卜 紅，周金培，張惠斌*

（1中國藥科大學(xué)新藥研究中心，南京210009；2中國藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室，南京210009）

在單克隆抗體類免疫檢查點(diǎn)抑制劑、嵌合抗原受體T淋巴細(xì)胞（CAR-T）療法和過繼性細(xì)胞療法等腫瘤免疫療法取得巨大成功后，靶向免疫系統(tǒng)的小分子調(diào)節(jié)劑成為了學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。不同于目前免疫治療中常用的大分子生物藥存在低生物利用度、價(jià)格昂貴、免疫相關(guān)不良反應(yīng)（irAE）等缺點(diǎn)，通過小分子藥物調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢，這些優(yōu)勢可以與生物學(xué)方法互補(bǔ)并具有潛在的協(xié)同作用［1-2］。而在腫瘤免疫小分子藥物的研發(fā)中，抑制免疫激酶的活性已經(jīng)成為腫瘤治療的一種強(qiáng)有力的方法。免疫激酶抑制劑可以調(diào)控機(jī)體自身免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤，并且隨著對激酶相關(guān)信號通路的深入研究，小分子免疫激酶抑制劑的開發(fā)從抑制致癌基因轉(zhuǎn)向了調(diào)控相關(guān)細(xì)胞信號通路，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯和免疫應(yīng)答，治療領(lǐng)域也逐漸從腫瘤擴(kuò)展到免疫系統(tǒng)疾病，包括炎癥、自身免疫病和退行性疾病等［3-4］。因此小分子免疫激酶抑制劑的進(jìn)一步開發(fā)將為腫瘤及免疫相關(guān)疾病的治療開辟新的途徑。目前已經(jīng)有多個(gè)免疫蛋白激酶得到了報(bào)道，大量的研究證實(shí)了絲裂原活化蛋白激酶相互作用激酶（MNKs）在促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中的重要作用。相應(yīng)地，抑制MNKs活性可引起腫瘤細(xì)胞的增殖阻滯和凋亡。除此之外，MNKs激酶還介導(dǎo)多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子和免疫檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)，提示其在免疫細(xì)胞中的潛在作用［5］。本文簡要介紹了MNKs的生物學(xué)結(jié)構(gòu)、信號通路及其小分子抑制劑的研究進(jìn)展。

1 MNKs的結(jié)構(gòu)

MNKs是絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMK）家族，1997年作為ERK的結(jié)合底物首次被報(bào)道［6］。在人類細(xì)胞中，由MKNK1和MKNK2兩個(gè)基因編碼的MNKs存在兩種亞型：MNK1和MNK2，它們通過選擇性剪接衍生出4種變體：MNK1a/MNK2a（全長）和MNK1b/MNK2b（缺乏短C端片段）［7］。這4種變體氨基酸序列的相似性約為80%，其核心催化域的序列也高度一致。此外，它們具有相似的N端區(qū)域，都包含N末端核定位信號序列（NLS），使得MNKs可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。MNK1a和MNK2a在C端含有一個(gè)MAPK結(jié)合域，可以被ERK和P38 MAPK磷酸化激活；MNK1b和MNK2b缺乏C端MAPK結(jié)合域，僅表現(xiàn)出中等的基礎(chǔ)活性（圖1）。MNKs的N端由反向平行的β折疊和調(diào)節(jié)性αC螺旋組成；C端由6個(gè)α螺旋組成，包括催化片段和含有Mg2+結(jié)合環(huán)、激活環(huán)以及P+1環(huán)的活化片段。除此之外，MNKs還具有區(qū)別于其他蛋白激酶的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征。一般激酶結(jié)構(gòu)中位于激活環(huán)末端高度保守的DFG（Asp/Phe/Gly）序列在MNKs中被DFD（Asp/Phe/Asp）序列取代。MNKs的催化域中還存在3個(gè)特定的插入結(jié)構(gòu)，分別位于DFD片段的C端（I1），αEF和αF螺旋之間（I2）以及αC螺旋的N端（I3）［8-10］（圖2）。

Figure 1 Sequence structures of splice variants of Mitogen-activated protein kinase(MAPK)-interacting kinases(MNKs)NLS:Nuclear localization signal sequence;NES:Nuclear export signal

Figure 2 Protein crystal structure of MNK2(PDB code:4AC3)DFD motif:Asp226/Phe227/Asp228

2 MNKs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

MNKs位于Ras/Raf/ERK和p38 MAPK信號通路的下游交匯處，在受到生長因子和細(xì)胞外因子的刺激后，ERK和p38 MAPK可將MNKs磷酸化激活。磷酸化后的MNKs負(fù)責(zé)多個(gè)下游底物的磷酸化，包括真核翻譯起始因子4E（eIF4E）、異質(zhì)核蛋白A1（hnRNP A1）、軟脂酰化磷蛋白Sprouty2、PTB相關(guān)剪接因子（PSF）和細(xì)胞質(zhì)磷脂酶A2（cPLA2）。eIF4E是MNKs特征最明顯研究最廣泛的底物，MNKs可在保守的Ser209處特異性磷酸化eIF4E，被MNKs磷酸化后的eIF4E可以識別并直接結(jié)合含有7-甲基鳥苷部分的mRNA 5′末端帽子結(jié)構(gòu)。eIF4E是真核翻譯起始因子復(fù)合物4F（eIF4F）的重要組成部分，是mRNA翻譯的關(guān)鍵限速因子。eIF4F復(fù)合物由支架蛋白eIF4G、ATP依賴的RNA解旋酶eIF4A和eIF4E組成，eIF4G通過與eIF4E結(jié)合而接近mRNA，eIF4A與eIF4G結(jié)合以解開mRNA 5′末端非翻譯區(qū)的二級結(jié)構(gòu)，并促進(jìn)核糖體結(jié)合和5′UTR的掃描［11-12］。eIF4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）是eIF4E依賴性mRNA翻譯的負(fù)調(diào)控因子，可與eIF4G競爭結(jié)合eIF4E。4E-BP1在PI3K/AKT/mTORC1信號通路的下游，可被mTORC1磷酸化。磷酸化的4E-BP1不再與eIF4E結(jié)合，從而促進(jìn)eIF4F復(fù)合物的形成和mRNA的翻譯。因此mTORC1抑制劑，如雷帕霉素可抑制eIF4E的活性，這也表明MNKs抑制劑與雷帕霉素之間存在一定的協(xié)同作用［13］（圖3）。

Figure 3 Signal transduction pathway of Mitogen-activated protein kinase(MAPK)-interacting kinases(MNKs)RTK:Receptor tyrosine kinase;PI3K:Phosphoinositide 3-kinase;mTORC1:Mammalian target of rapamycin complex 1;ERK:Extracellular regulated protein kinases;MKK:MAP kinase kinase;MAPK:Mitogen-activated protein kinase;eIF4E:Eukaryotic translation initiation factor 4E;PSF:Polypy‐rimidine tract-binding protein dependent splicing factor;hnRNP A1:Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1;cPLA2:Cytoplasmic phospholipase A2

3 MNKs與腫瘤和腫瘤免疫療法

上調(diào)MNKs/eIF4E可促進(jìn)多種致癌蛋白的表達(dá)，大量研究表明，eIF4E在包括乳腺癌［14］、腎細(xì)胞癌［15］、卵巢癌［16］、宮頸癌［17］、前列腺癌［18］、肝癌［19］、淋巴瘤［20］和黑色素瘤［21］在內(nèi)的多種惡性腫瘤中都存在過表達(dá)和過度磷酸化的現(xiàn)象，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及不良預(yù)后密切相關(guān)。更重要的是，敲除或抑制MNKs的活性可以延緩腫瘤進(jìn)程，但對小鼠的正常發(fā)育沒有影響。此外，MNKs/eIF4E還可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子、趨化因子和免疫檢查點(diǎn)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控先天免疫的啟動、獲得性免疫的激活以及對免疫相關(guān)細(xì)胞因子的應(yīng)答［22］。抑制MNKs可以降低活化的T細(xì)胞表面免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1、TIM-3和LAG3的含量，還能減少TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［23-24］。因此，將免疫治療藥物（如CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制劑等）與MNKs抑制劑聯(lián)合使用具有廣闊的前景，MNKs抑制劑在其他免疫隔室和腫瘤細(xì)胞中的潛在作用也值得更深入的研究。最新的研究表明，靶向MNKs可能對慢性代謝性疾病如高血糖、肥胖等有治療作用，抑制MNKs可以降低高脂飲食小鼠脂肪組織的炎癥反應(yīng)，提高其葡萄糖耐量和對胰島素的敏感性［25-26］。

4 MNKs抑制劑的研究進(jìn)展

近年來，MNKs作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，受到了眾多科研機(jī)構(gòu)和制藥公司的關(guān)注和投資。雖然到目前為止還沒有小分子MNKs抑制劑藥物上市，但隨著對MNKs研究的深入和腫瘤免疫的興起，新型選擇性小分子MNKs抑制劑的開發(fā)也越來越受到重視?，F(xiàn)根據(jù)在研公司和化學(xué)結(jié)構(gòu)對MNKs抑制劑分類介紹。

4.1 Novartis公司

2000年，Novartis公司首次報(bào)道了十字孢堿衍生物CGP052088（MNK1 IC50=70 nmol/L）可以有效抑制MNK1的活性，并阻斷HEK293細(xì)胞中由eIF4E磷酸化導(dǎo)致的激酶級聯(lián)反應(yīng)［27］。2001年，該公司在體外激酶測定中將CGP57380（MNK1 IC50=0.87μmol/L，MNK2 IC50=1.6μmol/L）鑒定為MNKs抑制劑，這是首個(gè)人工合成的MNKs小分子抑制劑。同時(shí)，CGP57380對其他蛋白激酶也具有一定的抑制活性，例如CK1（IC50=0.51μmol/L）和DYRK3（IC50=3.2μmol/L）等［28-29］。盡管CGP57380的IC50較低，對其他激酶的選擇性較差，但其在多種細(xì)胞系中均能抑制eIF4E的磷酸化。目前，在許多與MNKs/eIF4E相關(guān)的生物學(xué)研究中，CGP57380仍作為工具化合物使用。

2016年，Novartis公司通過高通量篩選（HTS）報(bào)道了一類氨基吡啶骨架的選擇性MNKs抑制劑?；衔?（MNK1 IC50=0.7μmol/L，MNK2 IC50=0.9μmol/L）表現(xiàn)出中等的抑制活性，與MNK2（PDB：6AC3）的對接結(jié)果顯示，氨基吡啶與鉸鏈區(qū)域形成兩個(gè)氫鍵，苯并咪唑環(huán)與Phe159之間存在π-π相互作用（圖4-A）。根據(jù)化合物1的結(jié)合模式，進(jìn)一步優(yōu)化以提高效價(jià)和選擇性，通過在嘧啶環(huán)間位引入苯甲酰胺與鉸鏈區(qū)形成疏水作用，并在苯并咪唑環(huán)上引入哌嗪環(huán)與Glu209形成相互作用，化合物2（MNK1 IC50=4 nmol/L，MNK2 IC50=2 nmol/L）表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制活性。但氨基吡啶類化合物的后續(xù)優(yōu)化未能進(jìn)一步提高抑制活性，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向了氨基吡嗪類化合物，化合物3（MNK1 IC50=80 nmol/L，MNK2 IC50=20 nmol/L）激酶抑制活性雖然弱于化合物2，但其細(xì)胞內(nèi)磷酸化eIF4E的能力明顯提高。在化合物2和3的基礎(chǔ)上進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾，通過引入甲基破壞苯并咪唑和吡嗪之間的分子內(nèi)氫鍵，同時(shí)引入甲基哌嗪得到了活性更高和選擇性更強(qiáng)的化合物4（MNK1 IC50=1.5 nmol/L，MNK2 IC50=0.7 nmol/L）（圖4-B）。用異煙酰胺替換苯甲酰胺得到了化合物5（MNK1 IC50=3 nmol/L，MNK2 IC50=3 nmol/L），其表現(xiàn)出良好的理化性質(zhì)并能夠抑制人源多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞KMS11-luc的增殖［30］。

Figure 4 Cocrystal structure of compounds in MNK2A:Cocrystal structure of compound 1 in MNK2(PDB:6AC3);B:Cocrystal structure of compound 4 in MNK2(PDB:6AC3)

4.2 Lilly公司

2011年，Lilly公司通過HTS鑒定并報(bào)道了天然產(chǎn)物cercosporamide（MNK1 IC50=116 nmol/L，MNK2 IC50=11 nmol/L）是一種有效的選擇性MNKs抑制劑。Cercosporamide是一種已知的廣譜抗真菌藥，可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞系的eIF4E磷酸化，并減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡。作為首個(gè)口服且在小鼠體內(nèi)有效的MNKs抑制劑，cerco‐sporamide可以在給藥后30 min之內(nèi)有效抑制腫瘤異種移植小鼠肝組織中的eIF4E磷酸化，并有效抑制HCT116異種移植模型中腫瘤增殖和B16黑色素瘤模型的肺轉(zhuǎn)移瘤的生長而不引起小鼠體重降低。用cercosporamide處理急性髓系白血病（AML）細(xì)胞能夠以劑量依賴性方式抑制eIF4E磷酸化，并增強(qiáng)阿糖胞苷（Ara-C）或哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）抑制劑的抗白血病活性。在MV4-11異種移植模型中，cercosporamide能顯著增強(qiáng)阿糖胞苷的抗腫瘤活性［31-32］。

4.3 Bayer公司

Bayer公司在對CGP57380吡唑并嘧啶骨架和結(jié)合模式深入研究的基礎(chǔ)上，嘗試了多種結(jié)構(gòu)衍生化，報(bào)道了一系列具有高活性和選擇性的吡唑并嘧啶和吡咯并嘧啶骨架的MNK1抑制劑并進(jìn)行了多篇專利保護(hù)，代表化合物6（MNK1 IC50=44 nmol/L）和7（MNK1 IC50=1 nmol/L）［33-35］。隨 后Bayer公司又報(bào)道了一類具有吡咯并嘧啶三環(huán)和噻吩并嘧啶三環(huán)骨架的化合物，吡咯并嘧啶三環(huán)骨架化合物8（MNK1 IC50=1 nmol/L）活性得到了保持，將吡咯環(huán)替換為噻吩環(huán)并改變酰胺側(cè)鏈位置得到的化合物9（MNK1 IC50=0.6 nmol/L）對MNK1的抑制活性得到了進(jìn)一步的提升［36-37］。雖然這些化合物對MNK1有很強(qiáng)的抑制活性，但它們對MNK2的抑制活性和選擇性尚未得到報(bào)道。2018年，Bayer公司基于對先前報(bào)道的三環(huán)骨架化合物和eFFECTOR Therapeutics公司報(bào)道的含有吡啶酮-縮醛胺骨架化合物的研究，公開了一類新的化合物，代表化合物10和11對MNK1表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制活性，IC50均小于0.1 nmol/L［38-39］。

BAY1143269（MNK1 IC50=40 nmol/L，MNK2 IC50=904 nmol/L）是Bayer公司研發(fā)的首個(gè)進(jìn)入臨床的MNKs抑制劑。BAY1143269（結(jié)構(gòu)未公開）具有ATP競爭結(jié)合模式，于2015年3月獲批進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，與多西他賽聯(lián)合用于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療。雖然該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未公開，但其活性和功效的一些數(shù)據(jù)已被揭示。BAY1143269在體外可以抑制多種腫瘤細(xì)胞系中eIF4E的磷酸化，IC50從0.5μmol/L提高到2.6μmol/L，并可以阻斷MNKs調(diào)節(jié)的下游靶標(biāo)的表達(dá)，包括survivin，Cdc25C和cyclin B1。BAY1143269對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、結(jié)直腸癌和黑色素瘤異種移植瘤模型均有顯著的療效［40］。作為首個(gè)臨床MNKs抑制劑，BAY1143269在單一療法和聯(lián)合療法中表現(xiàn)出良好的選擇性、口服有效性和臨床前體內(nèi)功效，然而由于項(xiàng)目優(yōu)先的需要，Bayer公司終止了BAY1143269的臨床試驗(yàn)。

此外，除了Bayer公司，Boehringer Ingelheim公司［41-43］和南澳大利亞大學(xué)［44］也相繼公開了具有吡咯并嘧啶和噻吩并嘧啶骨架的化合物，這些化合物均具有納摩爾水平的MNKs抑制活性，且能抑制多種腫瘤細(xì)胞系中eIF4E的磷酸化。

4.4 Experimental Therapeutics Centre（ETC）

2013年，新加坡科技研究局（A*STAR）下屬Experimental Therapeutics Centre報(bào)道了一系列含有多種中心雙環(huán)骨架的雙環(huán)雜環(huán)衍生物，雙環(huán)結(jié)構(gòu)包括咪唑［1，2-a］吡嗪、咪唑［1，2-b］吡嗪、咪唑［1，2-a］吡啶、吡唑［1，5-a］嘧啶、咪唑［4，5-c］吡啶和苯［d］咪唑。這些化合物被鑒定為有效的MNKs抑制劑，其IC50達(dá)到了微摩爾和納摩爾水平。對這6種雙環(huán)骨架進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，可分為雙環(huán)核心、C-3取代基和C-6取代基3個(gè)部分（化合物12）。通過改變雙環(huán)核心并修飾C-3和C-6處的取代基，可以改善與MNK1/2的相互作用。雙環(huán)核心N-1與MNK1的Leu127殘基和MNK2的Met162殘基在激酶鉸鏈區(qū)的酰胺主鏈上分別形成一分子氫鍵，C-3取代基伸向疏水口袋，而C-6取代基占據(jù)了靠近ATP結(jié)合口袋的磷酸口袋?；衔?3（MNK1 IC50=0.79μmol/L，MNK2 IC50=0.52μmol/L）是咪唑并吡嗪類化合物，對MNKs的抑制能力中等，但不能抑制細(xì)胞中eIF4E磷酸化。將化合物13的乙酰胺替換為4-PhCONH2得到化合物14（MNK1 IC50=0.31μmol/L，MNK2 IC50=0.19μmol/L），其對MNKs的抑制活性提高了2~3倍，可能是由于Ser166的羰基和化合物側(cè)鏈羥基之間存在氫鍵。同時(shí)，化合物14可降低細(xì)胞內(nèi)eIF4E的磷酸化，并表現(xiàn)出良好的滲透性和體外ADME特性。當(dāng)化合物14的伯酰胺被較大的酰胺取代，如用嗎啉環(huán)取代，得到的化合物15（MNK1 IC50=0.13μmol/L，MNK2 IC50=0.11μmol/L）對MNKs的抑制活性進(jìn)一步提高，且具有更好的滲透性和溶解度。在C-3處進(jìn)一步的衍生化未能提高苯基取代基的效能，但與具有相似效能的類似物相比，苯甲腈的親脂性更低，并且顯示出更好的溶解性和滲透性。對雙環(huán)核心的研究表明，用咪唑［1，2-a］吡啶取代咪唑［1，2-a］吡嗪對MNK1的抑制活性提高了6~9倍，對MNK2的抑制活性提高了5~7倍［45］。在此研究基礎(chǔ)上得到了化合物ETC-206（MNK IC50=64 nmol/L，MNK2 IC50=86 nmol/L），并于2018年進(jìn)入Ⅰ期臨床研究，與達(dá)沙替尼聯(lián)用治療晚期血液瘤（圖5）。ETC-206在急變期慢性髓細(xì)胞白血?。˙C-CML）小鼠異種移植模型中表現(xiàn)出良好的生物利用度、安全性和耐受性，并可以顯著增強(qiáng)達(dá)沙替尼的抗腫瘤活性［46］。23名年齡在23~54歲之間的男性患者接受了單次給藥治療，沒有發(fā)生相關(guān)的不良反應(yīng)，并且eIF4E的磷酸化水平在給藥后24 h和30 h分別降低了28%和44%。ETC-206單獨(dú)或聯(lián)合用藥臨床方案的進(jìn)一步研究和討論相繼發(fā)表，對腫瘤藥物臨床方案的制定具有指導(dǎo)意義［47］。對與ETC-206具有相似骨架化合物的研究持續(xù)進(jìn)行，2019年，Experimental Therapeutics Centre公開了一類C-3處含有炔基取代基的化合物，代表化合物16，但它們對MNKs抑制活性的具體數(shù)據(jù)沒有公開［48］。

Figure 5 Cocrystal structure of compound ETC-206 in MNK2(PDB:6AC3)

2014年，Experimental Therapeutics Centre還報(bào)道了一類雜芳基炔烴衍生物作為MNKs抑制劑，其可與MNKs的非活性形式（DFD-out）可逆結(jié)合。代表化合物17。此類化合物可以降低HeLa細(xì)胞中eIF4E的磷酸化水平，抑制K562細(xì)胞的增殖［49］。2016年，又在已知的FLT3抑制劑AST-487（MNK1 IC50=1.76μmol/L，MNK2 IC50=20 nmol/L）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，開發(fā)并報(bào)道了一類聯(lián)芳基MNK/ABL1雙重抑制劑。在對AST-487的研究中發(fā)現(xiàn)，AST-487除了可以抑制MNKs外還能抑制其他多種激酶。因此，為了提高AST-487的激酶選擇性，同時(shí)保持對MNK1和MNK2的抑制作用，進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系分析和分子建模，進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到了化合物18（MNK1 IC50=2.5μmol/L，MNK2 IC50=16 nmol/L，ABL1 IC50=50 nmol/L），其顯示出良好的穩(wěn)定性，口服生物利用度為31%（圖6）。在K562異種移植模型中，化合物18以劑量依賴性的方式抑制腫瘤的生長，并且在100 mg/kg的給藥劑量下腫瘤完全消失。同時(shí)化合物18可以抑制K562細(xì)胞中eIF4E的磷酸化，并在給藥4 h后達(dá)到最高抑制率。在苯環(huán)上引入氟原子并將哌嗪環(huán)上的乙基替換為甲基后得到了化合物19（MNK1 IC50=0.2μmol/L，MNK2 IC50=10 nmol/L，ABL1 IC50=10 nmol/L），其對MNK1的抑制活性提高了12倍［50］。

Figure 6 Cocrystal structure of compound 18 in MNK2(PDB:6AC3)

4.5 eFFECTOR Therapeutics公司

2015年，eFFECTOR Therapeutics公司首次報(bào)道了具有吡啶酮-縮醛胺結(jié)構(gòu)的氨基嘧啶類MNKs抑制劑［51］。通過對MNKs晶體結(jié)構(gòu)的分析以及基于片段的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)化合物20（MNK1 IC50=0.69μmol/L）具有中等的MNK1抑制活性，其嘧啶環(huán)上的N-9與Met162上羰基氧形成一分子氫鍵，苯環(huán)與Phe159具有π-π相互作用。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾將苯甲酰胺通過環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為內(nèi)酰胺，并在內(nèi)酰胺環(huán)上引入兩個(gè)甲基形成sp3雜化迫使雙環(huán)體系形成180°夾角，得到了化合物21（MNK1 IC50=100 nmol/L，MNK2 IC50=61 nmol/L），其抑制活性相較于化合物20提高了近7倍。通過將苯環(huán)替換為吡啶酮結(jié)構(gòu)引入α，β-不飽和酰胺，得到了化合物22（MNK1 IC50=60 nmol/L，MNK2 IC50=57 nmol/L），其對MNKs的抑制活性基本保持但親脂性配體效率（LLE）和選擇性均大大提高。在吡啶酮環(huán)的5位引入取代基以增強(qiáng)吡啶酮與Phe159之間的π-π相互作用，化合物23（MNK1 IC50=10 nmol/L，MNK2 IC50=19 nmol/L）的激酶抑制活性和細(xì)胞活性均顯著提高。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吡啶酮5位的取代基為甲基時(shí)，化合物的動力學(xué)選擇性和效能提高之間處于最佳平衡狀態(tài)，因此甲基取代基被保留在進(jìn)一步的優(yōu)化和鑒定中。未取代的4-氨基嘧啶能夠維持與Met16之間的氫鍵并具有良好的理化性質(zhì)，并且在吡啶酮縮醛胺部分引入螺環(huán)結(jié)構(gòu)可以固定構(gòu)象?；谝陨涎芯拷Y(jié)果得到了化合物eFT-508（MNK1 IC50=2.4 nmol/L，MNK2 IC50=1 nmol/L），其在腫瘤生長抑制率（TGI）和藥代動力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）研究中都表現(xiàn)出優(yōu)異的性質(zhì)，且以劑量依賴的方式抑制MNKs的活性（圖7）。eFT508可以減少TMD-8細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNFα分泌，并降低這些細(xì)胞因子mRNA的穩(wěn)定性。此外，eFT-508不會影響MNK1/2上游信號通路的激活狀態(tài)。雖然eFT508在體外條件下對彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系僅表現(xiàn)出較弱的抑制活性敏感性（IC50介于1~10μmol/L之間），但在DLBCL細(xì)胞HBL-1和TMD-8異種移植模型中，口服給藥1 mg/kg就可以顯著抑制腫瘤的增殖，在乳腺癌細(xì)胞MDA-MD-231細(xì)胞的異種移植模型中也具有相似的抑制效果［52］。在MycTg；KrasG12D肝細(xì)胞癌模型的研究中，用eFT-508治療荷瘤小鼠會導(dǎo)致細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著增加。eFT508于2016年1月獲批進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，這是首個(gè)被批準(zhǔn)用于治療實(shí)體和血液惡性腫瘤的MNKs抑制劑。eFT-508目前正處在多個(gè)臨床Ⅱ期試驗(yàn)中，包括微衛(wèi)星穩(wěn)定的實(shí)體瘤和淋巴瘤。2017年3月，eFT508被FDA認(rèn)證為治療DLBCL的孤兒藥。Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，eFT508具有良好的生物利用度，體內(nèi)吸收速度快，tmax和t1/2分別為3和9.7 h，且藥物相關(guān)不良反應(yīng)較輕。給藥15 d后，病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中eIF4E的磷酸化水平降低了85%。eFFECTOR Therapeutics在隨后的2017－2020年公布了多篇eFT508結(jié)構(gòu)類似物的專利［53-57］，豐富了化合物的多樣性。

Figure 7 Cocrystal structure of compound eFT-508 in MNK2(PDB:6CK6)

4.6 Selvita S.A.公司

2014年，Selvita S.A.公司通過小分子激酶庫的篩選，報(bào)道了一類苯并氨基吡唑衍生物作為新型的選擇性ATP競爭性MNKs抑制劑，它們中大多可以在低納摩爾水平抑制MNK1和MNK2的活性。代表化合物SLV-2346（MNK1 IC50=10.8 nmol/L，MNK2 IC50=5.4 nmol/L）具有良好的選擇性，并且可以在白血病、乳腺癌和前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞系中有效抑制eIF4E的磷酸化，且無細(xì)胞毒性現(xiàn)象。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和結(jié)直腸癌模型中，SLV-2346可以抑制eIF4E的磷酸化并顯著減少腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［58］。在后續(xù)的研究中，SLV-2346作為高效、選擇性良好的工具化合物，在多種腫瘤細(xì)胞和異種移植模型中單獨(dú)給藥或者與靶向PI3K/mTOR或RAS/MEK途徑的抑制劑聯(lián)合使用都具有良好的抑制活性和藥代動力學(xué)性質(zhì)。例如，SLV-2346在急性髓性白血病（AML）模型中，可以顯著抑制AML細(xì)胞中的eIF4E磷酸化并減少細(xì)胞凋亡，此外還可以與5′-氮雜胞嘧啶核苷和雷帕霉素聯(lián)合使用在體外產(chǎn)生協(xié)同的抗白血病作用［59-60］。

4.7 其他類

近年來，具有多樣骨架結(jié)構(gòu)的MNKs抑制劑相繼得到報(bào)道，并且隨著對eFT508和ETC-206等化合物臨床研究的進(jìn)一步深入，國內(nèi)的研發(fā)機(jī)構(gòu)也在積極拓展具有相似骨架的化合物。南京天印健華醫(yī)藥科技有限公司在2018年公開了一系列氨基嘧啶類MNKs抑制劑，其中大多化合物都可以在低納摩爾水平抑制MNKs的活性，其中代表化合物24（MNK1 IC50=2.7 nmol/L）［61］。2020年6月，上海迪諾醫(yī)藥科技有限公司公開了一類縮醛胺環(huán)為六元環(huán)的化合物結(jié)構(gòu)，公開的化合物都具有良好的MNKs抑制作用，代表化合物25（MNK1 IC50=1.368 nmol/L，MNK2 IC50=1.194 nmol/L）和26（MNK1 IC50=0.949 nmol/L，MNK2 IC50=0.384 nmol/L）［62］。諾沃斯達(dá)藥業(yè)有限公司則將兩個(gè)雜環(huán)之間的亞氨基環(huán)合，公開了一類多環(huán)化合物的結(jié)構(gòu)，但其化合物對MNKs抑制活性的具體數(shù)據(jù)沒有給出，代表化合物27［63］。本課題組也積極探索開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎活性更優(yōu)的化合物，并在ETC-206結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化改造，于2020年公開了兩篇專利，報(bào)道了咪唑并噠嗪和咪唑并吡啶兩類化合物的結(jié)構(gòu)，其中優(yōu)選化合物對MNKs的抑制活性大大提高，并可以抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖以及降低eIF4E的磷酸化水平［64-65］。

5 總結(jié)與展望

近年來，隨著對MNKs在腫瘤的生長、增殖、凋亡和耐藥性中重要作用的深入研究，MNKs抑制劑的開發(fā)取得了重大進(jìn)展并顯示出初步的臨床效果，大量研究也揭示了MNKs在腫瘤免疫治療和免疫細(xì)胞中的重要作用。本文綜述了MNKs的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其與腫瘤的關(guān)系，并重點(diǎn)介紹了MNKs抑制劑的研究進(jìn)展。這些研究機(jī)構(gòu)在開發(fā)MNKs抑制劑方面的努力為進(jìn)一步設(shè)計(jì)新型MNKs抑制劑提供了指導(dǎo)。盡管目前尚無靶向MNKs的藥物上市，但作為調(diào)節(jié)mRNA翻譯的關(guān)鍵激酶，其抑制劑在減少腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和不良預(yù)后都發(fā)揮著重要的作用，還十分有望與包括CTLA-4和PD-1/PD-L1抑制劑在內(nèi)的免疫治療藥物聯(lián)合用藥以達(dá)到更好的治療效果。目前，除了幾個(gè)進(jìn)入臨床的化合物外，還有多個(gè)小分子化合物處于臨床前生物活性測試階段，給藥效果顯著?？傊?，靶向MNKs以及開發(fā)有效的MNKs抑制劑具有十分廣闊的發(fā)展前景。