張文典，崔 杰，夏一帆，張 欣，段少峰*

（1河南大學第一附屬醫(yī)院，開封457001；2河南大學藥學院，開封457001）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，由于其惡性程度高和易產(chǎn)生抗藥性，臨床常用化學藥物治療遇到了種種困難，如藥物毒性、藥物分布不規(guī)則、藥物溶解度小、體內(nèi)半衰期短等等。研究人員一直致力于研發(fā)更為精準有效的治療方法，利用納米材料靶向遞送藥物就是研究熱點之一［1-2］。

葉酸在靶向遞送系統(tǒng)中是一個非常具有潛力的配體。葉酸受體在大多數(shù)人體正常組織極少表達，而在多種人類腫瘤細胞例如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、肝癌、鼻咽癌等腫瘤細胞中存在過度表達，葉酸與葉酸受體具有高親和力，因此以葉酸為靶向分子的藥物遞送系統(tǒng)可以經(jīng)葉酸受體介導的細胞內(nèi)吞作用而呈現(xiàn)出特定的靶向性。此外，葉酸也因其可應用性強、高穩(wěn)定性和無免疫原性而被研究者廣泛關注［3］。Yen等［4］研究發(fā)現(xiàn)，用葉酸修飾的金納米粒在HepG2細胞中的攝取效率遠高于無葉酸修飾的金納米粒。Yang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，由Folate-PEG3000-PLA2000制備的葉酸靶向姜黃素膠束對MCF-7和HepG2細胞的入胞效率和體外細胞毒性顯著增強。Yuan等［6］通過在石墨烯納米復合物（GGMPN）上連接單抗P-糖蛋白（P-gp）抗體、葉酸（FA）和miR-122制備的金納米粒子聯(lián)合遞送系統(tǒng)，具有藥物靶向性和控釋特性，能夠顯著促進耐藥HepG2細胞凋亡。

脂質(zhì)體作為一種經(jīng)典的藥物遞送系統(tǒng)，其具有載藥性能強、實用性好、生物相容性好、完全生物降解性、無毒性、無免疫原性和可以控制藥物釋放等眾多優(yōu)勢，這使其在藥物載體的制備中的應用備受關注［7-9］。研究者對脂質(zhì)體進行了諸多改造，研究發(fā)現(xiàn)利用聚乙二醇（PEG）和葉酸對脂質(zhì)體表面進行化學修飾，可以使脂質(zhì)體通過葉酸受體介導的內(nèi)吞作用，達到靶向遞送藥物的目的［10］。然而在對脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)進行靶向性設計時，PEG的相對分子質(zhì)量、鏈長、構(gòu)象、覆蓋度等都會對遞送效率產(chǎn)生影響，因此在設計含PEG的配方時，需要仔細考慮這些因素［11］。為了探索能夠?qū)崿F(xiàn)肝癌靶向遞送的葉酸偶聯(lián)物，本研究將葉酸、膽固醇琥珀酸單酯與不同相對分子質(zhì)量的PEG材料連接，合成了兩種葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯Folate-PEG-CHEMS材料（Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS），F(xiàn)olate-PEG-CHEMS材 料的結(jié)構(gòu)特點使其具有較好的穩(wěn)定性和兩親性，在靶向遞送藥物至肝癌細胞方面的應用潛力值得探索。利用核磁共振氫譜氫譜（1H NMR）和超高分辨率復雜體分離鑒定質(zhì)譜系統(tǒng)對終產(chǎn)物進行了表征。將兩者應用于脂質(zhì)體制備，以鈣黃綠素為熒光標記，制備了鈣黃綠素脂質(zhì)體，通過體外細胞攝取實驗評價Folate-PEG2000-CHEMS和Folate-PEG4000-CHEMS在脂質(zhì)體藥物遞送所起到的作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

鈣黃綠素（calcein）、膽固醇琥珀酸單酯（cho‐lesteryl hemisuccinate，CHEMS）、聚 氧 乙 烯 二 胺MW2000 D（H2N-PEG2000-NH2）、聚氧乙烯二胺MW4000 D（H2N-PEG4000-NH2）均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；膽固醇（cholesterol，BBI life sciences corporation）；氫化大豆磷脂（HSPC）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE-PEG2000均購置于上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；葉酸（folic acid，F(xiàn)A，百靈威科技有限公司）；Sephadex G-25凝膠、CL-4B凝膠（上海源葉生物科技有限公司）；RPMI 1640（美國Sigma-aldrich公司）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

ZEN3690激光粒度儀（英國馬爾文公司）；UV-2000型紫外可見分光光度計［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；超高分辨率復雜體分離鑒定質(zhì)譜系統(tǒng)（Q Exactive Plus，美國賽默飛世爾科技有限公司）；Ziss 880型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國卡爾·蔡司股份公司）；CytoFLEX型流式細胞儀［貝克曼庫爾特生物科技（蘇州）有限公司］。

2 方 法

2.1 葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成

2.1.1 葉酸-聚乙二醇-胺(Folate-PEG-amine)的合成 將葉酸0.06 mmol溶于DMSO 1 mL，后依次加入EDC 0.08 mmol、NHS 0.07 mmol以及三乙醇胺34.8μL，通入氬氣保護，室溫避光攪拌反應約1 h，加入H2N-PEG2000-NH2或H2N-PEG4000-NH20.05 mmol，避光攪拌過夜。加入Na2CO3水溶液（50 mmol/L）5 mL，于20 000 r/min離心后去除不溶物，將剩余溶液過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱，去除未反應的小分子副產(chǎn)物，純化后的溶液冷凍干燥24 h，得黃色蓬松固體。

2.1.2 膽固醇琥珀酸單酯活化物(CHEMS-NHS)的合成 將CHEMS 1 mmol、NHS 2 mmol共溶于四氫呋喃10 mL中，取DCC 3.2 mmol溶于四氫呋喃5 mL中，將兩溶液混合后室溫攪拌過夜。將反應液過濾棄濾渣，將濾液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，35℃水浴下，減壓旋蒸除盡溶劑四氫呋喃，殘余物以異丙醇和四氫呋喃混合溶液溶解后重結(jié)晶，將重結(jié)晶產(chǎn)物真空干燥24 h，得白色粉狀固體。

2.1.3 葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯(Folate-PEG-CHEMS)的合成 將Folate-PEGamine 20μmol、CHEMS-NHS 50μmol共溶于氯仿50 mL中，室溫下避光攪拌過夜。反應結(jié)束后，35℃水浴下，減壓旋蒸除盡溶劑氯仿，殘余物加入NaCO3水溶液（50 mmol/L）5 mL，室溫下水化30 min，再于20 000 r/min離心10 min后，將上清液轉(zhuǎn)移入8 kD透析袋于蒸餾水中透析72 h純化產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥48 h，得黃色蓬松固體。

2.2 葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯的表征

2.2.11H NMR表征 分別稱取FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS各5 mg，以CDCl3為溶劑將產(chǎn)物溶解，利用核磁共振儀進行1H NMR表征。

2.2.2 質(zhì)譜表征 分別取適量FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS溶于甲醇1 mL，過濾后，利用超高分辨率復雜體分離鑒定質(zhì)譜系統(tǒng)分析產(chǎn)物，對終產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)驗證。

2.3 脂質(zhì)體的制備與表征

2.3.1 鈣黃綠素脂質(zhì)體的制備 本研究采用薄膜分散水化法制備鈣黃綠素脂質(zhì)體。首先合成靶向脂質(zhì)體，按物質(zhì)的量比55∶40∶4.5∶0.5稱取HSPC/CHOL/DSPE-PEG2000/FA-PEG2000-CHEMS（或FA-PEG4000-CHEMS）置于梨形瓶中，溶于適量氯仿，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，于37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)約1 h，后加入適量鈣黃綠素水溶液（250 mmol/L）與PBS（pH 7.4），60℃水化約30 min，經(jīng)過450 nm、220 nm薄膜各5次進行整粒。以PBS（pH 7.4）為洗脫劑，過CL-4B瓊脂糖凝膠柱分離純化脂質(zhì)體，即得葉酸靶向鈣黃綠素脂質(zhì)體（FA-PEG2000-L與FA-PEG4000-L）。非靶向鈣黃綠素脂質(zhì)體（C-L）的制備同上，僅不加FA-PEG2000-CHEMS或FAPEG4000-CHEMS。

2.3.2 鈣黃綠素濃度的測定 樣品中鈣黃綠素的質(zhì)量濃度利用紫外分光光度法計算而得，檢測波長為491 nm。配制質(zhì)量濃度為1，2，3，5，8μg/mL的鈣黃綠素水溶液，測定各濃度吸收度，繪制標準曲線。

2.3.3 鈣黃綠素脂質(zhì)體包封率的測定 取純化后鈣黃綠素脂質(zhì)體100μL，加入10%Triton X-100 100μL，超聲振蕩破膜，利用紫外分光光度法測定脂質(zhì)體中藥物含量，計算包封率（%，脂質(zhì)體中藥物含量/總投料量×100）。

2.3.4 平均粒徑、分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位的測定 取適量脂質(zhì)體，用適量PBS（pH 7.4）稀釋后，采用激光粒度儀測定脂質(zhì)體粒徑、分散系數(shù)和Zeta電位。

2.4 脂質(zhì)體的體外細胞攝取實驗

FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS靶向遞送效率通過體外細胞攝取實驗來評價。

2.4.1 HepG2細胞的培養(yǎng) HepG2細胞培養(yǎng)瓶中加入含有1%青霉素鏈霉素和10%FBS的無葉酸RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細胞用于體外細胞攝取實驗。

2.4.2 體外細胞攝取實驗 取對數(shù)生長期HepG2細胞經(jīng)胰酶消化為混懸狀態(tài)后轉(zhuǎn)移入無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后的細胞溶液棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，等份分裝入4個無菌EP管中?？瞻捉M不做加藥處理，給藥組分別加入非靶向鈣黃綠素脂質(zhì)體（C-L）或靶向鈣黃綠素脂質(zhì)體（FA-PEG2000-L或FA-PEG4000-L），37℃下孵育1 h。孵育結(jié)束后，將細胞用冷的PBS洗3遍以除去未結(jié)合的脂質(zhì)體。利用激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細胞儀檢測HepG2細胞內(nèi)熒光強度。

2.5 統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 5軟件對實驗數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計，計量資料結(jié)果以xˉ±s表示，兩組之間比較選用t檢驗和方差分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯的合成

葉酸、膽固醇琥珀酸單酯結(jié)構(gòu)上含有羧基，聚氧乙烯二胺分子兩端為氨基。本研究以酰胺反應為合成基礎，以EDC和NHS為催化劑，分別合成葉酸-聚乙二醇-胺（Folate-PEG-amine）和膽固醇琥珀酸單酯活化物（CHEMS-NHS），將兩者反應后，成功將葉酸、膽固醇琥珀酸單酯接枝到PEG上，合成了葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯（FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS），合成路線如圖1所示。

Figure 1 Synthesis of Folate-PEG-CHEMSCHEMS:Cholesteryl hemisuccinate;FA:Folic acid

3.2 1H NMR圖譜解析

聚氧乙烯二胺（H2N-PEG-NH2）、膽固醇琥珀酸單酯（CHEMS）、葉酸（FA）和葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯（Folate-PEG-CHEMS）的1H NMR圖譜如圖2所示。圖2-B為CHEMS的1H NMR圖譜，δ7.26為溶劑（CDCl3）峰，δ5.38為CHEMS的烯烴質(zhì)子峰，δ0.69~2.21是膽固醇脂肪族的質(zhì)子峰，δ2.60~2.67為CHEMS上琥珀酸（-CH2-CH2）質(zhì)子峰。圖2-A為H2N-PEG-NH2核磁氫譜圖，δ7.26為溶劑（CDCl3）峰，δ3.5~3.7為H2N-PEG-NH2重復單元（-CH2-CH2-O-）。與圖2-A、C相比較，圖2-D中Folate-PEG-CHEMS偶聯(lián)物1H NMR結(jié)果顯示δ3.54~3.67處出現(xiàn)了較強的峰，H2N-PEG-NH2重復單元（-CH2-CH2-O-），除了為H2N-PEG-NH2峰外，在δ8.64、7.72、6.67、6.56（圖中放大部分）處出現(xiàn)了葉酸結(jié)構(gòu)上（-CH）的質(zhì)子信號峰，此為葉酸的特征信號峰，由此推斷Folate-PEG-CHEMS已成功合成。

3.3 質(zhì)譜圖譜解析

Figure 2 1H NMR spectra of NH2-PEG4000-NH2(A),CHEMS(B),Folate-PEG-CHEMS(D)in CDCl3 and folic acid(C)in DMSO

本研究中所用聚乙二醇（PEG）相對分子質(zhì)量分別約為2 000、4 000，終產(chǎn)物FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS的理論平均相對分子質(zhì)量分別約為2 891、4 891。從圖3質(zhì)譜分析結(jié)果可看到FA-PEG2000-CHEMS和FA-PEG4000-CHEMS相對分子質(zhì)量為2 891、4 823，與所合成終產(chǎn)物的理論相對分子質(zhì)量基本吻合，從而證實所合成的高分子聚合物為所需要的目標化合物。

3.4 鈣黃綠素脂質(zhì)體的包封率

鈣黃綠素質(zhì)量濃度在1~8μg/mL呈現(xiàn)良好的線性關系。其線性回歸方程為A=0.051c-0.006 8，R2=0.999 1。計算得鈣黃綠素脂質(zhì)體包封率為（15.6±5.1）%。

Figure 3 MS spectra of FA-PEG2000-CHEMS(A)and FA-PEG4000-CHEMS(B)

3.5 平均粒徑、分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位

采用激光粒度儀測定各項指標。測得鈣黃綠素脂質(zhì)體的平均粒徑為（205.8±10.2）nm，分散系數(shù)（PDI）為0.146±0.09。經(jīng)電位分析儀測試脂質(zhì)體的Zeta電位為-（1.19±0.31）mV。靶向組脂質(zhì)體與非靶向脂質(zhì)體粒徑分布及Zeta電位表征無顯著性差異。

3.6 體外細胞攝取實驗

鈣黃綠素脂質(zhì)體在肝癌HepG2中的靶向性研究通過體外細胞攝取實驗進行評價。激光共聚焦掃描顯微鏡分析體外HepG2細胞攝取鈣黃綠素熒光結(jié)果如圖4所示，非靶向脂質(zhì)體組（圖4-B）與FA-PEG2000-L組（圖4-C）HepG2細胞中呈現(xiàn)出微弱熒光，說明非靶向脂質(zhì)體與FA-PEG2000-L攝取效率低，未能在該實驗條件下成功遞送藥物。圖4-D為靶向脂質(zhì)體FA-PEG4000-L在HepG2細胞中的攝取情況，結(jié)果顯示HepG2細胞內(nèi)有明顯的鈣黃綠素綠色熒光，且強度高于其他組。流式細胞術的定量分析結(jié)果如圖5、圖6所示，普通鈣黃綠素脂質(zhì)體（C-L）組、FA-PEG2000-L組、FA-PEG4000-L靶向脂質(zhì)體組內(nèi)熒光強度與對照組（Blank）相比均具有顯著性差異（P＜0.01），C-L組與FA-PEG2000-L組熒光強度相比無顯著性差異（P＞0.05），表明葉酸偶聯(lián)物FA-PEG2000-CHEMS不能夠提升HepG2細胞對藥物的攝取效率。然而，F(xiàn)A-PEG4000-L靶向脂質(zhì)體組的熒光強度值分別約為C-L組與FA-PEG2000-L組的3.6和3.1倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明FA-PEG4000-L靶向脂質(zhì)體能提升HepG2細胞對藥物的攝取效率，葉酸偶聯(lián)物FA-PEG4000-CHEMS有助于提高脂質(zhì)體在HepG2細胞中的入胞能力。

4 討論

Figure 4 Fluorescence images of cellular uptake in HepG2 cellsA:Blank;B-D:HepG2 cells treated with non-targeted calcein liposome(C-L),FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L(D)at 37°C for 1 hour,respec‐tively

脂質(zhì)體技術良好的市場前景和技術性能已使其成為制藥、生物技術、免疫調(diào)節(jié)、遺傳工程、基因藥物等研究領域的熱點［12-13］。脂質(zhì)體技術的臨床應用潛力令人矚目，Patisiran陽離子脂質(zhì)體注射液作為全球第一款siRNA藥物于2018年獲批上市［14］。脂質(zhì)體由磷脂和適當?shù)母郊觿┙M成，磷脂和膽固醇是形成脂質(zhì)體雙分子層的基礎物質(zhì)，兩者也是天然脂蛋白和生物膜的組成成分，因此具有高度的生物相容性，含有靶向基團結(jié)構(gòu)修飾的脂質(zhì)體可以用于靶向特定的細胞群［15］。葉酸脂質(zhì)體是一種受體靶向型藥物遞送系統(tǒng)，通常由親水性直鏈高分子將葉酸分子與脂質(zhì)體表面聯(lián)接起來而獲得［16］。

本研究以葉酸為靶向分子，以親水鏈H2NPEG-NH2（H2N-PEG2000-NH2或H2N-PEG4000-NH2）為主體，一端氨基與一分子葉酸經(jīng)碳二亞胺類脫水劑EDC催化發(fā)生偶聯(lián)反應，得到單端葉酸修飾親水鏈段FA-PEG-NH2，疏水分子膽固醇琥珀酸單酯通過DCC脫水劑催化得到CHEMS-NHS活性酯，進一步與FA-PEG-NH2縮合得到葉酸靶向兩親性分子葉酸-聚乙二醇-膽固醇琥珀酸單酯（FA-PEG2000-CHEMS與FA-PEG4000-CHEMS），其側(cè)鏈為酰氨鍵和酯鍵，水解穩(wěn)定性較好，同時，原料成本低且合成工藝簡單。利用核磁共振氫譜及高分辨質(zhì)譜成功驗證其結(jié)構(gòu)的正確性。高分子PEG具有親水性，小分子膽固醇琥珀酸單酯為疏水性，因此，終產(chǎn)物Folate-PEG-CHEMS具有兩親性，可被應用于脂質(zhì)體制備。

Figure 5 Typical pictures of cellular uptake measured by flow cytometry.HepG2 cells were treated with C-L,FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L at 37°C for 1 hour

Figure 6 Cellular uptake measured by flow cytometry(xˉ±s,n=3)HepG2 cells were treated with C-L,FA-PEG2000-L or FA-PEG4000-L at 37°C for 1 hour**P＜0.01

本研究以鈣黃綠素作為熒光標記物，制備了非靶向及葉酸靶向鈣黃綠素脂質(zhì)體，脂質(zhì)體處方為HSPC/Cholesterol/DSPE-PEG2000/FA-PEG2000-CHEMS（或FA-PEG4000-CHEMS），各組分物質(zhì)的量比為55∶40∶4.5∶0.5，其主要成分HSPC/CHOL/DSPEPEG2000物質(zhì)的量占比99.5%，此三者為FDA于1995年批準的第1個PEG化長循環(huán)脂質(zhì)體DOXIL的處方成分，屬于經(jīng)典且安全的脂質(zhì)體輔料。FAPEG2000-CHEMS或FA-PEG4000-CHEMS物質(zhì)的的量占比為0.5%，偶聯(lián)物一端為葉酸，一端為類膽固醇結(jié)構(gòu)，此類膽固醇結(jié)構(gòu)可融入脂質(zhì)體脂質(zhì)層，從而將葉酸錨定在脂質(zhì)體表面。所得鈣黃綠素脂質(zhì)體呈現(xiàn)微弱負電荷，相較于陽離子脂質(zhì)體、無機納米粒等藥物遞送系統(tǒng)，安全性高。在脂質(zhì)體表面進行PEG修飾有助于載體躲避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲，使脂質(zhì)體具有長循環(huán)的效果，且可在脂質(zhì)體表面形成水化層，有助于保持脂質(zhì)體穩(wěn)定性，然而，PEG修飾對載體的遞送也可能會相應產(chǎn)生一定影響［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用不同相對分子質(zhì)量的葉酸PEG偶聯(lián)物使脂質(zhì)體在遞送效率方面呈現(xiàn)出差異。葉酸受體靶向脂質(zhì)體分別用兩種葉酸偶聯(lián)物FA-PEG2000-CHEMS與FA-PEG4000-CHEMS合成，用激光共聚焦掃描顯微鏡及流式細胞術分別定性及定量檢測了靶向功能性材料將藥物輸送至腫瘤細胞內(nèi)的效果。結(jié)果表明，F(xiàn)A-PEG4000-L成功將鈣黃綠素遞送至肝癌HepG2細胞，且FA-PEG4000-L靶向脂質(zhì)體組的細胞內(nèi)熒光強度分別約為普通脂質(zhì)體組、FA-PEG2000-L組的3.6和3.1倍（P＜0.01），呈現(xiàn)出更高效的遞送效率。推測此種情況與PEG鏈長度有關，葉酸和脂質(zhì)錨定物之間需要一個基于適宜長度的PEG的間隔物，以實現(xiàn)有效的葉酸受體介導的脂質(zhì)體靶向腫瘤細胞。

本研究表明，葉酸偶聯(lián)物FA-PEG2000-CHEMS與FA-PEG4000-CHEMS能夠應用于脂質(zhì)體制備，且FA-PEG4000-CHEMS所制備脂質(zhì)體FA-PEG4000-L具有相對更強的遞送能力。葉酸靶向材料FAPEG4000-CHEMS有助于提升脂質(zhì)體在肝癌HepG2細胞中的遞送效率，且該材料制備簡便，可操作性強，具有兩親性，可應用于納米藥物遞送系統(tǒng)，應用潛力較大，后續(xù)將進一步探索其在靶向遞送基因藥物治療肝癌方面的應用。