石桃雄 汪燕 黃娟 梁成剛

摘 要：種子大小和重量是蕎麥產(chǎn)量構(gòu)成的關(guān)鍵因素。該研究基于水稻粒重基因GW8，對(duì)苦蕎粒重基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，苦蕎粒重FtGW8基因CDS序列長(zhǎng)768bp，編碼的蛋白質(zhì)包含255個(gè)氨基酸，分子量為27.97kD，等電點(diǎn)為9.5，屬于親水性蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)，與水稻GW8蛋白相似。預(yù)測(cè)FtGW8蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，預(yù)測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。蛋白功能分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tGW8和水稻GW8蛋白均具有SBP功能域，表明其可能具有控制粒重的功能。該研究為苦蕎粒重基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：苦蕎;粒重基因;同源比對(duì)分析;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào) Q74 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）15-0029-05

Bioinformatics Analysis of FtGW8 for Grain Weight in Tartary Buckwheat

SHI Taoxiong et al.

（Buckwheat Technology Research Center， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： Seed size and weight are the important factors for grain yield in Tartary buckwheat. In this study， bioinformatics analysis of the grain weight gene in Tartary buckwheat were conducted based on gene GW8 for grain weight in rice. The results showed that GW8 protein structure showed high similarity between Tartary buckwheat and rice. The CDS length of FtGW8 is 768 bp， encoding 255 amino acids. The molecular weight of the FtGW8 protein is 27.97 kDa， and the theoretical pI is 9.5. FtGW8 belongs to hydrophilic protein， and does not have transmembrane domain. Main composition of the secondary structure of FtGW8 were α-helix and random coil. It was predicted that FtGW8 mainly located in the nucleus. The result of prediction showed three-dimensional structure of FtGW8 was similar with the secondary structure. The analysis of protein function showed that both FtGW8 and rice GW8 had a SBP functional domain. The results suggested that FtGW8 might control grain weight in Tartary buckwheat. This study will lay the foundation for the further cloning of seed weight genes in Tartary buckwheat.

Key words： Tartary buckwheat; Gain weight gene; Homology analysis; Protein structure

蕎麥（Fagopyrum Mill） 蛋白質(zhì)含量高，富含黃酮類化合物，是我國(guó)特色藥食兼用型小雜糧。蕎麥包含甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦蕎（Fagopyrum tataricum Gaertn）兩大栽培種[1-2]。與甜蕎相比，苦蕎總黃酮含量更高，抗氧化、降血脂、降血糖、降血壓等保健功能更顯著[3]。近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)苦蕎的需求日也益增加。但目前苦蕎產(chǎn)量低而不穩(wěn)，且由于苦蕎花朵較小，閉花受精，較難進(jìn)行人工去雄和有性雜交工作，利用雜種優(yōu)勢(shì)提高產(chǎn)量較為困難[4]。因此，如何提高苦蕎產(chǎn)量對(duì)于苦蕎種植面積的推廣和苦蕎特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展尤為重要。

粒重由籽粒的長(zhǎng)度、寬度、厚度決定，是作物的產(chǎn)量的決定性因素之一[5-6]，目前，水稻中已克隆出多個(gè)粒重相關(guān)基因[7-8]。水稻粒重基因GW8位于第8染色體，編碼Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白（squamosa promoter binding protein-like 16，OsSPL16），是一個(gè)包含SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，GW8可加快穎殼細(xì)胞的縱向分裂速度而引起籽粒變長(zhǎng)、穗長(zhǎng)增加、子房伸長(zhǎng)加快和籽粒灌漿加速，從而調(diào)控水稻粒和粒重[9]。GW8通過(guò)基因表達(dá)水平的變化調(diào)控粒型，較高的表達(dá)水平導(dǎo)致粒型變大，是粒型的正向調(diào)控因子[10]。目前，關(guān)于蕎麥中粒重相關(guān)基因克隆的研究還鮮有報(bào)道。為此，本研究以水稻GW8粒重基因?yàn)閰⒖?，通過(guò)序列比對(duì)程序獲得苦蕎同源基因FtGW8，利用生物信息學(xué)方法和工具對(duì)FtGW8蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及功能分析，為苦蕎粒重基因FtGW8的克隆及分子功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 GW8基因序列的同源分析 首先，在國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//www.ricedata.cn/index.htm）獲得水稻GW8基因序列（LOC_Os08g41940）和氨基酸序列?；诖税被嵝蛄?，通過(guò)Blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比對(duì)程序（參數(shù)默認(rèn)）檢索苦蕎參考基因組蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，將序列相似性最高的基因作為苦蕎的GW8基因。在檢索結(jié)果中，基因FtPinG0000496000.01編碼的蛋白序列與水稻GW8蛋白序列的序列相似性最高，為54%，命名為FtGW8。

1.2 蛋白理化特性及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Gene Structure Display Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）預(yù)測(cè)基因結(jié)構(gòu)。使用在線軟件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)（包括蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨酸組成、原子組成、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等）。使用在線軟件NPS@：SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用在線軟件ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性分析。使用在線軟件PHYRE2（http：//www.Sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。使用iPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）、TargetP1.1Server（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、WoLFPSORT（https：//wolfpsort.Hgc.jp/）對(duì)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。使用在線軟件SignalP4.1Server（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。使用在線軟件TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.Dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分析。使用在線軟件CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。使用NetPhos3.1（http：//www.Cbs.Dtu.dk/services/NetPhos/）對(duì)目的基因進(jìn)行磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎FtGW8基因的序列 利用水稻GW8基因的氨基酸序列在苦蕎參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，篩選獲得與水稻GW8相似度最高（54%）基因FtPinG0000496000.01的CDS序列，暫時(shí)命名為FtGW8。FtGW8基因CDS全長(zhǎng)768bp，編碼的蛋白含255個(gè)氨基酸。利用GSGD2.0在線軟件對(duì)FtGW8基因的DNA和CDS序列進(jìn)行分析，獲得FtGW8基因結(jié)構(gòu)圖（見(jiàn)圖1），結(jié)果表明，該基因含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。與水稻GW8基因結(jié)構(gòu)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tGW8基因與水稻GW8基因結(jié)構(gòu)基本一致（見(jiàn)圖2）。

2.2 蕎麥FtGW8蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

2.2.1 FtGW8蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 對(duì)FtGW8的氨基酸組成進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：苦蕎FtGW8的氨基酸組成中，絲氨酸（Ser）含量最高，占16.1%，其次為甘氨酸（Gly），占9.0%，含量最低的為色氨酸（Trp），占0.8%，缺少吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）2種氨基酸（見(jiàn)表1）。對(duì)FtGW8蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析表明，該蛋白分子量為27.97 kDa，理論等電點(diǎn)為9.5，分子式為C1190H1881N375O376S16，不穩(wěn)定系數(shù)為68.06，說(shuō)明該蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)>40）。FtGW8蛋白質(zhì)平均疏水性為-0.74（見(jiàn)表2），且氨基酸峰值在0以下比例明顯大于0以上的（見(jiàn)圖3），表明該蛋白可能為親水性蛋白。

2.2.2 FtGW8蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 利用NPS@：SOPMA。在線軟件獲得苦蕎FtGW8蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成圖（圖4）表明，F(xiàn)tGW8蛋白主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈4種構(gòu)象組成，其中有136個(gè)氨基酸（占總氨基酸數(shù)的53.3%）參與構(gòu)成無(wú)規(guī)則卷曲（Cc），氨基酸的占比最高;其次是α-螺旋（Hh），由61個(gè)氨基酸構(gòu)成，占總氨基酸數(shù)的23.92%;延伸鏈（Ee）和β-轉(zhuǎn)角（Tt）比例較少，分別占18.04%（46個(gè)氨基酸）、4.71%（12個(gè)氨基酸）。

2.2.3 FtGW8蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 利用在線軟件Phyre2，建模預(yù)測(cè)苦蕎FtGW8蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖5）。由圖5可知，F(xiàn)tGW8蛋白與PDB晶體庫(kù)中的GW蛋白模體（PDB號(hào)：d1s70a）最為同源，可信度達(dá)到100%。因此，推測(cè)苦蕎FtGW8蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)是由無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角組成，這一結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.2.4 FtGW8蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位 利用WoLFPSORT Prediction預(yù)測(cè)FtGW8蛋白定位于細(xì)胞核的系數(shù)為12（nucl：12），定位于葉綠體的系數(shù)為1（chlo：1），定位于其他細(xì)胞器的系數(shù)為1（extra：1）。使用iP-SORT在線軟件預(yù)測(cè)FtGW8的亞細(xì)胞定位，其結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，該蛋白不在葉綠體或線粒體中，也不含信號(hào)肽。綜上推測(cè)，苦蕎GW8蛋白位于細(xì)胞核的可能性較大。

2.2.5 FtGW8蛋白的信號(hào)肽 使用在線軟件SignalP 4.1對(duì)苦蕎FtGW8蛋白進(jìn)行信號(hào)肽分析，得到剪切位點(diǎn)系數(shù)（C-score）、綜合剪切位點(diǎn)系數(shù)（Y-score）、S信號(hào)肽系數(shù)（S-score）的值均為0（見(jiàn)圖7），說(shuō)明FtGW8蛋白沒(méi)有包含信號(hào)肽。

2.2.6 FtGW8蛋白的跨膜結(jié)構(gòu) 跨膜結(jié)構(gòu)域一般是20個(gè)左右的疏水氨基酸形成的α螺旋結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜上起錨定作用，是膜內(nèi)蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位。對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析，有助于了解蛋白的功能、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞中的作用部位[11]。利用TMHMM Server v 2.0對(duì)FtGW8蛋白跨膜性預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，GW8蛋白肽鏈全部位于膜外，不具有跨膜結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖8）。

2.2.7 FtGW8蛋白的結(jié)構(gòu)域 使用CD-search在線預(yù)測(cè)FtGW8蛋白的功能結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，該蛋白與水稻的結(jié)構(gòu)域基本一致[9]，在第21～95個(gè)氨基酸中含有一個(gè)SBP功能域（SQUAMOSA-promoter binding protein）（見(jiàn)圖9）。

2.2.8 FtGW8蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析 蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾方式之一，幾乎參與所有的生物學(xué)過(guò)程[12]。使用NetPhos 3.1預(yù)測(cè)FtGW8蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)，結(jié)果顯示，該蛋白共有37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中Ser（絲氨酸）30個(gè)，Thr（蘇氨酸）4個(gè)，Tyr（酪氨酸）3個(gè)（見(jiàn)圖10）。

3 討論與結(jié)論

粒重是影響作物產(chǎn)量的主要因素之一，而且是一個(gè)由多個(gè)基因與環(huán)境協(xié)同作用、共同控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。解析作物的粒重、粒長(zhǎng)、粒寬及粒厚的遺傳調(diào)控機(jī)理，對(duì)分子輔助高產(chǎn)育種有著重要意義。目前，在水稻[13-14]、玉米[15]、小麥[16]、高粱[17]等作物中已有一些關(guān)于粒重和粒型基因的相關(guān)報(bào)道。已克隆得到的水稻粒重GW8基因編碼一個(gè)含有SBP功能域的Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白OsSPL16，GW8能直接結(jié)合到GW7基因的啟動(dòng)子并調(diào)控其表達(dá)，GW8-GW7分子模塊在水稻粒重的調(diào)控中起正向調(diào)節(jié)因子的作用，在提高水稻產(chǎn)量的同時(shí)提高了稻米品質(zhì)[9]。本研究以水稻粒重GW8氨基酸序列為模板進(jìn)行同源分析，獲得了苦蕎FtGW8蛋白。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白是由255個(gè)氨基酸組成，分子量為27.97kD的親水性蛋白，其主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，不具有信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位軟件預(yù)測(cè)其定位于細(xì)胞核中。蛋白功能預(yù)測(cè)顯示，F(xiàn)tGW8蛋白含有一個(gè)SBP結(jié)構(gòu)域。這些預(yù)測(cè)結(jié)果與水稻GW8的蛋白結(jié)構(gòu)功能一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎FtGW8蛋白與水稻GW8蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域SBP，由此推測(cè)苦蕎FtGW8基因和水稻GW8基因具有相似的功能，即具有控制粒寬和粒重的功能。目前，水稻粒重調(diào)控基因GW8的熒光分子標(biāo)記已開(kāi)發(fā)出來(lái)，為在水稻中快速準(zhǔn)確鑒定其基因型提供了技術(shù)支持?？紤]到FtGW8對(duì)提高苦蕎產(chǎn)量的巨大潛在作用，在今后的研究中，一方面，有必要對(duì)FtGW8及基因家族的功能進(jìn)行深入研究，為苦蕎產(chǎn)量性狀的遺傳改良提供基礎(chǔ)和理論支撐;另一方面，應(yīng)借鑒水稻的做法，基于KASP等現(xiàn)代分子標(biāo)記技術(shù)，開(kāi)展基于基因的關(guān)聯(lián)分析，挖掘優(yōu)異的FtGW8等位基因，開(kāi)發(fā)FtGW8的標(biāo)記，為苦蕎分子標(biāo)記輔助高產(chǎn)育種提供標(biāo)記支撐。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060511）;貴州省科技支撐項(xiàng)目（黔科合ZC[2019]2298）;貴州省蕎麥種質(zhì)資源保育及創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)基金（黔教合KY[2017]002）。

作者簡(jiǎn)介：石桃雄（1980—），女，寧夏人，博士，副教授，研究方向：蕎麥種質(zhì)資源與育種。 *通訊作者 ?收稿日期：2021-04-26