邱子怡，孫 亮，趙 靜，馬紅霞,，高云航,，么乃全,*，徐鳳宇,,3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；3.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；4.呂梁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西呂梁 033000)

大腸埃希氏菌(E.coli)是人和動(dòng)物正常菌群成員，少數(shù)為病原菌，常致人或動(dòng)物腹瀉、奶牛子宮內(nèi)膜炎等疾病[1]?？股卦谥委熂邦A(yù)防細(xì)菌性疾病、挽救人和動(dòng)物生命及促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)中起到了重要作用。但隨著抗生素大量及不合理應(yīng)用，菌群失調(diào)、多重耐藥現(xiàn)象等越來(lái)越引起重視[2]，限制了抗生素在細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用[3]，新抗生素研發(fā)速度尚跟不上細(xì)菌快速耐藥性變異。中藥、微生態(tài)制劑、抗菌肽、噬菌體及其裂解酶等被認(rèn)為是治療抗性菌所致疾病的潛在替代或補(bǔ)充品。其中噬菌體作為高特異性、環(huán)境友好型細(xì)菌的天敵越來(lái)越被關(guān)注，如Kaabi S A G等[4]研究表明，在病原菌(大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、費(fèi)氏檸檬酸桿菌、卡他莫拉菌)感染小鼠模型45 min、5 h、8 h、14 h后，2倍感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)或1 MOI噬菌體可起到很好治療作用，10株噬菌體組成的雞尾酒可100%拯救最小致死量感染的實(shí)驗(yàn)小鼠；Dissanayake U等[5]用噬菌體F.O.P與氨芐青霉素分別治療大腸埃希氏菌O157:H7(Ec231株)感染的試驗(yàn)小鼠，結(jié)果在減少小鼠糞便中病原菌數(shù)量方面二者效果相近，F(xiàn).O.P治療組小鼠的腸道菌群與對(duì)照組相似。另外，因與致病病毒存在很多相似性，大腸埃希氏菌噬菌體作為糞便指示菌(fecal indicator bacteria，F(xiàn)IB)替代品被用于評(píng)估娛樂用水的衛(wèi)生質(zhì)量[6]；用外切葡萄糖酶標(biāo)記的堿性磷酸酶作為報(bào)告的T7噬菌體結(jié)合磁性微球技術(shù)、比色分析可用于檢測(cè)食品或水中大腸埃希氏菌[7]。本研究以牛源子宮內(nèi)膜炎型大腸埃希氏菌為宿主，分離毒性噬菌體，并研究其主要生物學(xué)特性，希望為使大腸埃希氏菌噬菌體能在治療大腸埃希氏菌所致疾病等方面發(fā)揮更好的作用提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 牛源子宮內(nèi)膜炎型大腸埃希氏菌CE株由吉林省反芻動(dòng)物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；指示菌為本實(shí)驗(yàn)室分離保存的C-1株、C-2株、C-3株、C-4株、C-5株、C-6株、C-7株、C-8株、C-9株、C-10株大腸埃希氏菌。

1.1.2 主要試劑 RNaseA、DNaseI，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、NcoⅠ、BlnⅠ、DraⅠ、Xhol Ⅰ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)液、LB上層培養(yǎng)基、含15 g/L瓊脂的下層LB培養(yǎng)基、2×LB培養(yǎng)液、SM液依標(biāo)準(zhǔn)方法配制。

1.1.3 主要儀器 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,長(zhǎng)春華益生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；超速離心機(jī)(Himac CP100MX)，日本日立公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(TEM-100CX)，日本TEOL LTD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體分離純化 參照文獻(xiàn)[8]中方法，將新采集的污水樣品室溫靜置2 h，取上清為分離材料，以CE株大腸埃希氏菌為宿主，分離、增殖、驗(yàn)證、純化噬菌體。

1.2.2 噬菌體電鏡觀察 取5.0×103PFU/mL噬菌體液0.2 mL，與宿主菌0.2 mL、氯化鈣(終濃度為1 mmol/L)按文獻(xiàn)[9]中方法鋪雙層平板，待培養(yǎng)出噬菌斑網(wǎng)絡(luò)后，加入2.5 mL SM液，4 ℃振蕩12 h，取SM液與菌、噬菌體混合物，12 000 r/min離心30 min，取上清30 μL滴于銅網(wǎng)表面，靜置30 s，加磷鎢酸(20 mg/mL，pH7.0)負(fù)染90 s，透射電鏡觀察。

1.2.3 噬菌體核酸類型鑒定與酶切分析 參照文獻(xiàn)[10]大規(guī)模培養(yǎng)噬菌體，提取基因組，分別用5種限制性內(nèi)切酶將噬菌體基因組酶切10 h，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 噬菌體效價(jià)及裂解譜測(cè)定 將宿主菌液100 μL、氯化鈣和100 μL適當(dāng)稀釋的噬菌體液混勻，加入47 ℃保溫的上層培養(yǎng)基快速混勻鋪雙層平板，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)12 h，計(jì)噬菌斑數(shù)量。

點(diǎn)滴法測(cè)噬菌體裂解譜：將10株受試菌分別均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，靜置5 min，滴加5 μL純化噬菌體液，37 ℃培養(yǎng)，觀察裂解情況。

1.2.5 噬菌體的熱及酸堿穩(wěn)定性測(cè)定 在40 ℃～75 ℃范圍內(nèi)，間隔5 ℃設(shè)置8個(gè)水浴溫度，用漂板將裝有1 mL噬菌體的1.5 mL EP管放入各水浴中，分別放置20、40、60 min后測(cè)效價(jià)。

在1.5 mL滅菌EP管中分別放入900 μL pH 3～13的液體培養(yǎng)基，在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min后，分別混入100 μL噬菌體，37 ℃孵育3 h后測(cè)定效價(jià)。

1.2.6 最佳MOI、一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]中方法測(cè)定EP-CE的最佳MOI、一步生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 體外抗菌活性檢測(cè) 根據(jù)最佳MOI稀釋EP-CE液和宿主菌液，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在A1空白孔中加入宿主菌液和EP-CE液各100 μL混勻，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h從左向右依次加入EP-CE液和宿主菌液各100 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)；100 μL宿主菌液與100 μL滅菌SM液混勻作對(duì)照。12 h后用酶標(biāo)儀測(cè)每孔OD 600 nm值。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離純化

將污水與CE株大腸埃希氏菌混合培養(yǎng)，6次富集后，經(jīng)點(diǎn)滴法驗(yàn)證得大腸埃希氏菌毒性噬菌體；經(jīng)7次挑單斑鋪雙層平板純化，得單一均勻、邊緣整齊、清晰透亮、直徑約1.5 mm的噬菌斑(圖1)，命名為EP-CE。

圖1 噬菌體EP-CE純化后的噬菌斑

2.2 噬菌體效價(jià)及裂解譜測(cè)定結(jié)果

經(jīng)雙層平板法測(cè)得純化后的EP-CE效價(jià)為1.06×109PFU/mL；用點(diǎn)滴法測(cè)得EP-CE除裂解宿主菌外，還可裂解C-6株指示菌。

2.3 噬菌體的電鏡觀察結(jié)果

透射電鏡觀察見EP-CE呈蝌蚪狀，有一條可收縮的尾，可見尾絲、尾板(圖2)，頭部長(zhǎng)約70.9 nm±0.35 nm，寬約68.4 nm±0.48 nm，尾部長(zhǎng)約90.1 nm±5.39 nm。

圖2 噬菌體EP-CE電鏡圖

2.4 噬菌體核酸類型鑒定與酶切分析

用限制性內(nèi)切酶BlnⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XhoⅠ、DraⅠ對(duì)EP-CE的基因組進(jìn)行酶切，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)，EP-CE有DraⅠ酶切位點(diǎn)，酶切后見6條帶(圖3)，與Marker比較后知EP-CE基因組大于50 kb。

2.5 噬菌體的熱及酸堿穩(wěn)定性

溫度對(duì)EP-CE的影響結(jié)果如圖4，在40 ℃～55 ℃，作用時(shí)間對(duì)EP-CE的影響不大；溫度高于55 ℃后，EP-CE效價(jià)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低；70 ℃作用60 min或溫度高于75 ℃時(shí)噬菌體被滅活。

圖4 溫度對(duì)噬菌體EP-CE的影響

pH對(duì)EP-CE的影響結(jié)果如圖5，在pH 7～10時(shí)， EP-CE的效價(jià)差異不顯著；在pH 5～7時(shí)，隨pH升高EP-CE效價(jià)也在增加；在pH 10～12時(shí)， EP-CE的效價(jià)隨著pH升高而降低；pH≤4或≥13時(shí)，EP-CE被滅活。

圖5 噬菌體EP-CE的酸堿穩(wěn)定性

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1.BamHⅠ酶切；2.BlnⅠ酶切；3.NcoⅠ酶切；4.DraⅠ酶切；5.XhoⅠ酶切

2.6 噬菌體的最佳MOI

當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí)噬菌體EP-CE效價(jià)為2.1×1010PFU/mL，在7個(gè)感染復(fù)數(shù)中最高，為最佳MOI(表1)。

表1 噬菌體EP-CE最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.7 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

由圖6可見EP-CE的復(fù)制規(guī)律。其感染大腸埃希氏菌CE株的潛伏期約30 min，30 min～120 min時(shí)EP-CE效價(jià)升高很快，為爆發(fā)期；120 min后EP-CE進(jìn)入穩(wěn)定期。計(jì)算其爆發(fā)量為26 PFU/cell。

圖6 噬菌體EP-EC的一步生長(zhǎng)曲線

2.8 噬菌體的體外抗菌活性

噬菌體EP-CE體外抗菌活性結(jié)果如圖7。在EP-CE與宿主菌共培養(yǎng)初始5 h內(nèi)，OD值保持穩(wěn)定；在5 h后，OD值隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，12 h時(shí)較對(duì)照組OD值低約0.5。

圖7 噬菌體EP-CE體外抗菌活性

3 討論

噬菌體在自然界中分布廣泛而豐富，池塘、湖泊、污水、人或動(dòng)物糞便中均可分離到。Gibson S B等[11]報(bào)道，大腸埃希氏菌噬菌體ΦHP3、ΦEC1、ΦCF2分別分離自鵝與鴨糞便混合物、犬糞、雞糞，ΦES12、ΦES17、ΦES19、ΦES21、ΦES26分離自未處理的污水。Bumunang E W等[12]以非O157產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC)為宿主，從牛糞中分離到10株噬菌體，即SA20RB、 SA79RD、SA126VB、SA30RD、SA32RD、SA35RD、SA21RB、SA80RD、SA12KD和SA91KD。Pacífico C等[13]從奧地利一個(gè)三級(jí)護(hù)理醫(yī)院的111份臨床樣品中分離到16株大腸埃希氏菌DSM 12242株的噬菌體，其中血液、尿液、氣管吸出物分離率分別為23.8%、20.5%、6.1%，腹部、肺部、胸膜、肩膀和膝蓋液、鼻腔拭子、靜脈導(dǎo)管樣品中未分離到大腸埃希氏菌噬菌體。本實(shí)驗(yàn)室曾從奶牛唾液和鼻黏液中分離到恥垢分支桿菌噬菌體，分離率11.8%[14]。說(shuō)明噬菌體的分離率與樣本來(lái)源關(guān)系密切。本試驗(yàn)前期試圖從牛子宮及陰道分泌物中分離大腸埃希氏菌噬菌體，但多次試驗(yàn)未得到陽(yáng)性結(jié)果，可能與子宮、陰道具有物理排除能力及局部黏膜免疫功能使其中細(xì)菌種類和數(shù)量隨分娩周期演變有關(guān)[15]。

生物學(xué)特性是噬菌體應(yīng)用的基礎(chǔ)，Gibson S B等[11]研究表明該團(tuán)隊(duì)分離的8株大腸埃希氏菌噬菌體潛伏期為22 min～40 min，爆發(fā)量為9.6 PFU/cell～80.7 PFU/cell，基因組大小為53 242 bp～170 254 bp，含74個(gè)～275個(gè)ORF，除ΦES17為短尾外，其余均屬肌尾病毒科，對(duì)89株大腸埃希氏菌分離株的裂解率為7%～58%。Bumunang E W等[12]分離的10株非O157 STEC噬菌體中肌尾噬菌體和長(zhǎng)尾噬菌體各半，基因組大小為44 kb～184.3 kb，對(duì)血清型O76:H34、O99:H9、O129:H23、O136:H30的STEC均不敏感。Pacífico C等[13]分離的16株大腸埃希氏菌噬菌體中除1株肌尾噬菌體vB-EcoM-12474V外，其余均為長(zhǎng)尾噬菌體，基因組大小為33.7 kb～114.6 kb，vB-EcoM-12474V頭部長(zhǎng)、寬約62 nm，可收縮的尾長(zhǎng)約155 nm。馬糞便來(lái)源的大腸埃希氏菌4s株噬菌體Paul[16]、Snoke[17]、Shashou[18]的基因組大小分別為79 429 bp、44.4 kb、44 155 bp。分離自廢水的感染大腸埃希氏菌O165:H8的毒性噬菌體ST20 基因組為44 517 bp，屬于長(zhǎng)尾噬菌體科[19]。Kaczorowska J等[20]檢測(cè)了從泉水、廢水、肌肉等樣品中分離到的19株大腸埃希氏菌噬菌體裂解譜，發(fā)現(xiàn)對(duì)受試的74株(72株ECOR收藏株及宋內(nèi)志賀氏菌53G、O157:H7 Δstx株)菌的裂解率為14%～54%不等，觀察其中的10株噬菌體，除JK16為長(zhǎng)尾噬菌體外，其余均屬肌尾噬菌體，10株噬菌體的基因組大小為51 854 bp～168 893 bp，最小的為長(zhǎng)尾噬菌體JK16?？梢娔壳耙逊蛛x的大腸埃希氏菌噬菌體中肌尾和長(zhǎng)尾噬菌體占優(yōu)勢(shì)。本研究分離的EP-CE為基因組大于50 kb的肌尾噬菌體，在40 ℃～55 ℃、pH 7～10環(huán)境中效價(jià)穩(wěn)定，最佳MOI為0.01，潛伏期約30 min，爆發(fā)期約90 min，爆發(fā)量為26 PFU/cell，對(duì)11株受試菌的裂解率為18%，說(shuō)明其特異性較強(qiáng)，體外裂解試驗(yàn)表明在與宿主菌共培養(yǎng)初始5 h內(nèi)殺菌活性較好。

雖然本研究為大腸埃希氏菌噬菌體在治療大腸埃希氏菌所致奶牛子宮內(nèi)膜炎等方面的應(yīng)用提供了資料，但引起子宮內(nèi)膜炎的病原菌較多，其中大腸埃希氏菌分離率約16.95%[15]，尚需將EP-CE與鏈球菌、金黃色葡萄球菌、棒狀桿菌等的噬菌體，或每種病原菌的裂解譜不同的多株噬菌體聯(lián)合應(yīng)用，方能起到更好的治療效果。