李小芳，任隴飛，王丹丹，李玉艷

（中國藥科大學(xué)藥物化學(xué)系，南京211198）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種多因素致死性的神經(jīng)退行性疾?。?］。預(yù)計(jì)到2030年，我國65~70歲人群中癡呆患者占比將高達(dá)約6%，并且隨著年齡的增加，發(fā)病率持續(xù)上升［2］。目前的治療雖然可以緩解AD的癥狀，但是能夠延緩或阻止AD進(jìn)程的藥物尚未出現(xiàn)［3］。

AD的病理機(jī)制極其復(fù)雜，淀粉樣蛋白（β-amy‐loid peptide，Aβ）沉積為斑塊以及過度磷酸化的Tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏結(jié)是患者大腦中主要的病理特征［4］，金屬離子和氧化應(yīng)激通路等均與疾病的發(fā)展密切相關(guān)，最終導(dǎo)致突觸損傷，大量神經(jīng)元丟失，海馬區(qū)和大腦皮層萎縮，患者出現(xiàn)記憶衰退，認(rèn)知和行為缺陷等臨床癥狀［5］。

眾多研究結(jié)果表明，Aβ蛋白包括Aβ單體、寡聚體和纖維在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［3］，所以這類蛋白一直是AD新藥研究中最受關(guān)注的靶點(diǎn)之一?；蜓芯孔C實(shí)，增加Aβ的產(chǎn)生或者降低Aβ的清除是AD發(fā)病的重要因素［3］。淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）、早老素1（presenilin 1，PS1）或早老素2（presenilin，PS2）基因突變促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生，攜帶人群易于發(fā)展為AD［3，6］。載脂蛋白4（apolipoprotein E4，ApoE4）基因的表達(dá)削弱了機(jī)體對Aβ的清除，ApoE4雜合基因攜帶者患AD的風(fēng)險(xiǎn)比正常人增加3倍，純合基因攜帶者患病風(fēng)險(xiǎn)增加15倍［7］。與此相對應(yīng)，icelandic突變（APP基因發(fā)生A673T突變）將Aβ含量降低40%，基因攜帶者患AD風(fēng)險(xiǎn)顯著降低［3］。

AD患者的大腦中存在Aβ纖維沉積而成的斑塊，早期的藥物研究試圖通過清除斑塊來逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。但是，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ斑塊的減少不能緩解患者的認(rèn)知損傷，并且引發(fā)了腦血管水腫等不良反應(yīng)［8］。近些年，越來越多的證據(jù)表明，相對于不溶的斑塊，可溶性的Aβ寡聚體毒性更高［9］。Aβ寡聚體與細(xì)胞膜或膜上的受體作用，引起局部擾動(dòng)而影響信號傳導(dǎo)［10］。環(huán)形結(jié)構(gòu)的寡聚體在細(xì)胞膜表面形成孔洞，導(dǎo)致神經(jīng)元破壞［10］，而神經(jīng)元的死亡是AD癥狀發(fā)作的主要原因［11］。Aβ寡聚體還能夠抑制長時(shí)程增強(qiáng)，降低突觸的可塑性，導(dǎo)致突觸損失［10］。與此同時(shí)，促進(jìn)Aβ寡聚體產(chǎn)生但是斑塊增加不明顯的Osaka突變易于表現(xiàn)出癡呆早期的認(rèn)知損傷癥狀［3，12］，較少斑塊沉積的Arctic突變同樣易出現(xiàn)早發(fā)性AD癥狀［3，13-14］。在疾病癥狀出現(xiàn)前10多年，寡聚體已經(jīng)在大腦中產(chǎn)生從而引發(fā)神經(jīng)組織的損傷。Aβ寡聚體形成斑塊沉積在大腦，可能是人體的一種保護(hù)機(jī)制。因此，消除Aβ斑塊，可能使大腦中的寡聚體含量上升，不僅不能減緩認(rèn)知的下降，還會帶來更多的不良反應(yīng)。相比于Aβ斑塊，Aβ寡聚體成為越來越受到關(guān)注的AD治療靶標(biāo)。

Aβ寡聚體是由單體組成的具異質(zhì)性和瞬時(shí)性的可溶性聚合物。APP在β分泌酶和γ分泌酶的解離下形成Aβ單體［10］，主要有Aβ40和Aβ42兩種亞型。Aβ40為40個(gè)氨基酸組成的短肽，Aβ42在C端比Aβ40多了兩個(gè)氨基酸，分別為Ile41和Ala42，脂溶性增加更容易發(fā)生聚集［15-16］。在正常狀態(tài)下，Aβ單體保持一種無規(guī)則狀態(tài)，沒有神經(jīng)毒性，在外部環(huán)境如pH和溫度等的誘導(dǎo)下會發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換，形成β片層結(jié)構(gòu)［10］，接著通過疏水性區(qū)域（Aβ16-22）相互作用，自身聚集，形成二聚體、三聚體、六聚體和十二聚體等神經(jīng)毒性強(qiáng)的可溶性寡聚體［10］。寡聚體進(jìn)一步聚合成不可溶的Aβ纖維沉淀在大腦形成斑塊（圖1）。

圖1 淀粉樣蛋白產(chǎn)生以及病理性聚集示意圖[10]

本文以Aβ寡聚體為靶點(diǎn)，關(guān)注通過降低毒性寡聚體的水平，發(fā)展AD治療藥物的最新研究進(jìn)展。主要從3個(gè)方面綜述最新的研究工作，包括：（1）抑制Aβ單體聚集，減少毒性寡聚體產(chǎn)生；（2）促進(jìn)無毒低毒聚合物形成，降低寡聚體對神經(jīng)的損傷；（3）毒性Aβ寡聚體的清除。分析活性分子的結(jié)構(gòu)特征、作用機(jī)制、臨床前和臨床數(shù)據(jù)，并對本領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行總結(jié)與展望。

1 Aβ單體聚集抑制劑

1.1 高?；撬犷愐种苿?/h3>

離子遷移譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ion mobility spec‐trometry-mass spectrometry，IMS-MS）、核磁共振光譜技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）以及分子動(dòng)力學(xué)模擬證實(shí)，高?；撬幔▓D2-B）作用于Aβ單體的Lys16，Lys28和Asp23，使Aβ單體維持α螺旋狀態(tài)，抑制寡聚體的形成［17］（圖2-A）。在一項(xiàng)針對輕度AD的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，攜帶ApoE4純合子人群中，高?；撬嶂委熃M與安慰劑組相比，認(rèn)知狀態(tài)顯著改善，ADAS-cog，CDR-SB兩種量表的評分增長125%和81%［18］。為了改善高?；撬岬乃幋鷦?dòng)力學(xué)性質(zhì)（尤其是胃腸道穩(wěn)定性），將氨基用纈氨酸?；玫紸LZ-801（圖2-B），進(jìn)入臨床Ⅱ期試驗(yàn)［19］。相對于高?；撬?，ALZ-801更易于透過血腦屏障，血漿半衰期延長。每日給藥兩次，約1周內(nèi)腦濃度達(dá)到較高的穩(wěn)態(tài)峰值［8，20］。與靶向Aβ斑塊的研究相比，高?；撬峒捌淅i氨酸修飾的化合物無論在ApoE4純合基因攜帶者還是其他易發(fā)人群中，均沒有產(chǎn)生血管性水腫等嚴(yán)重不良反應(yīng)［8］。它們的主要代謝物3-磺基丙酸（圖2-B）是一種內(nèi)源性分子，抑制Aβ寡聚體生成的活性與高?；撬嵯喈?dāng)。在大鼠模型中，表現(xiàn)出極高的口服生物利用度和25%的腦滲透性，推測其可能為抑制AD的關(guān)鍵生物活性分子［19］。

圖2 高?；撬嵋种艫β單體聚集機(jī)制示意圖[17](A)及高牛磺酸類化合物結(jié)構(gòu)(B)

1.2 環(huán)狀氨基酸類抑制劑

不同類型的Aβ蛋白具有相似的N端結(jié)構(gòu)，通過靶向Aβ的N端來穩(wěn)定單體，阻斷寡聚體的形成是一種有效的藥物設(shè)計(jì)策略［21］?？紤]到N端固有的柔性，小分子靶向結(jié)合的親和力較弱［15，22］，Wen等［21］將AβN端部分視為配體，設(shè)計(jì)剛性結(jié)構(gòu)的環(huán)套狀分子作為N端配體結(jié)合口袋［21］（圖3-A）。由于AβN端部分富含酸性和芳香性氨基酸，采用堿性氨基酸精氨酸和有脂溶性殘基的氨基酸構(gòu)成剛性帶正電荷的環(huán)狀分子包括GS1~GS4，LGS-1和LGS-2分別為GS-1和GS-2的線性結(jié)構(gòu)（圖3-B）［21，23］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物GS1~GS3中，GS-2與Aβ單體的N端有更高的結(jié)合力，說明帶電的精氨酸殘基有利于AβN端的特異性識別［21］。未修飾蛋白的光誘導(dǎo)交聯(lián)（photo-induced cross-linking of unmodified proteins，PICUP）和Western blot實(shí)驗(yàn)顯示，GS-2可以穩(wěn)定Aβ42單體并抑制Aβ42寡聚體的形成，而GS-3盡管可以抑制Aβ纖維的形成，但是無法抑制寡聚化，表明精氨酸對于阻礙Aβ寡聚體形成至關(guān)重要［21］。與此同時(shí)，GS-2還可以將已經(jīng)形成的Aβ42寡聚體轉(zhuǎn)換為Aβ42單體。因此，靶向Aβ單體N端是一種有潛力的新型AD藥物設(shè)計(jì)策略［21］。

圖3 環(huán)狀氨基酸結(jié)構(gòu)以及作用模式圖A:GS-2抑制Aβ寡聚體形成和解離Aβ聚合物的模型[21]；B:GS系列和LGS系列分子結(jié)構(gòu)

1.3 寡聚喹啉類抑制劑

Aβ單體和胰島淀粉樣蛋白多肽（isletamyloid‐polypeptide，IAPP）一樣會通過自聚集生成寡聚體，而且發(fā)生聚集的區(qū)域氨基酸序列相似。受此啟發(fā)，Kumar等［26］從抑制IAPP聚集的化合物庫中篩選到抑制Aβ單體聚集的寡聚喹啉類活性分子5（圖4-A）［24-25］。這類化合物具有類肽骨架，芳基酰胺基團(tuán)的分子內(nèi)氫鍵使其形成α螺旋構(gòu)象（圖4-B）?；衔?α螺旋結(jié)構(gòu)上的取代基與Aβ單體自聚集區(qū)域Aβ13-24作用（Kd=2.2±0.3μmol/L），促使Aβ單體從無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪龢?gòu)象，避免了聚集形成寡聚體［26］。化合物5對于Aβ單體的聚集抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，Aβ蛋白與化合物5為等當(dāng)量時(shí)，Aβ聚集被完全抑制［26］。但是將化合物5側(cè)鏈的2-甲基丁基轉(zhuǎn)換為羧基或其他疏水性基團(tuán)如乙基、異丙基或異丁基時(shí)，其Aβ聚集抑制作用被削弱，位于表面的脂溶性取代基對抑制Aβ的聚集非常關(guān)鍵［26］。進(jìn)一步的電鏡和Dot blot檢測也證明，化合物5通過促進(jìn)無定形的聚合物形成，減少了毒性寡聚體和Aβ纖維生成?；衔?還可以破壞已經(jīng)形成的Aβ寡聚體，抑制Aβ纖維種子介導(dǎo)的Aβ快速聚集作用［26］。研究表明寡聚體對線粒體功能具有毒性作用，共聚焦成像顯示化合物5可以透過細(xì)胞膜，與Aβ單體共定位于線粒體，有效地緩解Aβ介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（IC50=3.02±0.08μmol/L）［26］。

圖4 化合物5的結(jié)構(gòu)(A)及其α螺旋結(jié)構(gòu)(B)示意圖[26]

1.4 α螺旋短肽類抑制劑

Aβ纖維表面作為催化中心能夠促進(jìn)Aβ單體聚集形成可溶性的寡聚體，阻止單體與纖維表面的相互作用可以減少Aβ寡聚體的形成［27-28］。Aβ3-14短肽（-E3FRHDSGYEVHH14-）折疊形成螺旋結(jié)構(gòu)，3個(gè)螺旋面與Aβ纖維表面的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生特異性相互作用［27］。含有D7和E11殘基的螺旋面和R5殘基的螺旋面與纖維表面結(jié)合位點(diǎn)的K16和E22殘基發(fā)生靜電相互作用，含有F4和S8的螺旋面與纖維V18和F10發(fā)生疏水性相互作用［27，29-30］。Jiang等［27］通過氨基酸突變提高與纖維表面單體結(jié)合位點(diǎn)的靜電作用和疏水性作用，設(shè)計(jì)了一個(gè)具有螺旋結(jié)構(gòu)的纖維表面抑制劑HASI-1：A3FRAD‐VRAERAE14（圖5-A），結(jié)合模式如圖5-B所示。HASI-1對纖維表面結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合親和力比Aβ3-14短肽增強(qiáng)［27］。將HASI-1的A3和A6殘基分別突變?yōu)閕so-D（L-異天冬氨酸）和Dap（2，3-二氨基丙酸），再將兩個(gè)非天然氨基酸交聯(lián)環(huán)化得到cHASI-1（圖5-A），以穩(wěn)定化合物自身形成的α螺旋結(jié)構(gòu)［27］。熒光偏振（fluorescence polarization，F(xiàn)P）和等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC）檢測出cHASI-1與Aβ纖維有較好的親和力，Kd分別為3.8和2.9μmol/L［27］。在5%Aβ纖維存在的條件下（在此條件下Aβ的聚集過程以Aβ纖維催化的聚集為主），cHASI-1有效地減慢了Aβ40的聚集過程，并降低了寡聚體的形成，緩解了寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［27］。但是，由于其較高的相對分子質(zhì)量和親水性，短肽難以透過血腦屏障發(fā)揮作用，限制了其臨床開發(fā)。

圖5 HASI-1，cHASI-1結(jié)構(gòu)(A)以及HASI-1與Aβ纖維作用示意圖(B)[27]

2 Aβ無毒或低毒聚合物轉(zhuǎn)化劑

2.1 寡聚噻吩類轉(zhuǎn)化劑

寡聚噻吩類化合物p-FTAA（圖6-A）與Aβ結(jié)合，減弱了Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性［31］。將30μmol/L Aβ42與3μmol/L p-FTAA共孵育后加入到神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基，相比于空白對照組，細(xì)胞存活率提升［31］。實(shí)驗(yàn)表明，p-FTAA與Aβ寡聚體結(jié)合從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［31］。Dot blot實(shí)驗(yàn)顯示，p-FTAA與Aβ共孵育，在3 h時(shí)，可溶性的Aβ蛋白幾乎完全消失，TEM顯示此時(shí)的Aβ主要為致密的纖維狀結(jié)構(gòu)（圖6-B和6-C）。與此相反，Aβ單獨(dú)孵育3 h仍有大量的可溶性Aβ蛋白存在，形成球狀體和原纖維的混合體系（圖6-B和6-C）［31］。p-FTAA與可溶性的Aβ寡聚體結(jié)合，促進(jìn)非毒性Aβ纖維轉(zhuǎn)化，這種纖維疏水性較小，蛋白酶K無法裂解，與Aβ單獨(dú)孵育時(shí)形成的纖維不同［31］。

圖6 p-FTAA的結(jié)構(gòu)以及p-FTAA對Aβ聚集的影響A:p-FTAA的結(jié)構(gòu)；B:Aβ單獨(dú)孵育以及與p-FTAA共孵育的蛋白組分Dot blot分析，所用抗體為6E10[31]；C:Aβ單獨(dú)孵育以及與p-FTAA共孵育3 h時(shí)的TEM圖片[31]

2.2 黃酮類轉(zhuǎn)化劑

從茯磚茶中提取的YCF-2（圖7-A）通過多種方式發(fā)揮AD治療功能［32］，包括降低β-分泌酶的活性，抑制Aβ42纖維化，降解形成的纖維。YCF-2對寡聚體結(jié)合活性更強(qiáng)，并呈現(xiàn)劑量依賴性［32］。將Aβ42與YCF-2共孵育，形成不包含β折疊結(jié)構(gòu)，與毒性寡聚體不同的大的寡聚體（圖7-B），OC抗體和W20抗體不能識別［32］。OC抗體用于特異性識別纖維或纖維樣的寡聚體，而W20抗體靶向有毒的Aβ寡聚體［33-34］。用計(jì)算機(jī)模擬Aβ17-42二聚體與YCF-2的相互作用，發(fā)現(xiàn)其嵌入Aβ二聚體的疏水性空腔中，與Phe20發(fā)生π-π堆疊作用，與Val36形成氫鍵，與Val40產(chǎn)生疏水性相互作用（圖7-C）［32］。YCF-2結(jié)合Aβ寡聚體，抑制其向β折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，促使非毒性的寡聚體形成，從而降低其毒性［32］。

圖7 YCF-2對于Aβ42聚集的影響以及兩者的相互作用A:YCF-2的結(jié)構(gòu);B:Aβ單獨(dú)孵育以及與YCF-2以1∶4物質(zhì)的量濃度比例孵育4 h后的TEM圖片[32];C:YCF-2與Aβ17-42二聚體分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果[32]

大量的證據(jù)表明，Aβ聚集過程中形成的可溶性Aβ寡聚體比成熟的不可溶纖維毒性更高［9］。加速Aβ單體的聚集減少寡聚體的濃度就成為一種合理的策略。Zhang等［35］篩選黃酮類化合物庫發(fā)現(xiàn)了ZGM-1（圖8-A），劑量依賴性地促進(jìn)Aβ單體組裝成網(wǎng)狀多分支聚合物（圖8-B），從而降低毒性寡聚體含量［35］。給4個(gè)月大的APPswe/PS1-dE9雄性小鼠腹腔注射ZGM-1（40 mg/kg）2 h后，其透過血腦屏障，大腦中濃度達(dá)到峰值308 nmol/L。以40 mg/kg劑量連續(xù)灌胃給藥8周，小鼠的記憶力明顯提高，且大腦中的Aβ斑塊相對于未給藥的轉(zhuǎn)基因小鼠明顯增加［35］。

圖8 ZGM1結(jié)構(gòu)以及其對Aβ聚集的影響A:ZGM-1的結(jié)構(gòu);B:50μmol/L Aβ在37℃單獨(dú)孵育7 d以及在ZGM-1存在的條件下孵育形成的聚合物的TEM圖像[35]

2.3 多肽類轉(zhuǎn)化劑

D3多肽（D型多肽序列：RPRTRLHTHRNR）具備多種抗Aβ活性［36］，Klein等［36］通過D3衍生物分子庫的篩選發(fā)現(xiàn)了DB3具有較好的結(jié)合Aβ單體和抑制Aβ纖維形成的能力。考慮到Aβ寡聚體是由多個(gè)Aβ單體組成，將兩個(gè)DB3首尾串聯(lián)得到DB3DB3（D型多肽序列：RPITRLRTHQNRRPITRL RTHQNR），以增加與寡聚體內(nèi)部多個(gè)單體的作用達(dá)到清除寡聚體的作用［36］。相對于DB3（Kd=75μmol/L），DB3DB3對于Aβ單體有更好的結(jié)合親和力（Kd=1μmol/L）［36］。在80μmol/L預(yù)形成的寡聚體中加入20μmol/L DB3可以使寡聚體的含量降低27%，而加入10μmol/L的DB3DB3可以降低82%的寡聚體［36］。但是通過QIAD發(fā)現(xiàn)清除Aβ寡聚體并沒有影響Aβ單體的量而增加了相對分子質(zhì)量較大的共聚物，這意味著DB3DB3可能將寡聚體轉(zhuǎn)變?yōu)楦蟮木酆衔铮?6］。TEM證實(shí)了DB3DB3確實(shí)可以促進(jìn)Aβ肽轉(zhuǎn)變?yōu)榇蟮臒o定形的Aβ共聚物（圖9）。將預(yù)形成的1μmol/L的Aβ寡聚體與DB3DB3共孵育40 min，加入到PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基中，在0.1~2.5μmol/L范圍內(nèi)DB3DB3可以劑量依賴性地增加細(xì)胞的存活率，而DB3與寡聚體的共孵育卻沒有明顯地提高細(xì)胞存活率［36］。DB3可以抑制Aβ的聚集（EC50=6μmol/L），而DB3DB3的EC50降低約1 000倍［36］。綜上，DB3DB3相比于DB3，抗Aβ活性有所提高，其可以有效地降低寡聚體的量，使Aβ肽轉(zhuǎn)化為無定形不規(guī)則的聚合物；將DB3經(jīng)首尾串聯(lián)得到DB3DB3以提高其活性的方法是有意義的［36］。

圖9 DB3以及DB3DB3對于Aβ42聚集的影響A:10μmol/L Aβ42單獨(dú)孵育24 h的TEM圖像[36];B:10μmol/L Aβ42與10μmol/L DB3共孵育24 h的TEM圖像[36];C:10μmol/L Aβ42與5μmol/L DB3DB3共孵育24 h的TEM圖像[36]

2.4 其他類

EC是具有血腦屏障透過性的鉗型骨架小分子（圖10-A），特異性地與Aβ寡聚體共組裝形成非纖維化、可降解、無毒的無定形共聚物（圖10-B）［37-38］。在EC中引入4-（咪唑并［1，2-a］吡啶-2-基）苯胺（4-（imidazo［1，2-a］pyridin-2-yl）aniline）（IPA）靶 向Aβ寡聚體的溶劑暴露區(qū)域。DTPA-Eu螯合結(jié)構(gòu)連接兩個(gè)IPA基團(tuán)，形成的剛性構(gòu)象可以使EC與Aβ寡聚體發(fā)生相互作用，穩(wěn)定共聚物的結(jié)構(gòu)［37］。EC與Aβ17-36三聚體的對接結(jié)果顯示，平面的IPA基團(tuán)與Aβ三聚體中的F19發(fā)生π-π堆疊，DTPA基團(tuán)與I32發(fā)生分子間CH…O作用（圖10-C）。而且，相對于單體和寡聚體，EC與Aβ三聚體結(jié)合自由能（△G=-43.39 kJ/mol）和抑制常數(shù)均最低（Ki=24.85 nmol/L）［37］。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，EC減少了Aβ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲的毒性［38］。EC與寡聚體暴露的疏水性殘基發(fā)生π-π堆疊和氫鍵作用，引發(fā)兩者交替結(jié)合形成雙組分共聚物，并迅速將Aβ轉(zhuǎn)化為非纖維化結(jié)構(gòu)，從而破壞Aβ的自組裝（圖10-D）［37］。

圖10 EC對于Aβ聚集的影響以及兩者的相互作用A:EC的結(jié)構(gòu);B:Aβ40與EC在不同的濃度共孵育形成的TEM圖像[37];C:EC與Aβ17-36三聚體對接結(jié)果圖[37];D:EC可能的作用機(jī)制示意圖[37]

Trodusquemine由稠合的固醇環(huán)與聚胺精胺共價(jià)連接而成，可以取代細(xì)胞膜上的異常蛋白質(zhì)從而保持膜的完整性（圖11）［39-40］。Limbocker等［41］發(fā)現(xiàn)，trodusquemine提高單體依賴的二級成核過程從而促進(jìn)Aβ的聚集，使寡聚體轉(zhuǎn)換為毒性較低的纖維，此作用可能與trodusquemine結(jié)構(gòu)中的疏水性固醇環(huán)以及帶電的精胺基團(tuán)相關(guān)［41］。Tro‐dusquemine通過抑制寡聚體與細(xì)胞膜的相互作用降低對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性。在AD的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲模型中，無論是在Aβ42介導(dǎo)的表型發(fā)展前還是發(fā)展后使用trodusquemine均可以使轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲的的健康有所提高［41］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)trodusquemine促進(jìn)Aβ42聚集為低毒性的纖維，具有發(fā)展AD治療藥物的潛力。

圖11 Trodusquemine的結(jié)構(gòu)

多糖被發(fā)現(xiàn)具有阻止淀粉樣蛋白聚集的作用［42］，Liu等［42］探索了Ulvan的抗淀粉樣聚集活性。Ulvan是一種磺化酸性多糖，其由鼠李糖3-硫酸鹽、木糖、葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸組成［42］。Ulvan可以濃度依賴性地抑制Aβ纖維化，抑制Aβ40和Aβ42聚集的活性較好，IC50分別為1.14和1.66 mg/mL［42］。當(dāng)Ulvan的質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，Aβ42聚集的遲滯期延長至104 h，顯著降低初級成核速率。在2 mg/mL質(zhì)量濃度下分析Aβ40聚集過程，發(fā)現(xiàn)寡聚體特異性抗體A11信號一直維持較低的水平，而此過程中形成的聚合物呈短棒狀或球狀，對A11呈現(xiàn)免疫陰性，推測Ulvan能將Aβ40轉(zhuǎn)化為無毒性的聚合物［42］。圓二色譜顯示Ulvan完全抑制Aβ40向β折疊構(gòu)象的轉(zhuǎn)換，而是形成了無規(guī)卷曲狀態(tài)。Ulvan能劑量依賴性地緩解Aβ40誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，將成熟的Aβ40纖維降解為較小的、細(xì)胞毒性較低的棍狀或球狀的聚集體［42］。Ulvan是一種潛在的用于治療AD的神經(jīng)保護(hù)劑，但是其可能存在的免疫反應(yīng)性以及血腦屏障透過性問題尚待解決［42］。

3 毒性Aβ寡聚體的解離或清除分子

3.1 單克隆抗體

BAN2401是小鼠單克隆抗體mAb158的人源化IgG1，mAb158可以特異性地結(jié)合可溶性的，相對分子質(zhì)量較大的寡聚體如Aβ原纖維，對Aβ原纖維的選擇性至少為單體的1 000倍，是纖維的10~15倍［43-44］。利用AβArc（（Aβ1-42（E22G））原纖維免疫小鼠得到的mAb158［45］，體外抑制纖維的形成，通過與原纖維結(jié)合促進(jìn)病理性Aβ的星形膠質(zhì)細(xì)胞清除，降低由Aβ42原纖維引發(fā)的細(xì)胞毒性［46］。在AD小鼠模型中，mAb158同樣可以降低Aβ原纖維的水平，阻止Aβ的堆積［47］。作為mAb158的人源化版本，BAN2401表現(xiàn)出了相似的生物活性［43］。相對于aducanumab，BAN2401對可溶性的Aβ寡聚體結(jié)合力更強(qiáng)。在一項(xiàng)針對早期AD的臨床Ⅱ期試驗(yàn)中，高劑量的BAN2401療效顯著，相對于安慰劑組，以10 mg/kg劑量每月兩次靜脈注射可以使認(rèn)知下降減緩47%［48］。目前BAN2401正在進(jìn)行針對早期AD以及臨床前AD的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

Crenezumab是人源化IgG4單克隆抗體，與合成的可溶性的Aβ以及PS2APP轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)源性的Aβ寡聚體結(jié)合，對寡聚體的親和力至少是單體的10倍（0.4~0.6 vs 3.0~5.0 nmol/L）［49-52］。體外試驗(yàn)中，crenezumab可以抑制Aβ的聚集，促進(jìn)寡聚體的降解，緩解寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性［49，51］。臨床試驗(yàn)表明，crenezumab血管性水腫不良反應(yīng)發(fā)生率較低，推測是由于與血管中的不可溶淀粉樣斑塊結(jié)合弱，以及IgG4骨架降低Fcγ受體的激活從而減少炎癥的發(fā)生［49，51-53］。雖然兩項(xiàng)針對前驅(qū)至輕度AD的Ⅲ期臨床試驗(yàn)在2019年停止［49］，一項(xiàng)新的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)重新開展，用于常染色體顯性PSEN1 E280A突變家族性AD的個(gè)體治療和預(yù)防［54］。

3.2 短肽類解離劑

Wiesehan等［55］發(fā)現(xiàn)了由12個(gè)D型氨基酸組成的富含精氨酸的Aβ聚集抑制劑D3，既能抑制結(jié)構(gòu)規(guī)則的纖維的形成，也可以特異性結(jié)合Aβ寡聚體并使其清除，從而降低Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［56］。RD2是D3的錯(cuò)義序列（D型多肽序列：PTL‐HTHNRRRRR），相對于D3，RD2具有更高的口服生物利用度［57-58］，劑量依賴性地清除預(yù)先制備的Aβ寡聚體（IC50=8.4μmol/L），并且抑制Aβ纖維作為種子介導(dǎo)的聚集過程［56］。與Aβ42單獨(dú)孵育時(shí)比較，RD2和Aβ42共孵育可以將PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率從25%提升到76%，使SH-SY5Y的細(xì)胞存活率從65%提升到94%［56］。7個(gè)月大的雌性APP/PS1小鼠以5.3 mg/（kg·d）的劑量連續(xù)腹腔注射給藥3周可以提高小鼠的認(rèn)知能力［56］。微尺度熱電泳和表面等離子體共振技術(shù)測量顯示RD2與Aβ42單體具有納摩爾級的親和力［59］。分子模擬顯示RD2中的D-Arg與Aβ的Glu11、Glu22和Asp23產(chǎn)生靜電相互作用［60］，通過穩(wěn)定Aβ單體的固有無序構(gòu)象來清除有毒的Aβ寡聚體［59］。此外，RD2對胃腸道液、血漿和肝微粒體的代謝具有明顯的抵抗力，不會被人體D-氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化，從而保證口服的穩(wěn)定性［58］。目前，RD2正處于AD治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中。

3.3 小分子類解離劑

利福平是一種半合成抗生素，具有良好血腦屏障透過性，可以抑制Aβ聚集并緩解Aβ寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［61］。實(shí)驗(yàn)表明，利福平劑量依賴性地抑制Aβ40和Aβ42寡聚體的形成，同時(shí)伴有肽溶液中Aβ（可能是單體）數(shù)目的增加。利福平與Aβ40以4∶1比例共孵育時(shí)，完全抑制了Aβ40寡聚體的形成［61］。100μmol/L利福平顯著降低APPOSK轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的寡聚體，緩解寡聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，如降低線粒體中細(xì)胞色素C的釋放。但是NMR研究表明利福平不能與Aβ單體發(fā)生相互作用，結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)，推斷利福平可能與Aβ寡聚體結(jié)合促使其降解為可溶性的單體［61］。以1 mg/d劑量連續(xù)給藥1個(gè)月，利福平將17個(gè)月大的APPOSK小鼠的記憶力提高到與非轉(zhuǎn)基因小鼠相似的水平（APPOSK小鼠從8個(gè)月開始大腦中Aβ寡聚體的生成呈現(xiàn)年齡依賴性），而且轉(zhuǎn)基因小鼠腦切片中Aβ寡聚體顯著降低。以13個(gè)月大的Tg2576小鼠為研究對象（Tg2576小鼠在9~10月時(shí)開始淀粉樣堆積），每天口服給藥0.5 mg，持續(xù)1個(gè)月亦可以降低小鼠大腦中的Aβ寡聚體的數(shù)目，但是不改變Aβ堆積，這表明AD病理與Aβ寡聚體的關(guān)系更加密切［61］。除了對Aβ寡聚體的相關(guān)作用，利福平還可以抑制tau寡聚體誘導(dǎo)的毒性［61］，促進(jìn)Aβ從大腦的清除。綜上，作為一個(gè)廣譜藥物，利福平可以作為AD臨床癥狀出現(xiàn)前的潛在治療藥物［61］。

Nec-1可以調(diào)節(jié)RIPK1/RIPK3異二聚纖維復(fù)合物達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用［62］，基于Aβ聚合物與RIPK1/RIPK3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)相似性［63］，Yang等［64］發(fā)現(xiàn)Nec-1可以降解Aβ寡聚體，減少Aβ42寡聚體的毒性，表現(xiàn)出對神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用。但是去甲基化的Nec-1活性消失，表明3-甲基-2-巰基-4-咪唑啉酮結(jié)構(gòu)可能是靶向并降解Aβ的關(guān)鍵部分［64］。Nec-1和去甲基化的Nec-1結(jié)構(gòu)如圖12所示。將Nec-1與Aβ42單體共孵育5 d后，顯著減少Aβ的聚集且降低了寡聚體和纖維的數(shù)量［64］。對4個(gè)月大的APP/PS1雄性小鼠，以Nec-1（6.25 mg/kg）為期12周每周2次的給藥，減緩小鼠記憶力和學(xué)習(xí)能力的損傷，腦勻漿中的可溶性和不可溶性的Aβ42水平均低于對照組。在腦室內(nèi)注射Aβ42聚合物的8月大ICR小鼠模型中，預(yù)先給予Nec-1同樣可以緩解Aβ42誘導(dǎo)的短期記憶力損傷［64］。綜上，Nec-1在體外和體內(nèi)均通過降低Aβ寡聚體的含量，顯著抑制Aβ寡聚體誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。利用RIPK1/RIPK3復(fù)合物與Aβ之間的結(jié)構(gòu)相似性來探索Nec-1對AD治療的潛在作用為我們提供了合理設(shè)計(jì)靶向Aβ分子的新思路［64］。

圖12 Nec-1與其去甲基化后的結(jié)構(gòu)

4 小結(jié)與展望

針對毒性Aβ寡聚體，開發(fā)新型AD治療藥物已經(jīng)成為新藥研究的熱點(diǎn)之一。本文總結(jié)了本領(lǐng)域內(nèi)近年有代表性的3個(gè)發(fā)展方向，包括：（1）抑制Aβ肽聚集形成有毒的Aβ寡聚體。通過與Aβ單體相互作用穩(wěn)定蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)，避免向β折疊轉(zhuǎn)換，或競爭性作用于Aβ纖維表面的單體結(jié)合位點(diǎn)從而抑制寡聚體生成。需要明確的是，盡管有大量減少Aβ纖維化的研究，但是不可溶的Aβ纖維減少，可能會引起寡聚體濃度的上升，導(dǎo)致不良反應(yīng)增加。（2）促進(jìn)Aβ蛋白轉(zhuǎn)化成無毒或毒性較低的聚合物或共聚物，從而減少寡聚體的形成，減少神經(jīng)毒性。（3）促進(jìn)有毒的Aβ寡聚體解離或清除。Aβ寡聚體誘導(dǎo)特異性抗體是有效的Aβ寡聚體清除方法，但是有過度激活小膠質(zhì)細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，引發(fā)促炎應(yīng)答導(dǎo)致血管性水腫和腦微出血不良反應(yīng)的發(fā)生。相對于IgG1骨架，IgG4會減弱對于Fcγ受體的激活，降低副反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，減少對血管淀粉樣蛋白斑塊的選擇性可進(jìn)一步減輕血管性水腫等不良反應(yīng)。

目前，在臨床Ⅱ期試驗(yàn)中，針對Aβ寡聚體的抗體和小分子化合物顯示出積極的治療結(jié)果，結(jié)合最新的Aβ寡聚體病理機(jī)制研究進(jìn)展，可以預(yù)期基于Aβ寡聚體的AD治療新藥開發(fā)具有良好的發(fā)展前景和極大的潛力。