻類生長情況與環(huán)境因子關(guān)系時(shí)，通過測量滇池不同區(qū)域水體和不同層次水體葉綠素a動(dòng)態(tài)，得出水體葉綠素a的含量年變化與滇池水體總磷呈顯著正相關(guān)，水體中藻類的生長與總磷及可溶性磷在空間變化上呈顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，水體中的磷濃度對斜生柵藻的生長有促進(jìn)作用。侯秀麗等［20］在研究滇池氮磷營養(yǎng)鹽對水體浮游植物結(jié)構(gòu)變化影響中，通過滇池10個(gè)監(jiān)測樣點(diǎn)藻類變化與氮磷變化的關(guān)系，得出水體中綠藻更加適合較高的氮磷比環(huán)境，藻類生長與水體總磷呈顯著正相關(guān)。在本次試驗(yàn)培養(yǎng)初期，斜生柵藻的形態(tài)多由2個(gè)藻細(xì)胞組成，但隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，較多地出現(xiàn)4個(gè)藻細(xì)胞和8個(gè)藻細(xì)胞的形態(tài)，藻密度增加。培養(yǎng)期到5 d時(shí)，各試驗(yàn)組的藻密度均明顯增加，但是在磷濃度0.20 mg/L條件下，藻密度減小，許海等［21］研究結(jié)果顯示斜生柵藻在磷濃度達(dá)0.20 mg/L時(shí)，斜生柵藻達(dá)到最大生長速率，提出藻類生長同時(shí)受到水體中氮磷比環(huán)境條件的影響。蔣鑫艷等［22］在研究烏梁素海葉綠素a時(shí)空分布與環(huán)境因子關(guān)系時(shí)，得出總磷是影響烏梁素海葉綠素a的主要水化學(xué)因子，總磷與藻類生物量呈顯著性正相關(guān)。

在營養(yǎng)鹽磷濃度水平較低條件下，斜生柵藻生長受到營養(yǎng)鹽的限制影響，結(jié)果表明，在磷濃度0.15 mg/L條件下斜生柵藻密度達(dá)最大值，為129.25×104個(gè)細(xì)胞/mL。根據(jù)試驗(yàn)組相對于對照組的比生長速率數(shù)據(jù)分析，藻類生長受多種條件影響，其生長過程呈非線性。在磷濃度0.20 mg/L條件下，斜生柵藻培養(yǎng)初期相對于對照組比生長速率最高，表明在較高磷濃度條件下，藻類會出現(xiàn)暴發(fā)式增殖，說明水體中較高的磷濃度是水華暴發(fā)的原因之一。