祖力亞·克力木江，努爾·庫(kù)爾瑪那里，阿不來(lái)，艾力西熱·買買提，王振寶，葉爾保勒，劉志強(qiáng)，劉一凡，巴音查汗·蓋力克*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心,新疆烏魯木齊 830013；3.伊寧海關(guān)，新疆伊寧 835000；4.察布查錫伯自治縣納達(dá)齊牛錄鄉(xiāng)政府畜牧獸醫(yī)站,新疆伊犁 835000)

虻科昆蟲俗稱牛虻，也有別名馬蠅，分類屬昆蟲綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、短角亞目(Brachycera)、虻科(Tabanidae)[1]。虻是伊氏錐蟲病的主要傳播媒介之一，馬屬動(dòng)物易感，同時(shí)還可引起馬傳染性貧血、牛等無(wú)漿體病[2]。虻在世界各地已有144屬近4 400已知種，迄今在我國(guó)已知種450種[3-4]。1758年瑞典學(xué)者Linnaeus首次建立了虻屬(Tabanus)，世界各國(guó)虻的研究很廣泛，特別是國(guó)外學(xué)者Philip C B和Stekhevn S等對(duì)尼泊爾、印度、日本、泰國(guó)等地區(qū)以及北美、歐洲地區(qū)進(jìn)行了不同程度的調(diào)查研究[5-6]。在國(guó)內(nèi)王遵明[7]、劉增加等[8]分別對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅省虻科進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查研究。伊氏錐蟲病在新疆地區(qū)有著不同程度的流行和發(fā)生，主要流行于阿勒泰地區(qū)和伊犁地區(qū)等地區(qū)[9]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)馬伊氏錐蟲病的檢測(cè)以血源性病原體為主，而媒介虻的鑒定及其攜帶病原情況未見相關(guān)報(bào)道[10]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)秋季原虻進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)了伊氏錐蟲DNA，以期為合理控制媒介虻和虻傳疾病的發(fā)生和流行提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢樣品 秋季原虻標(biāo)本采自伊犁河谷流域，通過(guò)馬引誘虻的方式抓捕，本次采集的大部分都是雌性，按地區(qū)、海拔將虻裝入干凈的瓶?jī)?nèi)，標(biāo)號(hào)帶回。

1.1.2 試劑 10×ExTaqbuffer(Mg2+free)、dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)、MgCl2(25 mmol/mL)、ExTaq(5 U/μL)，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；CTAB、三氯甲烷-異戊醇、異丙醇、三氯甲烷-Tris飽和酚,均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 LEICA M205 FA徠卡體視顯微鏡多重聚焦系統(tǒng)，德國(guó)徠卡儀器(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；RETSCH MM400混合冷凍混合球磨儀，費(fèi)爾德(上海)儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；AllegraTM X-22R Centrifuge多功能冷凍臺(tái)式離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；Biometre TProfessional TRIO 48三槽高速熱循環(huán)儀，上海昆士蘭生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；G:BOX EF凝膠成像分析儀。

1.2 方法

1.2.1 秋季原虻形態(tài)學(xué)鑒定 將虻進(jìn)行清洗處理，根據(jù)肉眼觀察到進(jìn)行分類，然后將虻置于700 mL/L乙醇下4 ℃保存，待后續(xù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[11]及分子生物學(xué)鑒定。

1.2.2 虻分子生物學(xué)鑒定及其攜帶馬伊氏錐蟲病檢測(cè)

1.2.2.1 引物的合成CO1基因引用于參照文獻(xiàn)[12]，18S rRNA引用于參照文獻(xiàn)[13]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.2.2 虻的基因組提取 將保存好的虻用9 g/L的氯化鈉溶液進(jìn)行浸泡10 min前處理，根據(jù)CTAB法提取虻的DNA并進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.3 虻的分子鑒定及其攜帶伊氏錐蟲檢測(cè) 反應(yīng)體系：2×TaqPCR混合液12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA1.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。虻的CO1基因PCR條件為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。馬伊氏錐蟲的PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照

2 結(jié)果

2.1 虻的形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)相關(guān)資料，借助體式顯微鏡對(duì)采集的156只虻的觸角、額、胸、腹、翅膀等部位的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為原虻屬秋季原虻種(圖1)。雌虻的體積較大，為19 mm～22 mm，觸角第三節(jié)的基環(huán)節(jié)較長(zhǎng)、端環(huán)節(jié)不多于四節(jié)、后足脛節(jié)有或無(wú)距、無(wú)單眼或者單眼不發(fā)達(dá)、額較寬、具中瘤、翅膀無(wú)云霧狀斑；額無(wú)單眼瘤；眼通常無(wú)毛；翅無(wú)橫帶，透明、翅橫脈處無(wú)暗點(diǎn)、翅R5室開放、額瘤于中瘤連接、盾片于小盾片同色、觸角第三節(jié)背突較小，第一、二節(jié)黑色；腹背具中，有明顯三角、下顎須細(xì)長(zhǎng)。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 虻的CO1基因擴(kuò)增 以虻的DNA為模板，擴(kuò)增虻的CO1基因，在653 bp左右出現(xiàn)條帶，結(jié)果見圖2。

2.2.2 虻源性伊氏錐蟲PCR擴(kuò)增 將提取虻攜帶馬伊氏錐蟲全基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢出205 bp的目的條帶，詳見圖3。攜帶馬伊氏錐蟲病的樣品有9只，陽(yáng)性率為5.7%。

A.翅膀(1.第一后室，2.中室97.4×)；B.頭部(3.額中瘤，4.額瘤94.7×)；C.觸角(5.第一節(jié)，6.第二節(jié)，7.基環(huán)節(jié)，8.端環(huán)節(jié)97.4×)；E.腹部(9.第一腹節(jié)，10第二腹節(jié)97.6×)；F.胸部(11.盾片，12.小盾片97.4×)；G.臉側(cè)(13.下顎須，14.喙97.4×)；H.前足(15.跗節(jié)，16.脛節(jié)，17.腿節(jié)97.4×)

2.2.3CO1基因序列比對(duì) 經(jīng)測(cè)序所采集的虻CO1基因序列長(zhǎng)度為653 bp，經(jīng)Blast軟件分析，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的丹麥株(MT584147.1)同源性為98%，確定為秋季原虻。

2.2.4 18S rRNA序列測(cè)定與比對(duì) 將所測(cè)虻源性伊氏錐蟲新疆株與國(guó)外株18S rRNA序列(登錄號(hào)為KY457409.1、AF317914.1、LC493170.1)利用Blast軟件分析進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與印度株、肯尼亞株、日本株同源性為98%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.陰性對(duì)照；2～3.秋季原虻的擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～8.部分秋季原虻的擴(kuò)增產(chǎn)物；9.陰性對(duì)照

3 討論

虻的傳統(tǒng)分類是通過(guò)光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察虻的形態(tài)特征完成初步鑒定。大多數(shù)虻種僅通過(guò)形態(tài)學(xué)特征就可以被識(shí)別，但也有些虻具有非常相似的外部特征，同時(shí)在樣品收集過(guò)程中非常容易遭到損害，導(dǎo)致錯(cuò)誤的鑒定[14]。虻在系統(tǒng)發(fā)育上存在的問(wèn)題不能僅通過(guò)一種檢測(cè)方法鑒定，而需要多種檢測(cè)手段聯(lián)合檢測(cè)。本試驗(yàn)通過(guò)結(jié)合應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)虻進(jìn)行了鑒定。

CO1基因不僅用于準(zhǔn)確的物種識(shí)別，在揭示遺傳多樣性和生物型、基因型的存在等都受到了廣泛的關(guān)注，并發(fā)揮著非常重要的作用，能夠在物種水平和物種復(fù)合體內(nèi)解決分類學(xué)上的問(wèn)題[15]。所以，本試驗(yàn)參考Folmer M等[12]設(shè)計(jì)的引物，經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，所測(cè)定的虻為秋季原虻。

伊氏錐蟲病是一種血液原蟲病，其研究要從病原體、媒介及易感動(dòng)物進(jìn)行分析。目前對(duì)伊氏錐蟲病的檢測(cè)，Seiringer P等[16]用4種檢測(cè)伊氏錐蟲的PCR方法進(jìn)行了對(duì)比，國(guó)內(nèi)陸紹紅等[17]以錐蟲分泌抗原的納米抗體為材料，建立了基于納米抗體的剛果錐蟲循環(huán)抗原快速試紙條檢測(cè)方法。在媒介方面，對(duì)于虻源性病原的檢測(cè)較少。由于伊犁河谷地理環(huán)境、氣候以及動(dòng)物資源充足對(duì)于虻的生長(zhǎng)和生存提供了很大的便利，易造成伊氏錐蟲病的流行。本試驗(yàn)對(duì)伊犁河谷區(qū)域所采集的虻樣品進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定和攜帶病原檢測(cè)，對(duì)該區(qū)域的虻及虻傳播性疫病的綜合防控奠定了基礎(chǔ)。