吳顯平，楊重錦，2，遲盛仁，張志歡，張永紅，張 濤*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100070)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國和世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。研究表明，PRRSV感染仔豬不僅引起其呼吸系統(tǒng)癥狀和肺臟的損傷[1]，也會(huì)引起敗血癥和淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、胃臟、小腸等多種器官的明顯病理變化[2-3]。盡管通常認(rèn)為PRRSV對(duì)宿主感染具有嚴(yán)格的組織和細(xì)胞嗜性[4]，主要靶細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞[5]，但有關(guān)病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV病毒粒子在感染仔豬組織器官的分布相當(dāng)廣泛[6]。深入研究PRRSV感染對(duì)肺臟以外其他組織器官的影響，有助于更全面和深入地了解其致病機(jī)制。

腎臟是動(dòng)物體的重要排泄器官，機(jī)體大部分的代謝產(chǎn)物都要通過腎臟生成的尿液排泄，這也使之更易受到病毒感染。腎臟出血點(diǎn)和壞死點(diǎn)是PRRSV感染仔豬常見的剖檢變化[7]，研究PRRSV感染仔豬腎臟組織的病變和病毒粒子分布，對(duì)全面了解該病毒的致病性及做好“既病防變”具有重要意義。已有文獻(xiàn)雖表明PRRSV病毒粒子在腎臟組織內(nèi)有分布[6-7]，但對(duì)腎臟組織的感染細(xì)胞類型尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞鮮有關(guān)注。鑒于此，本試驗(yàn)以PRRSV JXA1株感染仔豬腎臟組織制作石蠟切片，深入研究了其病變特征和病毒粒子分布。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品 腎臟組織樣品取自于北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)長(zhǎng)白仔豬，約5周齡，平均體重約9.3 kg，健康狀況良好，試驗(yàn)前經(jīng)PRRSV抗原檢測(cè)均呈陰性。分為正常對(duì)照組和人工感染組，每組3頭仔豬。正常對(duì)照組仔豬常規(guī)飼養(yǎng)管理，試驗(yàn)期間均無明顯臨床癥狀；人工感染組仔豬經(jīng)滴鼻和肌肉注射途徑分別接種1 mL PRRSV JXA1株細(xì)胞培養(yǎng)液，接種后4 d～5 d出現(xiàn)明顯臨床癥狀，主要表現(xiàn)為體溫升高，食欲減少，鼻流清涕，發(fā)抖，扎堆，腹瀉，偶見呼吸困難，發(fā)病3 d后腋靜脈放血處死，剖檢可見人工感染組仔豬的腎臟淤血和腫大，表面有少量的出血點(diǎn)或出血灶。采取仔豬的腎臟組織投入40 mg/mL多聚甲醛溶液固定，備用。

1.1.2 主要試劑 蘇木精染色液(貨號(hào)C0105-1)、伊紅染色液(貨號(hào)C0105-2)，碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗PRRSV N蛋白多克隆抗體(貨號(hào)bs-23941R)、兔抗PRRSV GP5蛋白多克隆抗體(貨號(hào)bs-4504R)，北京博奧森生物科技有限公司產(chǎn)品；兔SP試劑盒(貨號(hào)SP-9001)、DAB染色試劑盒(貨號(hào)ZLI-9017)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(貨號(hào)C1032)，北京索來寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物組織石蠟脫水機(jī)(ZT-12M)、生物組織石蠟包埋機(jī)(YB-6LF)，湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；展片機(jī)(ZPJ-1A)，天津天利航空機(jī)電有限公司產(chǎn)品；切片機(jī)(RM2235)，德國Leica公司產(chǎn)品；倒置熒光數(shù)碼顯微分析系統(tǒng)(IX-71)，日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制備 每頭仔豬各取1塊經(jīng)40 mg/mL多聚甲醛溶液固定的腎臟組織，自來水充分漂洗去除固定劑，修剪為厚約0.5 cm、長(zhǎng)寬均約1 cm的小塊，參照文獻(xiàn)[8]中的石蠟切片制作方法，制作5 μm厚的切片，脫蠟后進(jìn)行HE或免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 HE染色 每頭豬的腎臟組織取3張已脫蠟的切片，按照常規(guī)方法進(jìn)行HE染色、脫水和透明，中性樹膠封片，鏡檢觀察、拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 將脫蠟后的切片置于檸檬酸鈉抗原修復(fù)液，用微波爐加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS充分浸洗，按照常規(guī)方法，對(duì)PRRSV GP5蛋白和N蛋白進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，脫水、透明，中性樹膠封片，鏡檢觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織的病理學(xué)變化

對(duì)石蠟切片的HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組仔豬腎臟組織的結(jié)構(gòu)未見異常(圖1A和圖1C)；人工感染組仔豬腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)均有明顯的充血和出血，腎小球和腎小囊腫脹擴(kuò)張，腎小管和腎間質(zhì)組織中有大量紅細(xì)胞，組織間隙變寬，部分腎小管的上皮細(xì)胞出現(xiàn)變形和脫落，部分腎小管內(nèi)可見均質(zhì)紅染的蛋白質(zhì)管型(圖1B和圖1D)。

A/C.正常對(duì)照組；B/D.人工感染組；標(biāo)尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)。無尾箭頭示變寬的組織間隙，箭頭示炎癥細(xì)胞，彎箭頭示充血，中空箭頭示擴(kuò)張的腎小球和腎小囊，星型示蛋白質(zhì)管型

2.2 腎臟組織PRRSV GP5蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

GP5蛋白是PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白中的唯一囊膜糖蛋白，是檢測(cè)PRRSV病毒粒子的常用抗原。對(duì)腎臟組織的PRRSV GP5免疫組織化學(xué)染色顯示，人工感染組仔豬腎臟組織的腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小囊上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)組織，PRRSV GP5蛋白免疫組織化學(xué)染色均呈棕黃色陽性著色(圖2A和圖2C)；正常對(duì)照組仔豬腎臟組織無明顯的陽性著色(圖2B和圖2D)。

A/C.正常對(duì)照組；B/D.人工感染組；標(biāo)尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)

2.3 腎臟組織PRRSV N蛋白的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證腎臟組織內(nèi)病毒粒子的分布及了解不同PRRSV抗原對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，本試驗(yàn)亦對(duì)PRRSV N蛋白進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組仔豬腎臟組織均無明顯的陽性著色(圖3A和圖3C)；PRRSV N蛋白免疫組織化學(xué)染色的著色部位與GP5蛋白類似，在人工感染組仔豬腎臟組織的腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、腎小管周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎間質(zhì)組織，均可見陽性著色，而腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的著色細(xì)胞數(shù)量較少，著色強(qiáng)度較低(圖3B和3D)。

3 討論

腎臟的腫大和彌散性出血是PRRSV感染仔豬常見的病理變化，顯示病毒對(duì)腎臟組織產(chǎn)生了明顯損傷。本試驗(yàn)通過HE染色檢測(cè)了人工感染PRRSV JXA1株仔豬腎臟組織病理變化，并且通過免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了其病毒粒子的分布，結(jié)果表明，人工感染仔豬腎臟的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了多種明顯的病理性變化，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)等腎臟組織的多種細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到了病毒抗原的存在。

有關(guān)PRRSV感染所致仔豬各組織器官病變及其組織內(nèi)病毒抗原分布的研究報(bào)道并不鮮見[9-11]，但無論自然發(fā)病還是人工感染PRRSV的仔豬，均較多關(guān)注于肺組織的病理學(xué)變化[12-13]，而對(duì)腎臟組織的專門性研究報(bào)道較少，多為與其他臟器一起的簡(jiǎn)要描述。另一方面，已有文獻(xiàn)[9-11,14]中試驗(yàn)所用的PRRSV毒株雖有所不同、仔豬日齡或品種也有差異，但結(jié)果大多表明，感染仔豬的腎臟組織均有明顯的充血或出血，這與本試驗(yàn)使用PRRSV JXA1株感染仔豬的試驗(yàn)結(jié)果一致，表明引起了腎臟毛細(xì)血管的明顯損傷和病理變化。PRRSV JXA1株分離自2006年暴發(fā)于我國南方部分省份的高致病性PRRSV感染仔豬，用其復(fù)制的人工感染仔豬模型，能夠更好地反映我國高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的仔豬臨床表現(xiàn)和病理變化，試驗(yàn)結(jié)果更有助于我國豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)病機(jī)制的闡明。

為了確定PRRSV在感染仔豬腎臟組織內(nèi)的定位，本試驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)了GP5蛋白和N蛋白2種病毒抗原。二者均是PRRSV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，其中，GP5是PRRSV的一種糖基化囊膜蛋白，N蛋白是含量最為豐富的核衣殼蛋白。PRRSV感染仔豬腎臟組織的病理變化在文獻(xiàn)報(bào)道中基本一致，而腎臟組織中病毒抗原分布的報(bào)道結(jié)果卻不盡相同。例如，李冰等[9]研究認(rèn)為，歐洲型PRRSV LNEU12株感染30日齡仔豬，其腎臟和肝臟中的病毒含量?jī)H次于肺臟和淋巴器官。張平英等[6]研究顯示，PRRSV SC-I株感染仔豬7 d后，肝臟和脾臟中未檢測(cè)到病毒抗原，而肺臟和腎臟中的病毒抗原陽性細(xì)胞水平近似，且腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞可見陽性著色。Cooper V L等[15]研究則認(rèn)為，盡管在感染后的任一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯示有明顯的腎臟血管內(nèi)皮組織的損傷，但是對(duì)病毒抗原的免疫金銀染色檢測(cè)卻未發(fā)現(xiàn)被PRRSV感染的內(nèi)皮細(xì)胞。本試驗(yàn)通過PRRSV GP5和N蛋白的免疫組織化學(xué)染色顯示，腎臟組織內(nèi)腎小球毛細(xì)血管和腎小管周圍毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞均可見陽性著色。本試驗(yàn)研究結(jié)果與張平英等[6]的報(bào)道相似，而與Cooper V L等[15]的試驗(yàn)結(jié)果不同，其原因是否與所用PRRSV毒株或免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法有關(guān)，尚需進(jìn)一步研究。另外，本試驗(yàn)研究顯示，PRRSV GP5抗原的免疫組織化學(xué)染色對(duì)腎臟組織內(nèi)皮細(xì)胞的陽性著色優(yōu)于N抗原，表明免疫組織化學(xué)檢測(cè)PRRSV的不同抗原對(duì)病毒粒子的顯示有一定影響。

A/C.正常對(duì)照組;B/D.人工感染組;標(biāo)尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)

綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果確證了PRRSV感染會(huì)引起嚴(yán)重的腎臟組織損傷，病毒抗原存在于腎血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等。血管組織不僅是營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸通道，血液循環(huán)也是病原體向動(dòng)物各組織臟器擴(kuò)散的途徑。因此，本試驗(yàn)結(jié)果提示，腎血管病變和血管內(nèi)皮細(xì)胞感染的研究應(yīng)是全面闡明PRRSV致病機(jī)制不可或缺的內(nèi)容。