易蓉鑫，楊齊之賢，梁易曉，周祖靈，孫永科，楊玉艾

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650000)

良好的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是成功培養(yǎng)細(xì)胞的前提，目前細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學(xué)中發(fā)展得十分迅速的一項(xiàng)重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是研究病毒與研制疫苗等生物產(chǎn)品的基礎(chǔ)技術(shù)[1-3]。

人胚腎293細(xì)胞(HEK-293細(xì)胞)是最常用于包裝及擴(kuò)增腺病毒載體的工具細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體污染是最常見(jiàn)、不易察覺(jué)和干擾試驗(yàn)結(jié)果的污染物，對(duì)后續(xù)的科研和生產(chǎn)極其不利[4]。據(jù)調(diào)查，實(shí)驗(yàn)室中30%～60%的細(xì)胞株都被支原體污染過(guò)，是細(xì)胞培養(yǎng)，特別是傳代細(xì)胞的培養(yǎng)中的嚴(yán)重問(wèn)題，其污染來(lái)源主要是操作者及小牛血清。支原體的檢測(cè)及清除方法雖然眾多，但比較復(fù)雜費(fèi)時(shí)，且難以清除干凈，本研究采用PCR及DNA熒光染色法檢測(cè)支原體污染，目的是應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類2種藥物有效地清除支原體污染，為更好地展開(kāi)細(xì)胞研究奠定基礎(chǔ)[5-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和犢牛血清 試驗(yàn)中所用細(xì)胞為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞保存中心存有的HEK-293細(xì)胞及其傳代細(xì)胞；胎牛血清由美國(guó)BI公司生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM，High Glucose)和胰酶、細(xì)胞凍存液、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素TransMyco-1和四環(huán)素類衍生物TransMyco-2(Lot#N10923)、支原體檢測(cè)試劑盒(TransDetect PCR Mycoplasma Detection Kit)，Transgen公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO),華美生物工程公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 倒置相差顯微鏡，明美光電有限公司產(chǎn)品；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美墨爾特貿(mào)易有限公司產(chǎn)品； PCR儀，東勝國(guó)際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；電泳凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，帝肯貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

1.2.1.1 復(fù)蘇 從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，立即投入37 ℃水浴，不斷搖動(dòng)至迅速融化，待融化后用移液槍輕輕吸出，加入到事先37 ℃預(yù)熱好的培養(yǎng)液中，稍微吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，去除上清，加入適量培養(yǎng)液溫和混勻制成細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/mL的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.1.2 傳代 原代培養(yǎng)的HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合度時(shí)，用PBS緩沖液緩慢沖洗2次，250 mg/mL的胰酶消化1 min～2 min，輕輕吹打使細(xì)胞脫壁、懸浮、分散，獲得細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min后去除上清，加入適量培養(yǎng)液溫和混勻，傳代擴(kuò)增細(xì)胞。

1.2.1.3 凍存 傳代的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，大概60%～70%融合度時(shí)，可以進(jìn)行凍存，凍存前1 d細(xì)胞換液，貼壁的細(xì)胞用常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min后去除上清，使用凍存液，按照凍存管大小分裝0.5 mL～1.5 mL每管，擰緊管口，標(biāo)注好細(xì)胞名稱及凍存時(shí)間，在4 ℃放置30 min后存放至-80 ℃保存。長(zhǎng)期保存則需要放置于液氮罐中保存。

1.2.2 藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)藥物IC50。取細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK-293細(xì)胞100 μL，接種于96孔培養(yǎng)板，隨機(jī)分成空白對(duì)照組、TransMyco-1組、TransMyco-2組及聯(lián)合用藥組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入相同的培養(yǎng)基，TransMyco-1組和TransMyco-2組均按照1∶50、1∶100、1∶200的比例配制，聯(lián)合用藥組兩種藥物均按照1∶100加入，每孔100 μL設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度培養(yǎng)72 h后，加入MMT培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心10 min棄上清，加入DMSO置搖床上充分混勻1 h。

在酶標(biāo)儀上以530 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光光度OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(每組平均OD值-試劑空白/對(duì)照組OD值-試劑空白)×100%，用細(xì)胞存活率做出量效曲線，用作圖法得出不同用藥方式與濃度對(duì)細(xì)胞的IC50。

1.2.3 支原體的清除 將解凍融化至室溫的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素TransMyco-1和四環(huán)素類抗生素TransMyco-2分別以1∶100的比例加入到無(wú)雙抗的培養(yǎng)基中，配制成10 mg/mL藥物濃度的培養(yǎng)液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK-293細(xì)胞，設(shè)置5個(gè)分組，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，飽和濕度下培養(yǎng)24 h，采用以下3種方案清除支原體。

(1)分別單獨(dú)使用：在支原體污染的細(xì)胞傳代或繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，換上添加了藥物的培養(yǎng)基，待細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)融合度80%時(shí)，可以取樣培養(yǎng)液進(jìn)行支原體檢測(cè)。

(2)聯(lián)合使用：在支原體污染的細(xì)胞傳代或繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，換上同時(shí)添加了2種藥物的培養(yǎng)基，待細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)融合度80%時(shí)，取樣培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)。

A.傳代3次的細(xì)胞；B.傳代5次的細(xì)胞

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陰性對(duì)照；2～5.待試驗(yàn)的HEK-293細(xì)胞PCR檢測(cè)結(jié)果；6.陽(yáng)性對(duì)照

(3)交替使用：在支原體污染的細(xì)胞傳代或繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，換上添加了TransMyco-1的培養(yǎng)基，并保持污染的細(xì)胞在此環(huán)境下培養(yǎng)4 d，之后換上添加了TransMyco-2的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 d，以上操作作為一個(gè)周期，重復(fù)兩個(gè)循環(huán)周期后，取樣培養(yǎng)液進(jìn)行支原體檢測(cè)。

含有抗生素的培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)現(xiàn)配現(xiàn)用，在短期內(nèi)一個(gè)周使用，避免反復(fù)凍融。另外，HEK-293細(xì)胞增殖較快，為了降低傳代次數(shù)，可以適當(dāng)降低細(xì)胞接種密度，使藥物充分作用。留取0、4、8、12、16 h的細(xì)胞及培養(yǎng)液進(jìn)行支原體檢測(cè)。

1.2.4 支原體檢測(cè)試劑盒的使用 使用支原體檢測(cè)試劑盒(TransDetect PCR Mycoplasma Detection Kit)進(jìn)行操作：取40 μL細(xì)胞培養(yǎng)液放入干凈的PCR管內(nèi)，置于PCR儀中95 ℃熱處理10 min后作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系：模板2 μL，水7.6 μL，PCR預(yù)混液10 μL，支原體引物0.4 μL，總計(jì)20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。取10 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析并拍照，通過(guò)與陰陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果的比較，確定支原體的污染情況，陽(yáng)性條帶大小約350 bp。

1.2.5 DNA熒光染色法檢測(cè)支原體 檢測(cè)分以下6個(gè)步驟進(jìn)行：①首先，將待測(cè)細(xì)胞接種到蓋玻片上，用培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，采用有支原體污染的HEK-293細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)支原體污染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照；②吸出培養(yǎng)液，用1∶3的冰醋酸/甲醇固定液固定15 min，重復(fù)1次，吸出固定液，室溫干燥；③用PBS稀釋Hoechst 33258儲(chǔ)存液，使?jié)舛葹? μg/mL，將染液滴加到固定好的細(xì)胞上，室溫避光染色30 min；④用雙蒸水浸泡洗滌5 min，重復(fù)3次；⑤滴加1滴含有10 mL/L甘油的檸檬酸緩沖液到細(xì)胞上封片，將有細(xì)胞的一面向下，覆蓋在載玻片上；⑥在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光分布狀態(tài)，判斷有無(wú)支原體污染及污染程度。

2 結(jié)果

2.1 支原體污染的HEK-293細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，傳代HEK293細(xì)胞狀態(tài)不佳，細(xì)胞邊緣模糊，生物特性差，生長(zhǎng)緩慢，隨著培養(yǎng)代次的增加，細(xì)胞逐漸死亡消失(圖1)，4個(gè)分組的HEK-293細(xì)胞PCR電泳結(jié)果顯示，支原體檢測(cè)均為陽(yáng)性(圖2)。

2.2 不同藥物對(duì)細(xì)胞存活率的影響

采用MTT法檢測(cè)藥物IC50，Transmyco-1和Transmyco-2單獨(dú)使用對(duì)HEK-293細(xì)胞的生長(zhǎng)有輕微影響，其作用呈濃度依賴性；2種藥物聯(lián)合使用時(shí)，有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用，細(xì)胞存活率減低(圖3)。

圖3 兩種藥物對(duì)HEK-293細(xì)胞的存活率-藥物濃度曲線

2.3 用藥后的細(xì)胞狀態(tài)及PCR檢測(cè)結(jié)果

在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入2種抗生素藥物按1∶100進(jìn)行單獨(dú)使用、聯(lián)合使用及交替使用的處理，在處理前及處理后4、8、12、16 d分別取細(xì)胞培養(yǎng)液留樣，用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示2種抗生素藥物交替使用的治療效果最為顯著。

未使用藥物處理的HEK-293細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，均存在支原體污染，檢測(cè)結(jié)果顯示陽(yáng)性；用1∶100的TransMyco-1和TransMyco-2分別單獨(dú)處理后8 d后樣本中仍顯示弱陽(yáng)性，繼續(xù)處理8 d后轉(zhuǎn)為陰性；2種藥物的聯(lián)合使用顯示12 d后陰性，但交替使用效果顯著，12 d后電泳結(jié)果顯示轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?圖4)。

A.4 d;B.8 d;C.12 d;D.16 d;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1.陰性對(duì)照；2.TransMyco-1處理的PCR檢測(cè)結(jié)果；3.TransMyco-2處理的PCR檢測(cè)結(jié)果；4.2種藥物聯(lián)合使用處理的PCR檢測(cè)結(jié)果；5.2種藥物交替使用處理的PCR檢測(cè)結(jié)果；6.陽(yáng)性對(duì)照

倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，2種藥物聯(lián)合使用后細(xì)胞損傷較大，生長(zhǎng)緩慢狀態(tài)較差(圖5A)；交替使用時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，狀態(tài)良好(圖5B)。

A.聯(lián)合用藥的細(xì)胞狀態(tài)；B.交替用藥的細(xì)胞狀態(tài)A.Cell status of combination therapy;B.Cell status of alternating therapy

2.4 DNA熒光染色法檢測(cè)結(jié)果

用Hoechst 33258熒光染色的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，染色劑會(huì)結(jié)合到DNA中A-T含量較高的區(qū)域，在熒光顯微鏡下發(fā)藍(lán)光。無(wú)支原體污染的細(xì)胞只有細(xì)胞核顯色，細(xì)胞表面及周圍清晰干凈，無(wú)熒光小點(diǎn)(圖6)。

圖6 無(wú)支原體污染的HEK-293細(xì)胞(40×)

有支原體污染的HEK-293細(xì)胞，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)及其周圍均可見(jiàn)散在的藍(lán)色熒光顆粒或絲狀小點(diǎn)，形狀一致，其密集程度與污染呈正相關(guān)(圖7)。

圖7 支原體污染的HEK-293細(xì)胞(40×)

3 討論

支原體的污染十分常見(jiàn)且污染早期不容易被發(fā)現(xiàn)，它會(huì)吸附在細(xì)胞的表面，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞信號(hào)的傳遞；消耗細(xì)胞的核苷酸庫(kù)，引起細(xì)胞染色體的異常變化，同時(shí)還會(huì)改變細(xì)胞的分泌功能，降低其活性[9]。

目前對(duì)支原體的檢測(cè)和治療方法雖然眾多，但單一的方法都不夠理想，本試驗(yàn)采用支原體PCR檢測(cè)試劑盒，特異性高，操作簡(jiǎn)便迅速，對(duì)于處理以后的細(xì)胞再進(jìn)行DNA熒光檢測(cè)，提高支原體的清除的確定性[10-11]。通過(guò)MTT試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化了細(xì)胞的用藥量，在治療支原體的基礎(chǔ)上，保證不影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)。與常規(guī)的支原體清除方法相比，靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，且避免了假陽(yáng)性、支原體清除不徹底、藥物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)等問(wèn)題。

隨著技術(shù)的發(fā)展，新的檢測(cè)手段在不斷建立和完善，但對(duì)于支原體的治療與去除尚無(wú)完美的方法，本試驗(yàn)采用通過(guò)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素TransMyco-1和四環(huán)素類抗生素TransMyco-2的使用，探索2種藥物不同作用方式之間的差別及效果，為細(xì)胞支原體污染的凈化提供新的治療思路。雖然不同的方法均能有效控制支原體污染的問(wèn)題，但支原體主要來(lái)源于操作者的呼吸道和小牛血清，因此在探索新的清除方法的同時(shí)，應(yīng)當(dāng)著重于支原體污染的預(yù)防[12]。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用抗生素處理污染的細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，存在支原體污染復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。因此并不能立即停藥，需要再繼續(xù)加藥處理[13]。通過(guò)Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)交替用藥的支原體清除效果最佳，藥物單獨(dú)作用處理的細(xì)胞疑似處理不徹底，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸變差，且同一種抗生素藥物使用次數(shù)過(guò)多或是使用時(shí)間超過(guò)6周時(shí)，一些細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)耐藥性，支原體污染開(kāi)始重新反復(fù)出現(xiàn)，可以考慮采取不同藥物交替使用，輪流對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。在本試驗(yàn)中可以看到，交替使用的效果相比其他用藥方式治療效果也更為顯著[14]。綜上，可以考慮使用不同種抗生素交替使用來(lái)治療支原體的污染，可取得較為顯著的效果。

細(xì)胞培養(yǎng)需要一個(gè)高度清潔的環(huán)境，但各種污染是難以避免的，除嚴(yán)格按照規(guī)范的實(shí)驗(yàn)程序操作以外，應(yīng)當(dāng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞及培養(yǎng)物進(jìn)行支原體檢測(cè)，做到有效的預(yù)防與控制[15-18]。通過(guò)本次試驗(yàn)，使得細(xì)胞支原體污染得以控制，希望從中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)方法，為潛在支原體的預(yù)防與清除提供依據(jù)，以便更好地開(kāi)展各項(xiàng)細(xì)胞研究奠定基礎(chǔ)[19-21]。