羅躍軍，肖 潔，華瑞其，魏聞芮，陶園園，楊光友

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130)

近年來養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展迅猛，已成為畜牧業(yè)的重要組成部分。四川省是我國肉兔養(yǎng)殖大省和兔肉消耗大省，每年出欄量、存欄量、兔肉產(chǎn)量均占全國的1/3以上[1-2]。兔球蟲病(rabbit coccidiosis)是由艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲所引起的一種寄生性原蟲病。目前公認的兔球蟲有11個有效種[3]，其中斯氏艾美耳球蟲(Eimeriastiedai)是唯一一種侵害兔肝膽管上皮細胞的兔球蟲，亦是兔球蟲中最早發(fā)現(xiàn)、致病性最強的一種，常引起兔的發(fā)病與死亡。不同地域的斯氏艾美耳球蟲分離株的生物學(xué)特性描述存在差異，尤其是致病性差異較大[4-6]。為此，本試驗研究了斯氏艾美耳球蟲四川株生物學(xué)特性，以期為后續(xù)兔斯氏艾美耳球蟲病免疫及防控等研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物及蟲株 試驗用動物為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心自繁自養(yǎng)的新西蘭白兔。26日齡斷奶后飼養(yǎng)于經(jīng)過火焰烘烤消毒后的鐵絲籠中，飼料經(jīng)高溫干燥，飲水中加入抗球蟲藥地克珠利、磺胺氯吡嗪，自由采食。期間利用飽和食鹽水漂浮法檢查有無球蟲卵囊。感染前停藥7 d。

斯氏艾美耳球蟲四川株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心分離并保存。

1.1.2 主要試劑 飽和食鹽水為在1 000 mL沸水中加入380 g食用鹽，攪拌至完全溶解，然后冷卻至室溫，常溫保存?zhèn)溆谩?5 mg/mL重鉻酸鉀溶液為稱取10 g重鉻酸鉀加入400 mL蒸餾水?dāng)嚢柰耆芙猓乇４鎮(zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器 低溫高速離心機、微量移液器，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電子天平，上海儀器廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 致病性、免疫原性的試驗分組 將45只36日齡幼兔隨機分成9組，第1組為空白對照組，第2組～第9組為試驗組，其中第2組～第5組為致病性試驗組，于50日齡每只兔分別經(jīng)口感染1×104、5×104、1×105、2×105個孢子化卵囊；第6組～第9組為免疫原性試驗組，于36日齡每只兔分別口服接種5×102、5×103、1×104、5×104個孢子化卵囊，14 d后給予2×105個孢子化卵囊的感染量。

感染后觀察所有兔的精神狀態(tài)、飲食欲等；若出現(xiàn)死亡，記錄死亡時間并剖檢。感染后的8 d～28 d，每天利用麥克馬斯特法檢測各組平均克糞便卵囊數(shù)(oocysts per gramme，OPG) ，每隔7 d記錄1次體重。于感染后第28天處死所有試驗兔，觀察肝臟病變并記分，測定肝指數(shù)、相對增重率等。肝指數(shù)=肝重/體重×100%；相對增重率=試驗組平均增重/對照組平均增重×100%；病變記分參考孟慶玲[6]等提出的5分制：0分為無病變；1分表示表面有1個～10個粟粒狀結(jié)節(jié)；2分表示表面有11個～50個豆狀結(jié)節(jié)或部分融合為泡狀的大結(jié)節(jié)；3分表示表面有50個～100個泡狀大結(jié)節(jié)；4分表示肝高度腫脹，表面有許多融合的泡狀大結(jié)節(jié)；5分表示表面泡狀結(jié)節(jié)融合為團塊狀。利用SPSS22.0進行方差分析，對肝指數(shù)、平均增重、相對增重率進行組間的顯著性檢驗。

1.2.2 潛隱期、排卵高峰期、最短孢子化時間及卵囊大小的測定 感染后的8 d～28 d，每天利用飽和食鹽水漂浮法檢測并利用麥克馬斯特法測定每克糞便中的卵囊數(shù)，確定最小潛隱期、排卵高峰期。收集病死兔糞便和肝臟中的卵囊，加入適量25 mg/mL重鉻酸鉀溶液混勻，于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 h～6 h吸取少量混合液在顯微鏡下觀察卵囊的發(fā)育情況，直至卵囊中出現(xiàn)折光體，記錄最短孢子化時間。用顯微鏡在400倍鏡下測定100個以上的孢子化卵囊，記錄大小并計算形狀指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 致病性試驗結(jié)果

2.1.1 不同感染劑量的臨床癥狀 感染后各試驗組出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀：早期第2組、第3組癥狀不明顯，感染后期表現(xiàn)為食欲減退，精神沉郁，喜臥；消瘦，腹瀉偶有便秘；可視黏膜輕度黃染，腹圍稍有增大。而第4組、第5組在感染早期便出現(xiàn)明顯癥狀，主要表現(xiàn)為食欲廢絕，可視黏膜黃染，腹圍膨大，肝區(qū)觸診有痛感；后期出現(xiàn)死亡，死亡發(fā)生于感染后9 d～14 d，死亡率分別為20%和40%(表1)。

2.1.2 不同感染劑量的卵囊排出 除第1組外，各試驗組在感染后13 d開始排出卵囊，OPG在16 d～19 d快速上升，于22 d～23 d達到最高值，其后持續(xù)大量排出卵囊。不同劑量組的OPG有差異，第5組最多可達2.8×106個，其他依次是第4組、第3組，第2組(圖1)。

圖1 不同接種劑量OPG變化規(guī)律

2.1.3 不同感染劑量的相對增重率與肝指數(shù) 相較于第1組，感染后各試驗組增重均有不同程度降低：第2組、第3組增重影響輕微，相對增重率始終保持在80%以上，而第4組、第5組增重降低明顯，相對增重率最低僅17%，后期個別試驗兔出現(xiàn)負增長(圖2)。感染后28 d,處死各組試驗兔，計算肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，第2組肝指數(shù)顯著大于第1組(P<0.05)，其余3組肝指數(shù)與第1組肝指數(shù)差異極顯著(P<0.01)，肝指數(shù)與感染劑量成正相關(guān)(表1)。

表1 致病性試驗檢測指標

圖2 不同感染劑量組的相對增重率

2.1.4 不同感染劑量的病理變化與病變記分 剖檢發(fā)現(xiàn)，試驗組均出現(xiàn)明顯肝臟病理變化。第2組病變相對輕微，肝腫脹不明顯，有一定數(shù)量的粟粒狀或豆狀結(jié)節(jié)，有的有少許泡狀結(jié)節(jié)；第3組肝臟輕微腫脹，肝表面有一定量的泡狀大結(jié)節(jié)；第4組、第5組肝臟明顯腫脹，甚至占據(jù)腹腔的1/3，肝臟表面有大量融合的泡狀大結(jié)節(jié)，膽囊高度腫脹，充滿黃色滲出物，腹水明顯，膀胱積尿(圖3A)。各致病性試驗組的肝臟病變記分分別為2.9、3.4、4.1、4.3，隨感染劑量增加而增加(表1)。

2.2 免疫原性試驗

2.2.1 不同免疫劑量的臨床癥狀 免疫后各組并未出現(xiàn)明顯癥狀，但在經(jīng)口感染2×105個孢子化卵囊后先后出現(xiàn)與第5組相似的臨床癥狀。除第9組外，第6組、第7組、第8組均出現(xiàn)了死亡，第6組死亡率與第5組相同為40%，其余兩組死亡率分別是20%和20%，最早發(fā)生于免疫后7 d(表2)。

表2 免疫原性試驗檢測指標

2.2.2 不同免疫劑量的卵囊排出量 2×105個孢子化卵囊攻蟲后至處死期間，除第9組有減少卵囊排出外，其余各免疫組均不能減少甚至?xí)黾勇涯遗懦?圖4)。

A.2×105；B.空白對照組；C.5×102；D.5×104

圖4 不同免疫劑量組卵囊排出變化

2.2.3 相對增重率和肝指數(shù) 攻蟲后每7 d測定一次體重，計算相對增重率。第9組增重能持續(xù)保持高于第5組；第8組則基本與第5組相近；而其余各組增重均低于第5組(圖5)。處死時各免疫組增重均明顯低于第1組。從肝指數(shù)來看，雖然第7組、第8組、第9組一定程度低于第5組，但均遠遠高于第1組；而第6組甚至高于第5組(表2)。

圖5 不同免疫劑量組相對增重率

2.2.4 病理變化與病變記分 剖檢發(fā)現(xiàn)各免疫組均出現(xiàn)明顯肝臟病理變化。第9組病變相對輕微，肝臟稍腫脹，有一定數(shù)量的泡狀大結(jié)節(jié)，膽囊增生，內(nèi)容物尚有一定流動性(圖3D)。第7組、第8組肝臟病變與第5組相似，只是表面泡狀結(jié)節(jié)稍少。而第6組病變則更嚴重，肝臟高度腫脹呈淡黃色，表面充滿沿小膽管分布的融合的大泡狀結(jié)節(jié)；膽囊擴張，充滿細胞碎片和蟲體且無流動性(圖3C)。

2.3 潛隱期、排卵高峰期、最短孢子化時間及卵囊大小

本試驗中一次感染不同劑量斯氏艾美耳球蟲后最早于第13天排出卵囊，即最短潛隱期為13 d；排卵高峰為感染后的22 d～23 d，且22 d～28 d均排出大量卵囊(圖1)；斯氏艾美耳球蟲四川株在27 ℃恒溫培養(yǎng)41 h出現(xiàn)明顯的折光體，即最短孢子化時間為41 h，糞便和肝臟中分離的卵囊沒有明顯差別。試驗測定斯氏艾美耳球蟲四川株卵囊平均大小為36.2 μm(28.2 μm～38.1 μm)×19.9 μm(17.80 μm～22.3 μm)；卵囊指數(shù)為1.81。

3 討論

3.1 斯氏艾美耳球蟲四川株的致病性

各年齡階段的家兔均易感斯氏艾美耳球蟲，成年兔一般呈隱性感染，是帶蟲者亦是傳染源；幼兔感染時臨床癥狀較明顯，甚至死亡，嚴重危害養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展；感染造成肝功能指標、血液生化指標發(fā)生明顯改變，降低實驗兔的科研價值。斯氏艾美耳球蟲的致病性與蟲株、感染量密切相關(guān)。本試驗表明隨著感染量的增大，試驗兔會出現(xiàn)食欲廢絕，可視黏膜黃染，腹圍膨大，肝區(qū)觸診痛感等臨床癥狀；死亡率、卵囊排出量、肝指數(shù)、病變記分均會升高。其中死亡率最高可達40%，較阿拉爾株[4]、蘭州株[6]的60%偏低，略高于景謹?shù)萚7]報道的37.5%，而張海芬等[5]、陳士恩等[8]報道當(dāng)攻蟲劑量達到6.4×105個死亡率可達100%，且本試驗中死亡主要出現(xiàn)在感染的急性病變期；試驗兔肝指數(shù)最高可達22.97%，高于阿拉爾株[4]的17.9%，低于蘭州株[6]的28%；而相對增重會明顯減少，相比于對照組最高減少67.76%的增重，高于景謹?shù)萚7]報道的54.37%和張海芬等[5]報道的61.1%?？偟膩碚f，本試驗株的致病性較強。

除蟲株、感染量外，斯氏艾美耳球蟲的致病性還與家兔的日齡、品種密不可分。有研究表明，20日齡以下的仔兔由于缺乏分泌膽酸鹽的能力而不易感，斷奶后由于食物刺激幼兔分泌膽酸鹽的能力增強而變得易感[9-10]。目前斯氏艾美耳球蟲的致病性多是對于新西蘭白兔的研究，對于其他養(yǎng)殖品種如獺兔、長毛兔等的研究還待加強。

3.2 斯氏艾美耳球蟲四川株的免疫原性

關(guān)于斯氏艾美耳球蟲免疫原性的研究較少，井波等[4]設(shè)計了1×103個、5×103個共2個免疫梯度，但其免疫保護效果較差。本試驗設(shè)計了5×102個、5×103個、1×104個、5×104個共4個免疫梯度，結(jié)果顯示除5×104免疫組保護效果稍好外，其他各組免疫保護效果都不盡如人意，表明斯氏艾美耳球蟲四川株的免疫原性較差。另外有學(xué)者探索了不同的免疫方式，發(fā)現(xiàn)小劑量多次免疫或能提高免疫效果。對于斯氏艾美耳球蟲這種免疫原性較差的蟲種，或許通過篩選保護性抗原探索重組亞單位疫苗不失為一種選擇。

3.3 潛隱期、排卵囊高峰期、最短孢子化時間及卵囊大小

在公認的兔球蟲中，斯氏艾美耳球蟲個體較大，一般呈長卵圓形。斯氏艾美耳球蟲子孢子在腸內(nèi)脫囊需要移行并借助循環(huán)系統(tǒng)才能到達寄生部位，所以其潛隱期較腸球蟲長[11]，四川株的最小潛隱期是13 d，與已報道的阿拉爾株相似[12]，短于蘭州株的14 d[13]。

通過監(jiān)測感染后8 d～28 d的OPG，從13 d開始排出卵囊，在16 d～19 d卵囊排出量急劇增加，在22d ～23 d達到高峰并在此后幾天持續(xù)大量排出，可于22 d后收集大量卵囊。不同地理株球蟲的卵囊排出規(guī)律不同[14-15]，四川株的排卵高峰在22 d～23 d，略早于阿拉爾株的24 d[12]。除蟲株和試驗兔的個體差異外，卵囊排出量與感染量也存在直接關(guān)系，在感染量較少時，有充足未破壞的膽管上皮細胞為蟲體的發(fā)育提供條件，卵囊排出量與感染量成正相關(guān)；而當(dāng)感染量達到一定數(shù)量時，裂殖生殖產(chǎn)生的裂殖子超過了上皮細胞的數(shù)目，就會造成后續(xù)的裂殖生殖和配子生殖缺少足夠的發(fā)育條件，最終導(dǎo)致卵囊排出量反而下降。

本試驗收集了糞便和肝臟的斯氏艾美耳球蟲于27 ℃恒溫培養(yǎng)，折光體最早出現(xiàn)于41 h后，即最短孢子化時間為41 h，二者并無明顯差異。斯氏艾美耳球蟲對溫度較為敏感，10 ℃以下、45 ℃以上不能孵化，70 ℃作用10 min可殺死卵囊，最適宜的溫度是20 ℃～32 ℃[17]。本試驗蟲株的最短孢子化時間為41 h(27℃培養(yǎng))，而阿拉爾株為33 h(29 ℃培養(yǎng))[12]，蘭州株為35 h(29 ℃培養(yǎng))[13]。

本試驗測定的斯氏艾美耳球蟲四川株孢子化卵囊的平均大小為36.2 μm(28.2 μm～38.1 μm)×19.9 μm(17.80 μm～22.3 μm)，卵囊指數(shù)為1.81；而阿拉爾株的卵囊大小為36.4 μm(31.3 μm～38.7 μm)×22.8 μm(19.1 μm～27.8 μm)，卵囊指數(shù)僅為1.59[12]；蘭州株的卵囊大小為35.2 μm(32.3 μm～38.5 μm)×20.6 μm(18.6 μm～25.7 μm)，卵囊指數(shù)為1.71[13]，可見斯氏艾美耳球蟲四川株略小于其他分離株，但較修長。