于澤萱，鞠曹云，張 燦

（中國(guó)藥科大學(xué)高端藥物制劑與材料研究中心，南京210009）

樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是一類(lèi)專(zhuān)職的抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC），也是整個(gè)腫瘤免疫過(guò)程中開(kāi)啟免疫反應(yīng)的始動(dòng)細(xì)胞，在抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。未成熟DC在攝取抗原后可分化為成熟的DC，并通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體（MHC I類(lèi)或MHC II類(lèi)）將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞；接受抗原遞呈的T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）發(fā)揮腫瘤殺傷作用。鑒于此，越來(lái)越多的研究者開(kāi)始研發(fā)DC腫瘤疫苗，將體外誘導(dǎo)或構(gòu)建的可特異性識(shí)別腫瘤的DC細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，在體內(nèi)將抗原呈遞并激活T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤免疫作用［2］。DC腫瘤疫苗在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和延長(zhǎng)患者生存期方面具有良好的有效性，已有幾款DC疫苗進(jìn)入臨床研究，用于前列腺癌、腎癌與膠質(zhì)瘤的治療［3-5］。盡管DC腫瘤疫苗有著諸多優(yōu)勢(shì)，但其客觀臨床響應(yīng)率仍有待提高［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道［7］，由于DC在成熟過(guò)程中不斷受到體內(nèi)外細(xì)胞因子的刺激，促使DC反饋性表達(dá)免疫抑制因子，從而影響DC誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，這是造成DC腫瘤疫苗響應(yīng)率不足的主要原因之一。如細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）是一類(lèi)由DC產(chǎn)生并反饋性阻斷細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其能夠阻礙DC的抗原呈遞以及分泌促炎因子的能力，從而影響DC在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)［8-9］。因此，抑制DC生成的免疫抑制因子如SOCS1的表達(dá)，是提高DC效力的有效策略之一。

小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是一種20~25 bp的雙鏈RNA，當(dāng)其入胞后能夠選擇性降解特定mRNA，沉默特定基因表達(dá)并阻止蛋白翻譯［10］，是一種安全性高、免疫原性低、特異性好的基因沉默藥物［11-12］。因此利用siRNA特異性抑制DC生成的免疫抑制基因可能是解決目前DC治療瓶頸的有效方式。但是由于siRNA是親水性的負(fù)電性大分子，很難跨過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)胞質(zhì)；即使成功被細(xì)胞攝取后，也易被溶酶體中的核酸酶降解；必須通過(guò)載體遞送才能將其有效遞送至靶細(xì)胞胞質(zhì)進(jìn)而提高基因沉默效率。并且，原代DC易受遞送材料影響產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)以及細(xì)胞毒性［13］，對(duì)遞送載體的要求更為嚴(yán)格。

脂質(zhì)體是一種理想、安全的藥物載體，其具有類(lèi)似于細(xì)胞質(zhì)膜的脂質(zhì)雙層［14］，具有較好的細(xì)胞親和力、生物相容性和低免疫原性［15-16］，并且具有基因荷載量大的優(yōu)勢(shì)［17］。但目前脂質(zhì)體應(yīng)用于原代免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率還無(wú)法滿(mǎn)足預(yù)期。因此，亟需研究新型的針對(duì)DC的脂質(zhì)體基因遞送系統(tǒng)以提高DC的轉(zhuǎn)染效率，并降低對(duì)DC活力的影響，為解決DC疫苗響應(yīng)率低提供一種新策略。

本研究將針對(duì)原代DC，篩選出安全有效的陽(yáng)離子脂質(zhì)，并優(yōu)化基于該陽(yáng)離子脂質(zhì)的基因遞送系統(tǒng)的制備方法，用于實(shí)現(xiàn)原代DC的安全高效轉(zhuǎn)染。本研究以本課題組前期優(yōu)選的3種陽(yáng)離子脂質(zhì)：包括賴(lài)氨酸谷氨酸雙油醇酯（OA2）、雙十四烷基（4-（（2-（1-甲基吡咯烷-2-基）乙基）氨基）-4-氧代丁?；┕劝彼幔═A7），以及雙十四烷基（4-（（1-甲基吡咯烷-3-基）氨基）-4-氧代丁?；┕劝彼幔═A13）進(jìn)行脂質(zhì)篩選，以SOCS1 siRNA為模型siRNA，分別采用共孵育法、乙醇注入法以及魚(yú)精蛋白復(fù)合法制備siRNA遞送系統(tǒng)（脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物）。同時(shí)，以脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的粒徑電位、對(duì)siRNA的包載能力、體外穩(wěn)定性、對(duì)原代DC的細(xì)胞毒性的影響，以及原代DC對(duì)脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的攝取效率和SOCS1的基因沉默效率為考察指標(biāo)，篩選出安全有效的陽(yáng)離子脂質(zhì)，并優(yōu)化出最佳的制備方法。

1 材料

1.1試劑

OA2、TA7、TA13（本課題組自制）；鼠源粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF（美國(guó)PeproTech公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、Opti MEM培養(yǎng)基、T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基T cell expansion Medium（美國(guó)賽默飛世爾公司）；魚(yú)精蛋白（美國(guó)Sigma公司）；Fam siRNA、SOCS1 si RNA（正義鏈：5′-GCATCCGCGT‐GCACTTCCA-3′，反義鏈：5′-TGGAAGTGCACGC‐GGATGC-3′）、SOCS1引物（上游：5′-CCACTCCTACCTCTCCATGTTTAC-3′，下游：5′-AAATGAAGCCAGAGACCCTCC-3′）、NC-si RNA（廣州銳博公司）；二油?；字Ｒ掖及罚―OPE）（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；GoldviewTM核酸染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；6×核酸上樣緩沖液、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)）。

1.2儀器

BS110S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；Attune NxT流式細(xì)胞儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）；超聲波細(xì)胞破碎儀（JY92，寧波新芝生物科技公司）；Zetasizer 3000 HAS粒徑電位儀（英國(guó)Malvern公司）；Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）；DYCP-33B瓊脂糖水平電泳儀（北京六一公司）；T11023碳支持膜（北京新興百瑞技術(shù)有限公司）；Mini-Extruder薄膜擠出器（美國(guó)Avanti Polar Lipids公司）。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞

C57BL/6J小鼠，雄性，體重20~22 g，由河南斯克貝斯生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（豫）2020-0005。小鼠骨髓來(lái)源DC（bone marrow-derived dendritic cell，BMDC，實(shí)驗(yàn)室自提）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 采用不同制備方法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物

選用本課題組自制的3種陽(yáng)離子脂質(zhì)：OA2、TA7、TA13，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。OA2是以賴(lài)氨酸為頭基、油醇雙鏈為尾鏈的不飽和脂質(zhì)，由于不飽和脂質(zhì)具有較低的相轉(zhuǎn)變溫度以及較高的膜融合能力，有利于其通過(guò)膜融合能力促進(jìn)si RNA藥物的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸。而TA7和TA13是以頭基為叔胺、十四碳烷基鏈為尾鏈的飽和脂質(zhì)，在其制備處方中加入不飽和輔助脂質(zhì)——二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE），能夠有效降低TA7和TA13制成脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變溫度，并提高其膜融合能力［18］，有利于si RNA藥物的內(nèi)涵體/溶酶體逃逸。因此，根據(jù)前期制備方法的篩選，選擇轉(zhuǎn)染效率最高的方法——薄膜擠出法制備OA2陽(yáng)離子脂質(zhì)體，采用薄膜分散法制備TA7或TA13陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

Figure 1 Chemical structures of OA2,TA7 and TA13

2.1.1 共孵育法 共孵育法是通過(guò)靜電結(jié)合的方式使陽(yáng)離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電性的siRNA緊密結(jié)合，從而形成脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。

（1）空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體的制備 采用薄膜擠出法制備OA2陽(yáng)離子脂質(zhì)體。精密稱(chēng)取OA2 10 mg并加入氯仿-甲醇混合液（3∶2）溶解，在37℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成脂質(zhì)薄膜并真空干燥。4 h后，加入超純水5 mL，充分振蕩并搖勻，提前開(kāi)啟加熱墊并預(yù)熱擠出裝置，在溫度達(dá)到45℃時(shí)采用擠出器依次擠出通過(guò)0.8、0.45、0.2μm的碳酸脂膜各11次，最終得到OA2陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

采用薄膜分散法制備TA7和TA13陽(yáng)離子脂質(zhì)體。精密稱(chēng)取TA13或TA7陽(yáng)離子脂質(zhì)6 mg，同時(shí)精密稱(chēng)取相同質(zhì)量的輔助脂質(zhì)DOPE，采用氯仿-甲醇混合液（3∶2）溶解。在37℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成脂質(zhì)薄膜后，真空干燥。4 h后，加入5 mL超純水，充分振蕩并搖勻，在37℃水合30 min。水合結(jié)束后，以30%功率在冰浴保護(hù)下探頭超聲15 min，最后通過(guò)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得到TA7/TA13陽(yáng)離子脂質(zhì)體。

（2）脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的制備 精密吸取siRNA（0.5 mg/mL）5μL并用無(wú)RNA酶的DEPC水將其稀釋至50μL。按照不同氮磷比（N/P，陽(yáng)離子脂質(zhì)中親水部分氮原子摩爾數(shù)與核酸藥物中磷酸摩爾數(shù)之比），吸取相應(yīng)體積的各組脂質(zhì)體溶液并用DEPC水稀釋至150μL。將上述稀釋后的siRNA溶液與脂質(zhì)體溶液充分混勻，渦旋15 s，室溫靜置孵育30 min后得到不同N/P比的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。

2.1.2 乙醇注入法 利用乙醇溶劑溶解陽(yáng)離子脂質(zhì)并在一定的攪拌速率下將脂質(zhì)溶液滴加到DEPC水/緩沖鹽溶液中，到達(dá)滴定終點(diǎn)后透析除去乙醇，即得到粒徑均一的脂質(zhì)體溶液。

精密稱(chēng)取OA2、TA7或TA13陽(yáng)離子脂質(zhì)2 mg，采用無(wú)水乙醇1 mL溶解各組陽(yáng)離子脂質(zhì)，在400 r/min攪拌速率下向其中滴加DEPC水或含有SOCS1 siRNA的DEPC水，當(dāng)乙醇終濃度達(dá)30%時(shí)停止滴加。到達(dá)滴加終點(diǎn)后，透析2 h除去乙醇溶劑，即得到乙醇注入法制備的空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體或脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。

2.1.3 魚(yú)精蛋白復(fù)合法 先將魚(yú)精蛋白（protamine）與siRNA復(fù)合形成正電性復(fù)合物，隨后與脂質(zhì)體溶液孵育，并將混合溶液在-80℃與60℃條件下反復(fù)凍融循環(huán)，利用冷凍過(guò)程產(chǎn)生的冰晶對(duì)脂質(zhì)體產(chǎn)生的物理破壞，使得siRNA進(jìn)入脂質(zhì)體的內(nèi)水相，而高溫融化過(guò)程又可以使得脂質(zhì)膜重新融合，如此反復(fù)循環(huán)來(lái)提高脂質(zhì)體對(duì)siRNA的包載率，最終形成脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。

精密稱(chēng)量魚(yú)精蛋白1 mg并溶解于DEPC水1 mL中。按照魚(yú)精蛋白與siRNA質(zhì)量比為8∶5的比例吸取相應(yīng)體積的魚(yú)精蛋白與siRNA溶液，將兩者溶液混合均勻，室溫靜置復(fù)合10 min，即得到魚(yú)精蛋白/siRNA復(fù)合物。在N/P=5的條件下，吸取采用薄膜水化法制備的不同陽(yáng)離子脂質(zhì)體并用DEPC水稀釋至100μL，將不同的脂質(zhì)體溶液分別與上述魚(yú)精蛋白/si RNA復(fù)合物混合均勻，室溫靜置復(fù)合。10~15 min后，將混合溶液放置于-80℃1 min，隨后置于60℃恒溫水浴鍋2 min，如此凍融循環(huán)10次，即得到脂質(zhì)體-魚(yú)精蛋白/siRNA復(fù)合物。

2.2 粒徑和電位的測(cè)定

采用動(dòng)態(tài)光散射法分別測(cè)定不同空白脂質(zhì)體和脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的粒徑電位。

2.3 對(duì)siRNA的包載能力

采用瓊脂糖凝膠電泳法分別考察各組siRNA的滲漏情況，用于評(píng)價(jià)不同方法制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)siRNA的包載能力。制備1%瓊脂糖凝膠并在室溫下靜置待其完全凝固。向各孔分別加入6×核酸上樣緩沖液4μL與不同方法制備得到的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物20μL，均勻混合。隨后使用電泳儀在120 V恒壓條件下電泳30 min，最后采用凝膠成像系統(tǒng)觀察各組siRNA的條帶。

2.4 不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性

將不同方法制備得到各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物（N/P=5）分別用DEPC水、PBS緩沖液、RPMI 1640、Opti MEM或T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基1.5 mL稀釋。在混合均勻后0、2、4、6、12和24 h，分別采用動(dòng)態(tài)光散射法考察脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在不同介質(zhì)中粒徑隨時(shí)間變化情況。

2.5 細(xì)胞毒性

脫頸處死C57BL/6雄性小鼠，分離脛骨和股骨，將脛骨、股骨內(nèi)的骨髓細(xì)胞沖洗至RPMI 1640培養(yǎng)基中。1 800 r/min離心3 min，棄去上清液并收集細(xì)胞沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL，于4℃條件下裂解紅細(xì)胞3 min。繼續(xù)1 800 r/min離心3 min，棄去上清液并收集細(xì)胞沉淀，PBS清洗1次。隨后使用含有20 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。以每毫升5×105個(gè)的細(xì)胞密度鋪入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入含有20 ng/mL GM-CSF的RPMI 1640完全培養(yǎng)基2 mL［19］。將其放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第2天、第4天半換液，在第6天收獲未成熟DC并用于后續(xù)研究。收集上述誘導(dǎo)第6天的DC，以每孔每毫升2×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于12孔板中待用。將不同的脂質(zhì)體/si RNA復(fù)合物（N/P=5）分別與DC共孵（cSOCS1siRNA=200 nmol/L，cOA2=74.76μg/mL，cTA7=41.44μg/mL，cTA13=62.4μg/mL），于孵育6、12、24、48 h后收集各組DC，使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組脂質(zhì)體/si RNA對(duì)DC的安全性。

2.6 DC對(duì)脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的攝取

收集上述誘導(dǎo)第6天的DC，以每孔每毫升2×106個(gè)細(xì)胞的密度（0.5 mL）接種于12孔板中待用。以綠色熒光標(biāo)記的Fam siRNA為模型siRNA，按上述方法制備得到各組脂質(zhì)體/Fam siRNA復(fù)合物。將不同脂質(zhì)體/Fam siRNA復(fù)合物（N/P=5，cFamsiRNA=200 nmol/L）與DC共孵育（選擇市售制劑Lipo2000作為陽(yáng)性對(duì)照）。6 h后，收集各組DC，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fam+DC的陽(yáng)性率（即攝取Fam si RNA的DC細(xì)胞比例）以及Fam siRNA的平均熒光強(qiáng)度（可反應(yīng)所有DC的攝取數(shù)量），用于考察DC對(duì)不同制備方法得到的脂質(zhì)體/Fam siRNA復(fù)合物的攝取情況。

2.7 脂質(zhì)體/siRNA對(duì)DC中SOCS1基因的沉默效果

收集上述誘導(dǎo)第6天的DC，以每孔每毫升2×106個(gè)細(xì)胞的密度（0.5 mL）接種于12孔板中待用。將3種方法制備得到的各組脂質(zhì)體/SOCS1 si RNA復(fù)合物（N/P=5，cSOCS1siRNA=200 nmol/L）與DC共孵育（選擇Lipo2000作為陽(yáng)性對(duì)照）。6 h后換液，隨后繼續(xù)培養(yǎng)，42 h后收集DC，每組加入TRNzol RNA提取液500μL，反復(fù)吹打細(xì)胞并收集于無(wú)RNA酶離心管中提取RNA，最后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄、qPCR實(shí)驗(yàn)。qPCR檢測(cè)程序?yàn)椋?）95℃10 min；2）95℃15 s；3）60℃30 s，上述步驟程序循環(huán)40次，測(cè)定融解曲線程序：95℃15 s；60℃60 s；95℃15 s。檢測(cè)結(jié)束后，按照公式（1）（2）（3）可得到各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)DC中SOCS1基因的沉默效率。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同方法制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的表征

3.1.1 陽(yáng)離子脂質(zhì)體的粒徑和電位 首先采用薄膜水化法以及乙醇注入法制備OA2、TA7和TA13陽(yáng)離子脂質(zhì)體，其粒徑電位結(jié)果如表1所示。乙醇注入法制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑為130~200 nm，薄膜水化法制備的陽(yáng)離子脂質(zhì)體粒徑為60~130 nm。由此可見(jiàn)，薄膜水化法制備而成的脂質(zhì)體的粒徑普遍低于乙醇注入法，可能是因?yàn)楸∧に〞?huì)通過(guò)超聲、擠膜等操作過(guò)程降低粒徑。但采用兩種方法所得空白脂質(zhì)體粒徑的多分散指數(shù)PDI均小于0.25，表明采用兩種方法均能得到粒徑均一的脂質(zhì)體。

此外，各組陽(yáng)離子脂質(zhì)體電位均在+25~+45 mV之間，兩種方法所得空白脂質(zhì)體的電性差異不大。其中OA2陽(yáng)離子脂質(zhì)體的正電性最強(qiáng)，可能是因?yàn)槠溆H水頭基為伯胺，且整個(gè)脂質(zhì)體只含有陽(yáng)離子脂質(zhì)；而TA7和TA13的親水頭基為叔胺，且脂質(zhì)體中含有電中性的輔助脂質(zhì)DOPE。由此可見(jiàn)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體的電性主要取決于陽(yáng)離子脂質(zhì)的性質(zhì)和用量，而與制備方法無(wú)關(guān)。

Table 1 Particle size,Zeta potential and PDI of liposomes by differ‐ent prepartation(±s,n=3)

Table 1 Particle size,Zeta potential and PDI of liposomes by differ‐ent prepartation(±s,n=3)

Cationic lipids OA2 OA2(Ethanol)TA7 TA7(Ethanol)TA13 TA13(Ethanol)Size/nm 128.03±0.11 198.31±0.26 92.51±0.29 131.61±1.35 65.38±0.84 144.35±0.33 Zeta/mV 43.21±1.24 37.85±2.88 28.35±2.38 29.89±1.70 20.18±0.79 22.33±1.77 PDI 0.119±0.012 0.170±0.009 0.236±0.007 0.207±0.011 0.239±0.004 0.145±0.015

3.1.2 對(duì)siRNA的包載能力 陽(yáng)離子脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)siRNA的包載能力決定著后續(xù)的遞送效率。因此，本研究采用瓊脂糖凝膠電泳法首先考察3種方法制備的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)siRNA的包載能力（圖2）。結(jié)果表明，共孵育法、乙醇注入法和魚(yú)精蛋白復(fù)合法制備的各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在N/P=5時(shí)均不發(fā)生滲漏。因此，后續(xù)將以N/P=5制備脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，以保證siRNA能夠被穩(wěn)定荷載。

3.1.3 脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的粒徑電位 根據(jù)共孵育法、乙醇注入法以及魚(yú)精蛋白復(fù)合法分別制備得到各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物（N/P=5）并對(duì)其粒徑電位進(jìn)行測(cè)定（圖3）。結(jié)果顯示，3種制備方法均能得到平均粒徑為100~250 nm，電位在+10~+25 mV之間的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，表明在N/P=5時(shí)，各組脂質(zhì)體均能夠有效荷載siRNA并形成粒徑均一的弱正電性脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物。

Figure 2 Agarose gel electrophoresis analysis of the liposome/siRNA complexesA:Liposome/siRNA complexes prepared by co-incubation method;B:Liposome/siRNA complexes prepared by ethanol injection method;C:Liposome/si RNA complexes prepared by protamine compound method

Figure 3 Particle size and Zeta potential of liposome/siRNA complexes(xˉ±s,n=3)

3.2 不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性

為了保證脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在與DC共孵育時(shí)的穩(wěn)定性，本研究考察了各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在不同孵育介質(zhì)中24 h內(nèi)的粒徑變化，以篩選出最佳的共孵育介質(zhì)（圖4）。結(jié)果顯示，OA2脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在T細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育24 h后粒徑基本保持不變，而TA7和TA13脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在RPMI 1640培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性更好。因此，后續(xù)將采用各自最優(yōu)的孵育介質(zhì)進(jìn)行脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物與DC的共孵育，以保證復(fù)合物的穩(wěn)定性。

3.3 細(xì)胞毒性

原代DC對(duì)遞送材料敏感，易于產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此，遞送材料的細(xì)胞相容性是評(píng)價(jià)DC基因遞送載體的重要指標(biāo)。以市售脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000作為陽(yáng)性對(duì)照，本研究以凋亡試劑盒檢測(cè)了各組脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物在48 h內(nèi)對(duì)DC的細(xì)胞毒性（圖5）。結(jié)果顯示，在48 h時(shí)，OA2、TA13、TA7組DC的細(xì)胞存活率均高于80%，其中，采用共孵育法制備的OA2/siRNA組的細(xì)胞相容性最優(yōu)，48 h內(nèi)DC存活率可達(dá)89%，而Lipo2000組DC的細(xì)胞存活率不足70%。表明3種方法制備的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)于DC均具有良好的安全性，且優(yōu)于市售制劑Lipo2000。

3.4 DC對(duì)脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的攝取

DC對(duì)脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的有效攝取是siRNA入胞發(fā)揮作用的前提。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Fam+DC的陽(yáng)性率及其平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）（圖6），以評(píng)價(jià)DC對(duì)3種方法制備的脂質(zhì)體/Fam siRNA復(fù)合物的攝取效率。綜合考慮Fam+DC的陽(yáng)性率和MFI，DC對(duì)于乙醇注入法制備的脂質(zhì)體/si RNA復(fù)合物的攝取效率低于Lipo2000，而其余兩種方法制備的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的攝取效率均高于Lipo2000，其中OA2復(fù)合物組的Fam+DC陽(yáng)性率可達(dá)到90%以上。并且，DC攝取共孵育法制備的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物的Fam MFI顯著高于魚(yú)精蛋白復(fù)合法。因此，根據(jù)DC細(xì)胞毒性以及攝取效率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇共孵育法制備的脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物進(jìn)行基因沉默效率的考察。

3.5 DC中SOCS1基因的沉默效率

Figure 6 Uptake of Fam si RNA transfected into DC by Lipo2000,OA2,TA13 or TA7 prepared by different methods using flow cytometric assay A:Statistical chart(xˉ±s,n=3);B:Peak figure.MFI:Mean fluorescence intensity*P＜0.05 vs TA13-Protamine/siRNA group;***P＜0.001 v s OA2-Protamine/si RNA group;****P＜0.000 1 vs TA7-Protamine/siRNA

基因沉默效率是脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物對(duì)DC遞送siRNA有效性的最直接評(píng)判指標(biāo)。本研究通過(guò)qPCR實(shí)驗(yàn)考察共孵育法制備的各組脂質(zhì)體/SOCS1 siRNA復(fù)合物對(duì)DC中SOCS1 mRNA的沉默效率（圖7）。結(jié)果顯示，相較于Lipo2000/SOCS1 siRNA組，OA2/SOCS1 siRNA、TA13/SOCS1 siRNA以及TA7/SOCS1 siRNA均有顯著的基因沉默效果。其中，OA2/SOCS1 siRNA基因沉默效率最高，達(dá)到50%，大約為陽(yáng)性對(duì)照Lipo2000/SOCS1 siRNA組的10倍，可能是因?yàn)镺A2/SOCS1 siRNA組具有最高的細(xì)胞攝取效率。由此可見(jiàn)，本研究通過(guò)共孵育法制備的OA2/siRNA復(fù)合物能夠有效降解DC胞內(nèi)免疫抑制基因SOCS1的mRNA，從而有效抑制其蛋白在DC胞內(nèi)的持續(xù)表達(dá)。

4 總結(jié)

Figure 7 Expression of SOCS1 mRNA in DC after treatment with dif‐ferent liposome/si RNA complexes,compared with untreated group(xˉ±s,n=4)*P＜0.05,***P＜0.001 vs Lipo2000/siRNA group

本研究通過(guò)共孵育法、乙醇注入法以及魚(yú)精蛋白復(fù)合法3種方法分別將3種陽(yáng)離子脂質(zhì)（OA2、TA7、TA13）制備成脂質(zhì)體/siRNA復(fù)合物，并探究不同陽(yáng)離子脂質(zhì)和脂質(zhì)體制備方法對(duì)脂質(zhì)體粒徑電位、siRNA包載能力、穩(wěn)定性、DC細(xì)胞毒性、DC攝取和基因沉默效果的影響。研究表明，本研究已篩選出對(duì)DC轉(zhuǎn)染安全有效的OA2陽(yáng)離子脂質(zhì)，其通過(guò)共孵育法制備的OA2/siRNA復(fù)合物的細(xì)胞攝取效率達(dá)到90%以上，基因沉默效率達(dá)50%以上，可有效降低DC免疫抑制基因SOCS1的表達(dá)，有利于提高DC的抗原呈遞能力。后期將進(jìn)一步研究OA2/SOCS1 siRNA處理后DC的抗原呈遞能力和腫瘤治療效果。本研究為原代DC細(xì)胞提供了一種安全有效、制備簡(jiǎn)單的基因遞送載體平臺(tái)，也為提高DC腫瘤疫苗效力提供了一種可能的策略。