陳 可，李翠翠，李 博，3*

（1中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京211198；2中國藥科大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)重點實驗室，南京211198；3中國藥科大學(xué)（杭州）創(chuàng)新藥物研究院，杭州310018）

目前，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析都是采用基于串聯(lián)質(zhì)譜的自下而上（bottom-up）的方法，對酶解的肽段進(jìn)行LC-MS分析，通過肽段的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定蛋白質(zhì)［1］。應(yīng)用中色譜共洗脫是多肽串聯(lián)質(zhì)譜鑒定中的常見問題，多達(dá)50%的肽段串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖中包含一個以上的肽［2］，所產(chǎn)生的豐富質(zhì)譜數(shù)據(jù)使得合理的解析變得困難：一方面碎片離子會受到母離子和共洗脫肽段碎片離子的干擾，增加了數(shù)據(jù)解析的難度；另一方面很多共洗脫多肽無法被鑒定。此外，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs）增加了蛋白質(zhì)及多肽的多樣性，對數(shù)據(jù)分析工作帶來了進(jìn)一步的挑戰(zhàn)。

多肽的色譜保留取決于色譜方法和多肽本身的性質(zhì)，而多肽的性質(zhì)在很大程度上是由它們的氨基酸序列決定的。因此在給定的色譜條件下，保留時間（retention time，RT）包含了多肽序列的信息［3-5］。多肽保留時間預(yù)測是將多肽色譜保留行為轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定獨立的特征時間屬性，作為蛋白質(zhì)組學(xué)中輔助和驗證指標(biāo)，增加靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的覆蓋率［6］，或為數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent acquisition，DIA）樣品提供輔助信息，提高譜圖匹配的準(zhǔn)確性［12，34］。

本文對未修飾多肽和修飾多肽保留時間預(yù)測的各類方法進(jìn)行了綜述，對各方法原理、模型、特點及其在蛋白質(zhì)定性及定量中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，討論了這些方法在蛋白質(zhì)組學(xué)中預(yù)測完整蛋白質(zhì)的可行性和準(zhǔn)確性，并對多肽保留時間預(yù)測方法的發(fā)展方向及其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

1 未修飾肽段的保留時間預(yù)測方法

為了充分利用色譜保留數(shù)據(jù)，已有眾多多肽保留時間預(yù)測方法，見圖1。這些方法大致可以分為4類：基于多肽物理/化學(xué)信息的多肽分子模型法；基于標(biāo)準(zhǔn)肽數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化索引法；基于每個氨基酸殘基貢獻(xiàn)的氨基酸殘基參數(shù)法；基于大數(shù)據(jù)分析的機(jī)器學(xué)習(xí)法等。

Figure 1 Four methods of peptide retention prediction:each figure illustrates the principles and characteristics of this four different methods

1.1 多肽分子模型法

在給定的色譜條件下，特定多肽的RT應(yīng)該是恒定的，因此RT是化學(xué)結(jié)構(gòu)依賴性參數(shù)。多肽分子模型法是通過多肽的物理化學(xué)性質(zhì)即肽的結(jié)構(gòu)信息或它們在分離期間的化學(xué)相互作用的信息實現(xiàn)多肽保留時間預(yù)測。分子模型方法偏向于對大分子進(jìn)行物理建模，輔之以氨基酸殘基的貢獻(xiàn)總和進(jìn)行預(yù)測，方法簡便，但缺失了一些影響色譜保留的因素。

1.1.1 定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系(quantitative structure retention relationship，QSRR) Kaliszan等［7］開發(fā)的基于QSRR的方法使用軟件計算肽序列的一系列化學(xué)特征：氨基酸殘基保留時間總和的對數(shù)lgSumAA，多肽的范德瓦爾（Van der Waals，VDW）體積的對數(shù)lg VDWVol，多肽的計算正辛醇-水分配系數(shù)的對數(shù)clg P。通過多元回歸分析將其組合成預(yù)測函數(shù)，用于多肽的保留時間預(yù)測。

Le Maux等［8］則以表觀親水性、氨基酸在序列中位置、肽序列長度三者之間的函數(shù)關(guān)系，建立RT預(yù)測模型。該方法可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測未知短肽的氨基酸序列以及區(qū)分同源肽的保留時間。

1.1.2 臨界條件生物大分子液相色譜法(liquid chromatography of biological macromolecules under critical conditions，BioLCCC) BioLCCC基于高分子統(tǒng)計物理學(xué)方法，利用肽鏈的隨機(jī)游動模型及多肽分子在吸附劑孔內(nèi)的空間構(gòu)象對色譜分離過程進(jìn)行建模，同時考慮吸附劑孔內(nèi)的肽的熵和能量補(bǔ)償以，及多肽和固定相之間的有效相互作用能等因素［9］。BioLCCC模型的優(yōu)勢在于可模擬等度或梯度條件下多肽在色譜柱上的吸附分配過程，并能直接計算出給定溶劑組成條件下多肽的保留因子［10］。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)化索引法

標(biāo)準(zhǔn)化索引法是利用一組標(biāo)準(zhǔn)肽的保留時間建立數(shù)據(jù)庫，把這些數(shù)值作為其他待測肽的RT預(yù)測的基礎(chǔ)和標(biāo)準(zhǔn)。這樣的標(biāo)準(zhǔn)肽覆蓋不同的疏水性并且易于用MS檢測。只需要進(jìn)行一組標(biāo)準(zhǔn)肽的校正實驗，就可以在后續(xù)所有不同條件的實驗分析中使用其RT信息，進(jìn)而改善了由于色譜系統(tǒng)差異導(dǎo)致RT數(shù)值差異很大的問題。

1.2.1 索引保留時間(indexed retention time，i RT) iRT首先由Escher等［3］提出，iRT量表的標(biāo)準(zhǔn)肽由11種不同于任何一個已知天然序列的肽構(gòu)成。這是一個開放，便攜和標(biāo)準(zhǔn)化的保留時間量表，它的采集窗口小，量化精度高，從而增加了LC-MS的通量和質(zhì)量。目標(biāo)多肽的RT是相對于標(biāo)準(zhǔn)iRT-肽的固定數(shù)值，可以跨實驗室和色譜系統(tǒng)轉(zhuǎn)移［11］。i RT精度與識別數(shù)量之間存在顯著的相關(guān)性。

與多肽分子模型法相比，iRT的一系列方法應(yīng)用更廣泛，大大提高了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析的檢出率和準(zhǔn)確性。但由于iRT肽數(shù)量非常有限，主要用于線性梯度條件，其精度有限。

1.2.2 高精度i RT(high-precision iRT) 為了使i RT具有更高的精度，Bruderer等［12］將iRT肽擴(kuò)展到數(shù)千個，利用穩(wěn)健的分段回歸實現(xiàn)iRT和RT間的相互轉(zhuǎn)換。這種高精度iRT算法能增加靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中15%的定量信息。高精度i RT的預(yù)測結(jié)果雖然能一定程度上不為色譜條件所轉(zhuǎn)移，但仍需要避免操作中流動相中酸的種類及濃度變化帶來的影響。

1.3 氨基酸殘基參數(shù)法：從加性到序列特異性

基于殘基參數(shù)的方法最初旨在預(yù)測肽段序列中每個氨基酸殘基對整條肽的RT的影響。氨基酸殘基的個體貢獻(xiàn)通常被稱為保留系數(shù)（retention coefficients，RC），那么整個肽的保留就是各個貢獻(xiàn)的總和（一組RC）。在給定的色譜條件下，可以通過簡單地總結(jié)（累加）組成肽的氨基酸殘基的RC來估計肽的RT，這便是加性模型（additive model）。

1.3.1 加性模型 該方法最早的實例是使用一組25個短肽（胰高血糖素、生長抑素等）以及它們觀察到的RT來得到序列中存在的每個氨基酸殘基的保留系數(shù)［13］。使用HP 9815A計算器計算RC，并僅使用肽的氨基酸組成進(jìn)行預(yù)測，而未涉及到序列中每個氨基酸的位置、空間或構(gòu)象的任何信息。

隨后的研究表明［14］，早期的加性模型有很大的局限性，在新的色譜條件下RC需要進(jìn)行重新校準(zhǔn)；對含有50個殘基的多肽需要引入肽鏈長度校正參數(shù)。因為即使是對于短肽，當(dāng)相鄰氨基酸殘基不同或末端基團(tuán)理化性質(zhì)不同時，也可獲得不同的RC［15-16］。但在這樣的情況下，加性模型仍無法準(zhǔn)確闡明吸附色譜法中肽保留的所有特征。只有非常小的肽（2~4個氨基酸殘基）和沒有任何二級結(jié)構(gòu)才有助于實現(xiàn)加性模型的高預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.3.2 序列特異性模型 在加性模型的基礎(chǔ)研究上，Krokhin等［4］開發(fā)了序列特異性保留計算器（sequence-specific retention calculator，SSRCalc），該算法的第1個版本使用離線HPLC-MALDI MS收集了346個胰蛋白酶肽的數(shù)據(jù)集，在加性模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行校正，產(chǎn)生了兩組氨基酸殘基RC（一組對應(yīng)于N-末端和一組對應(yīng)于所有其他位置）和兩組校正因子（肽長度和總疏水性）。

該算法的第2個版本便將數(shù)據(jù)集擴(kuò)大至2 000，除了引入短肽的氨基酸殘基的單獨RC，還校正了等電點、帶電肽的最近鄰效應(yīng)和形成螺旋結(jié)構(gòu)的傾向（脯氨酸重復(fù)）。在此基礎(chǔ)上，Eluta‐tor［2］不僅限于最近鄰，進(jìn)一步考慮了氨基殘基的鄰近效應(yīng)。因為即使對于肽鏈中多個位置分隔開的殘基，其相互作用也具有統(tǒng)計學(xué)意義。

基于參數(shù)的方法的局限性就在于它們通常被優(yōu)化用于預(yù)測特定色譜系統(tǒng)的保留時間。Dwivedi等［17］開發(fā)了二維LC系統(tǒng)的多肽保留預(yù)測算法。其使用了廣泛的離子對和pH條件，RP（pH 10~pH 2）2D HPLC-ESI/MS系統(tǒng)提供了更高的一維分離效率，并增加了識別多肽的數(shù)量（約10 000個胰蛋白酶肽）。在約280 000個胰蛋白酶肽的數(shù)據(jù)集分析中，發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈具有N帽誘導(dǎo)的兩親性螺旋肽與C18吸附劑的疏水作用占主導(dǎo)地位，其保留比預(yù)期更強(qiáng)［18］。于是便將描述肽的兩親性螺旋性特征（富含丙氨酸）和N帽穩(wěn)定性基序（N-帽附近的N1和N2位有疏水殘基天冬氨酸等）結(jié)合到SSRCalc中［19］。

在親水相互作用液相色譜（hydrophilic interac‐tion liquid chromatography，HILIC）系統(tǒng)中，攜帶N帽螺旋穩(wěn)定基序和兩親性高螺旋的肽保留比預(yù)測值偏低，這是因為肽骨架上的親水性羰基和酰胺基團(tuán)與螺旋結(jié)構(gòu)間發(fā)生氫鍵穩(wěn)定，它決定了HILIC中獨特的肽的序列依賴性行為［20］。

另一種基于SSRCalc的肽保留預(yù)測模型陽離子交換（strong cation exchange，SCX）系統(tǒng)的肽段分離和預(yù)測機(jī)制則是基于庫侖定律驅(qū)動的肽在離子交換色譜中的靜電相互作用［21］。肽的電荷越大，庫侖相互作用越強(qiáng)，保留也就越強(qiáng)，堿性殘基會增加肽的N末端附近的保留，酸性氨基酸則相反，疏水性氨基酸也表現(xiàn)出較低的保留系數(shù)。這決定了SCX中獨特的肽的序列依賴性行為。

由此也能看出，對于不同的實驗條件，它們的預(yù)測結(jié)果力就會發(fā)生偏差，需要引入特定的參數(shù)進(jìn)行校正才能獲得良好的相關(guān)性。SSRCalc是目前使用最廣泛的基于參數(shù)的保留時間預(yù)測器，可以說是該領(lǐng)域的基準(zhǔn)工具，也是最準(zhǔn)確的保留時間預(yù)測模型之一。在肽的電荷、長度、疏水性、二級結(jié)構(gòu)、螺旋結(jié)構(gòu)，氨基酸的個體保留和相對于肽末端的位置乃至不同色譜系統(tǒng)等方面的優(yōu)化，SSRCalc已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。

1.4 機(jī)器學(xué)習(xí)法

利用人工智能的機(jī)器學(xué)習(xí)法也被用于多肽保留時間預(yù)測。方法利用計算機(jī)算法從已知的輸入數(shù)據(jù)中獲得信息，輸出數(shù)值，進(jìn)行訓(xùn)練。根據(jù)訓(xùn)練中獲得的輸入輸出數(shù)據(jù)建立已知參數(shù)模型，對目標(biāo)肽段的RT進(jìn)行預(yù)測?；跈C(jī)器學(xué)習(xí)的RT預(yù)測方法可以分為兩大類：傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法和深度學(xué)習(xí)方法。機(jī)器學(xué)習(xí)方法又分為兩個子類：一類為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks，ANN）［22-23］，另一類是支持向量回歸（support vector regression，SVR）算法［5，24］。

1.4.1 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)最初ANN以20個氨基酸殘基的組成為基礎(chǔ)，由20個輸入節(jié)點、2個隱含節(jié)點和1個輸出節(jié)點組成［22］。使用約7 000個已知RT的訓(xùn)練肽進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，并利用來自于另一微生物種的約5 200個肽（多達(dá)54個氨基酸殘基）進(jìn)行鑒定評估，結(jié)合遺傳算法優(yōu)化線性方程系數(shù)以進(jìn)行時間和梯度斜率校正，將肽保留數(shù)據(jù)歸一化到一定個范圍（0~1），從而將肽RT的重現(xiàn)性誤差縮小至1%。在后續(xù)對該方法的改進(jìn)中采用由1 052個輸入節(jié)點、24個隱含節(jié)點和1個輸出節(jié)點組成的ANN結(jié)構(gòu)，同時編碼了氨基酸位置，肽長度和疏水性，最近鄰氨基酸以及肽的二級結(jié)構(gòu)（螺旋、片狀、卷曲）等描述符［25］。使用20多種不同生物中的約345 000個已識別肽來訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)過訓(xùn)練得出了比優(yōu)化前更好的1 303個肽的預(yù)測準(zhǔn)確度。該算法的主要限制因素在于需要大量的訓(xùn)練肽，這使得其難以適用于其他色譜條件。

1.4.2 支持向量回歸(SVR) 為了達(dá)到使用較少的訓(xùn)練肽的同時也能適應(yīng)不同的色譜條件，Moruz等［5］開發(fā)了一個基于SVR的RT預(yù)測算法Elude。Elude參數(shù)化了約60個氨基酸特征：氨基酸組成、肽長度、末端殘基類型、高度帶電的氨基酸殘基、最近鄰效應(yīng)、疏水性（平均疏水性，N和C末端疏水性，最多或最少疏水性氨基酸的出現(xiàn)次數(shù)）、二級結(jié)構(gòu)等。方法主要特點在于：在有足夠訓(xùn)練肽數(shù)據(jù)的情況下，Elude直接構(gòu)建一組線性保留指數(shù)，計算肽特征并使用SVR進(jìn)行最佳組合，從而達(dá)到預(yù)測保留時間的目的。如果沒有足夠數(shù)據(jù)，Elude先運(yùn)行少量對照肽，再從庫中選擇最合適（預(yù)測RT和觀察RT的相關(guān)性最高）的模型并將其校準(zhǔn)。使用對異常值處理比Pearson相關(guān)系數(shù)更穩(wěn)健的FAST-最小修整平方（FAST-least trimmed squares，F(xiàn)AST-LTS）回歸方法進(jìn)行選擇和校準(zhǔn)。這種方案確保了該算法可以應(yīng)用于不同的色譜條件，并保證了最小性能損失。

在此基礎(chǔ)上又衍生出來許多SVR組合算法預(yù)測模型。串并行支持向量機(jī)（serial and parallel support vector machine，SP-SVM）包含一個僅用于模型訓(xùn)練的SVR（p-SVR）和4個用于RT預(yù)測的SVM（C-SVM、1-SVR、s-SVR和n-SVR）［26］。其中，C-SVM計算肽色譜行為特征，1-SVR和s-SVR進(jìn)行目標(biāo)肽段RT預(yù)測，n-SVR對肽RT歸一化，以表征多肽之間的相互作用，進(jìn)一步提高了其預(yù)測準(zhǔn)確度和性能。

不確定性可以公式化為目標(biāo)樣本與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集之間的關(guān)系，所以掌握了這樣的預(yù)測策略之后，GPTime便將SVR替代為高斯計算過程（Gaussian Processes，GP），以同樣的選擇－訓(xùn)練－校準(zhǔn)－計算模式，證明了GP與SVR同等的準(zhǔn)確性，同時提供了預(yù)測RT的不確定性估計［27］。

Lu等［28］從新的角度出發(fā)，提出了一個基因座特異性保留預(yù)測因子（locus-specific retention pre‐dictor，LsRP），它新穎地將氨基酸基因座信息與SVR算法結(jié)合。將每個肽序列轉(zhuǎn)化為由0和1組成的特征基因座載體，使基因座載體和肽序列之間保持一對一的對應(yīng)關(guān)系，再進(jìn)行SVR訓(xùn)練和評估。LsRP最終提供了0.95~0.99的預(yù)測相關(guān)系數(shù)。

1.4.3 深度學(xué)習(xí) 深度學(xué)習(xí)可以自動從龐大數(shù)據(jù)中有效解讀復(fù)雜關(guān)系并學(xué)習(xí)特征和模式，無需進(jìn)行人工特征設(shè)計，因此特別適合大型的復(fù)雜數(shù)據(jù)集的科學(xué)領(lǐng)域?；谏疃葘W(xué)習(xí)的算法大致分為3類：遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（recurrent neural network，RNN）、卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neural networks，CNN）和混合網(wǎng)絡(luò)，其中RNN是最主要的網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)。

Prosit是RNN的代表性算法［29］，由一個編碼器和一個解碼器組成。編碼器將肽序列編碼為離散整數(shù)向量（每個氨基酸殘基長度為20）的表示形式，而解碼器則對該表示形式進(jìn)行解碼，預(yù)測RT。編碼器由一個嵌入層，一個BiGRU層，一個遞歸GRU層和一個關(guān)注層組成［30］。解碼器將序列的表示形式連接到密集層從而進(jìn)行預(yù)測。同樣基于RNN架構(gòu)的DeepMass則使用一鍵編碼，其網(wǎng)絡(luò)包括一個BiLSTM層、一個LSTM層，兩個致密層［31］。GuanMCP2019［32］則使用了一個屏蔽層、兩個BiL‐STM層、一個LSTM層，兩個致密層。與SSRCalc和Elude比較，這幾種算法都顯示出優(yōu)異的性能，對RT的預(yù)測可以達(dá)到接近1的相關(guān)性。

CNN包含卷積層和池化層，可在不同的空間尺度上提取序列特征。Ma等［33］提出DeepRT，是CNN和RNN的混合網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，其預(yù)測程序是：在特征自主學(xué)習(xí)（CNN層和LSTM層）之后，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）進(jìn)行降維，然后利用3種常規(guī)機(jī)器學(xué)習(xí)方法（SVR，隨機(jī)森林（random forest，RF），梯度提升（gradient boosting，GB））進(jìn)行建模。Deep DIA［34］和Auto RT［35］都是這樣的混合架構(gòu)，區(qū)別是二者的RNN層分別為BiLSTM和GRU。值得一提的是，AutoRT有兩個獨特功能：其一是通過遺傳算法實現(xiàn)自動深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)體系架構(gòu)搜索（network architecture search，NAS），從而識別出10個最匹配的模型進(jìn)行組合預(yù)測；另一個就是轉(zhuǎn)移學(xué)習(xí)，轉(zhuǎn)移學(xué)習(xí)的特點是大型公共數(shù)據(jù)集的使用。使用大型公共數(shù)據(jù)集（約174 182條肽）對基礎(chǔ)模型進(jìn)行訓(xùn)練，然后用少量目標(biāo)數(shù)據(jù)對基礎(chǔ)模型進(jìn)行微校準(zhǔn)以適用于特定的實驗條件。有這樣的公共數(shù)據(jù)集在，即使實驗數(shù)據(jù)量只有幾百條也能夠得到獲得高度準(zhǔn)確的模型。

對于較小的數(shù)據(jù)集，傳統(tǒng)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法通常優(yōu)于深度學(xué)習(xí)方法，但是隨著訓(xùn)練集的增多，深度學(xué)習(xí)方法的優(yōu)勢便逐漸顯現(xiàn)，性能也大大優(yōu)于機(jī)器學(xué)習(xí)［36］。

2 具有翻譯后修飾多肽的保留時間預(yù)測

PTM能夠改變蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)、疏水性、空間結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，最終影響其與受體等的相互作用及功能。目前已發(fā)現(xiàn)300多種不同的PTM，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙?；Ⅳ然?、糖基化以及二硫鍵的配對等［37］。PTM引起的肽RT的變化取決于修飾類型和數(shù)量，發(fā)生修飾的氨基酸殘基種類及其在序列中的位置。

2.1 特定PTM修飾

目前有很多研究在開發(fā)適用于PTM肽的RT預(yù)測，大多是在已有模型基礎(chǔ)上引入修飾的氨基酸殘基的模型參數(shù)（RC，疏水性等）來進(jìn)行預(yù)測。如Reimer［38］引入不同的幾組修飾肽的保留數(shù)據(jù)，建立一種序列依賴性的方法來預(yù)測N端烷基化修飾的肽段。烷基化修飾使N末端殘基的疏水性增加，表現(xiàn)出更強(qiáng)的保留。同時洗脫條件的變化對保留時間后移的影響也更為明顯。

BioLCCC的拓展模型可以預(yù)測具有磷酸化修飾的肽［39］，天冬酰胺脫酰胺化修飾和天冬氨酸異構(gòu)化修飾的肽［40］。當(dāng)C18柱與醋酸、甲酸（formic acid，F(xiàn)A）、或三氟乙酸（trifluoroacetate，TFA）等離子對試劑使用時，磷酸肽通常比它們的未磷酸化對應(yīng)物表現(xiàn)出更強(qiáng)的保留，而當(dāng)使用疏水性較小的固定相（如C4-硅膠柱）時，保留順序逆轉(zhuǎn)［41］。色譜條件的改變?nèi)鏡P C18固定相的離子對試劑可能會影響其分離的選擇性及預(yù)測準(zhǔn)確性，用FA代替TFA則需要重新校準(zhǔn)模型參數(shù)。未來的算法研究無疑需在流動相極性的影響上進(jìn)行更多的探索。

2.2 任意PTM修飾

Elude 2.0［42］能夠適用于任意PTM，前提是需要足夠的數(shù)據(jù)來解釋每種修飾氨基酸的特性。為了將其功能擴(kuò)展到修飾肽，刪除了疏水性指數(shù)Kyte-Doolittle，修改并添加了部分描述符，如25%最低和最高RC的發(fā)生次數(shù)/連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)等。在RPLC-FA系統(tǒng)中，乙?；⒍□；捅；揎椀碾耐ǔＴ谖葱揎楇闹笙疵摚琢虬彼?、蛋氨酸氧化修飾的肽在未修飾肽之前洗脫。Elude2.0對修飾和未修飾的肽具有同樣優(yōu)異的預(yù)測性能，所有數(shù)據(jù)集的預(yù)測和實驗RT之間的相關(guān)系數(shù)為0.93~0.98。由于未知肽段序列的每一個位點都可能存在修飾且會導(dǎo)致保留行為的差異，因此，為了準(zhǔn)確擴(kuò)展模型，需要在統(tǒng)計上大批量地、可靠地識別并數(shù)據(jù)化目標(biāo)修飾肽段的RT。

在深度學(xué)習(xí)方法中，大多數(shù)模型采用的一鍵編碼氨基酸的形式限制了PTM肽段的適用性［43］。DeepLC［44］是唯一可以預(yù)測修飾多肽RT的模型，甚至是訓(xùn)練集中不存在的修飾類型。DeepLC采用CNN架構(gòu)，每種肽被編碼為矩陣來計算其原子組成，對于含修飾氨基酸的多肽，修飾的原子組成直接加到未修飾殘基的原子組成上。這種編碼使模型能夠?qū)W習(xí)并歸納未知的修飾肽段?？紤]到異構(gòu)體的存在，除此編碼外，還編碼了位置特定信息和全局特征信息，這使得Deep LC預(yù)測修飾肽段（尤其是酰基修飾）和未修飾肽段的RT準(zhǔn)確度相當(dāng)。在20個數(shù)據(jù)集中（SWATH Library29，HeLa HF30和DIA HF31等），Pearson相關(guān)系數(shù)都能達(dá)到0.99。但DeepLC對具有復(fù)雜修飾（磷酸化或異構(gòu)化）的肽段進(jìn)行RT預(yù)測還是較為困難，準(zhǔn)確度較低，需要一些與復(fù)雜修飾相關(guān)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)才能進(jìn)一步提高性能。

3 應(yīng)用

在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中，保留時間預(yù)測模型可以潛在地幫助生成數(shù)據(jù)采集的參考列表，實現(xiàn)更多的蛋白質(zhì)同時定量。在bottom-up蛋白質(zhì)組學(xué)中，這些模型主要用于在數(shù)據(jù)庫搜索過程中，作為肽匹配圖譜（peptide-spectrum matches，PSM）的額外驗證標(biāo)準(zhǔn)。近年來，越來越多的研究將多肽RT預(yù)測模型集成到蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析工作流程中。這些不同原理的方法已大量應(yīng)用于數(shù)據(jù)依賴采集（data dependent acquisition，DDA）靶向蛋白質(zhì)組學(xué)實驗、DIA蛋白質(zhì)組學(xué)實驗和完整蛋白質(zhì)RT預(yù)測的綜合模型開發(fā)中。

3.1 靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的肽保留時間預(yù)測

對于靶向蛋白質(zhì)組學(xué)中關(guān)鍵的第一步“方法開發(fā)建立”，預(yù)測的RT已用于減少分析靶標(biāo)所需的實驗次數(shù)。采集窗口越小，便可以在不損害數(shù)據(jù)質(zhì)量的情況下靶向更多的肽。復(fù)雜的背景可能導(dǎo)致選擇反應(yīng)監(jiān)測（selected reaction monitoring，SRM）測量結(jié)果的模糊性，因為樣品中可能存在具有與目標(biāo)肽段類似的干擾肽。在DDA中，Prosit［29］包含來自于576 256個母離子的21 764 501高質(zhì)量譜圖，覆蓋98.5%的人類基因。使用預(yù)測得到的準(zhǔn)確的RT和二級譜進(jìn)行匹配打分，大大提高了對靶向肽段的檢出能力（增加20%）。類似的還有基于SSRCalc的軟件應(yīng)用，簡化了質(zhì)譜儀方法的開發(fā)流程［45］，可測量釀酒酵母中MS可觀察到的所有蛋白質(zhì)（100%）［46］。隨著色譜柱的變化或儀器中歸一化碰撞能量（normalized collision energy，NCE）調(diào)諧漂移，基于DDA的譜庫會隨著時間的流逝而變得過時。

3.2 DIA蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的肽保留時間預(yù)測

二級譜是混合譜，DIA的數(shù)據(jù)來源于很多肽段，而且碎片離子還會受到未碎裂的母離子的干擾，在短色譜梯度與復(fù)雜樣品同時出現(xiàn)的情況下，干擾會進(jìn)一步被放大。在沒有碎片譜圖提供的高可信度數(shù)據(jù)的情況下，可以將觀察到的肽段RT和未碎片化的質(zhì)量用作肽段鑒定的附加信息，過濾錯誤識別的代謝產(chǎn)物。這些預(yù)測算法的優(yōu)勢在于可以確保庫始終是最新的，甚至可以考慮不同儀器平臺之間的差異。DIA方法思路大致為，使用相似樣品來源（如釀酒酵母蛋白質(zhì)）數(shù)據(jù)庫及Prosit14輔助生成RT預(yù)測的譜庫（320 150個獨特的肽序列），經(jīng)過經(jīng)驗校正（6次氣相分餾DIA進(jìn)樣），新庫包含來自4 464個蛋白質(zhì)組的64 597個肽序列［47］。肽和蛋白質(zhì)的FDR為1%。每種肽采集后從庫中選擇得分最高的電荷狀態(tài)，刪除其他得分較低的電荷狀態(tài)。然后，對于每個鑒定出的肽，計算所有碎片離子的總峰形，并提取與該形狀相關(guān)的所有可能的b型或y型離子的碎片峰面積強(qiáng)度進(jìn)行定量。

高精度iRT［12］能夠?qū)崿F(xiàn)在很多不同色譜系統(tǒng)下，將肽段保留時間特征轉(zhuǎn)換成精確可預(yù)測的時間信息，從而高精度地預(yù)測肽段RT，實現(xiàn)更多蛋白質(zhì)的同時定量（增加25%）。只需一次靶標(biāo)肽段的校正實驗，形成新的iRT計算器，就可計算該色譜系統(tǒng)下的待測肽段的保留時間預(yù)測值。隨后便可利用得到的所有待測肽段的預(yù)測RT，設(shè)計適合的梯度靶向分析方法，提高更多峰鑒定的可靠性。Klammer等［24］基于SVR算法對釀酒酵母細(xì)胞裂解物的檢出率增加了50%，F(xiàn)DR降低至3%。Moruz等［48］基于Elude算法分別在酵母和人類的兩個三重數(shù)據(jù)集上進(jìn)行了評估，在FDR為1%的情況下，蛋白質(zhì)的鑒定檢出率多出了7%。目前在DIA中，較有前景和應(yīng)用空間的是深度學(xué)習(xí)算法，在此類模型中，可從經(jīng)驗示例中了解肽序列（或衍生自該序列的特征）與LC保留時間頂點之間的映射。Prosit［29］可以直接用于DIA的建庫（FDR=1%）。DeepDIA［34］構(gòu)建了計算機(jī)模擬血漿/血清蛋白質(zhì)組庫，平均檢測到的蛋白質(zhì)組超過400個，是從相同數(shù)據(jù)中基于最新DDA庫檢測到的蛋白質(zhì)組的兩倍。DIA-NN［49］可通過短色譜梯度實現(xiàn)可靠的鑒定和深度蛋白質(zhì)組學(xué)覆蓋。其基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行量化和干擾校正，來區(qū)分真實信號和噪聲。使用iRT進(jìn)行保留時間校準(zhǔn)，同時自動執(zhí)行質(zhì)量校正。在考慮0.5%FDR進(jìn)行采集的情況下，比基于SSRCalc的方法識別出K562人細(xì)胞系全細(xì)胞胰蛋白酶消化物更多的前體肽段（約35 000個）。

3.3 完整蛋白的保留時間預(yù)測

豐富的多肽保留預(yù)測模型的經(jīng)驗?zāi)軌驊?yīng)用在完整蛋白質(zhì)的RT預(yù)測上，當(dāng)然也更具挑戰(zhàn)性。Bio LCCC，基于高分子統(tǒng)計物理學(xué)方法，把吸附劑孔內(nèi)的所有多肽鏈分子的可能構(gòu)型都考慮在內(nèi)，對于完整蛋白質(zhì)的RT預(yù)測有良好的可行性。研究表明，BioLCCC模型在12個完整蛋白質(zhì)［50］和52個完整蛋白質(zhì)［51］（氨基酸殘基數(shù)多達(dá)583）的數(shù)據(jù)集中，實驗RT和預(yù)測RT之間的相關(guān)性可達(dá)到0.89和0.90。但該方法的不足之處就在于其針對的是鏈狀結(jié)構(gòu)，對于含二級三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)來說，相關(guān)性有待進(jìn)一步提高。不局限于RPLC，Xu等［52］使用偏最小二乘回歸將模型蛋白質(zhì)的等電點，相對分子質(zhì)量和水兩相分配系數(shù)與陽離子交換色譜（ion-exchange chromatography，IEC）的RT相關(guān)聯(lián)。對9種蛋白質(zhì)進(jìn)行訓(xùn)練時獲得0.91的線性相關(guān)性。此外，疏水相互作用色譜（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是蛋白質(zhì)分離純化的關(guān)鍵技術(shù)。Chen等［53］生成了基于SVM方法的定量結(jié)構(gòu)特性關(guān)系（quantitative structure property relationship，QSPR）模型，使用氨基酸組成來估算有效的蛋白質(zhì)疏水性，用于預(yù)測模型中未包含的蛋白質(zhì)的等度及進(jìn)一步的線性梯度保留參數(shù)。對于20個蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集，實驗RT和預(yù)測RT之間的相關(guān)性可達(dá)到0.97。而定量結(jié)構(gòu)活性關(guān)系（quantitative structure activity relationship，QSAR）則使用同源性建模和分子動力學(xué)模擬來生成單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）的3D結(jié)構(gòu)，然后從中計算結(jié)構(gòu)描述符以預(yù)測mAbs的HIC保留時間［54］。

4 總結(jié)與展望

在基于LC-MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)中，保留時間對多肽鑒定及定量的準(zhǔn)確性、完整性和深入性起到重要作用。與基于多肽分子模型的方法相比，索引及序列特異性模型的應(yīng)用性更廣泛，但其預(yù)測能力仍受限于色譜條件。隨著研究的不斷深入，在更多數(shù)據(jù)集、更多未知肽段及蛋白面前，通過訓(xùn)練深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)建專屬于每一臺儀器的網(wǎng)絡(luò)模型或組合模型，采集時間可以從幾天大大縮短至幾小時。PTM修飾肽的保留模型的發(fā)展未來集中在，在訓(xùn)練集中無已知修飾類型的參數(shù)的前提下，優(yōu)化由空間結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的修飾這一方面的數(shù)據(jù)。在多肽RT預(yù)測領(lǐng)域，仍需進(jìn)一步提高模型的準(zhǔn)確性，建立統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，開發(fā)更具普適性的算法，使RT預(yù)測真正成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要手段之一。