馬傳貴 張志秀 李紅芳

【摘要】目的：以姬松茸-灰樹花-蛹蟲草制成的復(fù)合多糖，以免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能為主要指標(biāo)，探究比較復(fù)合多糖與各單一多糖對(duì)免疫低下小鼠免疫調(diào)節(jié)功能影響的差別。方法：通過(guò)檢測(cè)小鼠細(xì)胞免疫功能和體液免疫功能，并對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果：復(fù)合多糖組小鼠的體質(zhì)量高于同性別的其他單一多糖組；各多糖組小鼠胸腺系數(shù)均有不同程度的升高，其中復(fù)方多糖組效果最好；復(fù)合多糖組IgG、IgA、IgM、sIgA水平升高效果，較單一多糖組血清好；在血液、脾臟T細(xì)胞各亞群及比值方面，復(fù)合多糖升高較好，血液CD4-CD8+降低效果亦優(yōu)于單一多糖組；復(fù)合多糖組T淋巴細(xì)胞增殖率高于單一多糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：復(fù)合多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和T淋巴細(xì)胞功能有較好的改善作用，能顯著改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

【關(guān)鍵詞】姬松茸；灰樹花；蛹蟲草；復(fù)合多糖；小鼠；免疫功能

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]2096-5249（2021）03-0005-04

Effects of compound polysaccharides from Agaricus blazei murrill- Griflola frondosa-Cordyceps militaris on the immunological function in immunosuppressive mice

MA Chuan-gui1， ZHANG Zhi-xiu1， LI Hong-fang2* （1. Beijing Jingcheng Biotechnology Company Limited， Beijing 102600， Chnia； 2. Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming Yunnan 650500， Chnia）

[Abstract] Objective： To compare the effect of compound polysaccharide and single polysaccharide on the immunoregulation of immunocompromised mice. Methods： the cellular immune function and humoral immune function of mice were tested. Results： the body weight of mice in compound polysaccharide group was higher than that of other single polysaccharide groups of the same sex； the thymus coefficient of mice in each polysaccharide group increased to different degrees， and the effect of compound polysaccharide group was the best； the effect of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group in serum IgG， IgA， IgM， SIgA； the effect of compound polysaccharide was better than that of single polysaccharide in blood CD4 / CD8， spleen CD4 / CD8， and blood CD4-CD8 +The results showed that the effect of decreasing was good， the effect of increasing T-lymphocyte proliferation rate of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： the compound polysaccharide has a better effect on improving the cellular immunity， humoral immunity and T lymphocyte function of mice， and can significantly improve the immune function of immunosuppressed mice.

[Key words] Agaricus blazei murrill； Griflola frondosa； Cordyceps militaris； Compound polysaccharides； mice； immunological function

多糖廣泛存在于動(dòng)植物以及真菌體內(nèi)，組成和結(jié)構(gòu)上的差異亦使其生物學(xué)活性復(fù)雜多樣，植物多糖分子存在2-10個(gè)單糖聚合而成的寡糖片段，通過(guò)與蛋白受體結(jié)合，激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等免疫細(xì)胞表面存在的多糖受體，產(chǎn)生類似酶作用過(guò)程的效果，進(jìn)而影響淋巴細(xì)胞基因表達(dá)，促使T、B淋巴細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌、活化補(bǔ)體，促進(jìn)抗體產(chǎn)生等[1][2][3]。姬松茸多糖有廣泛的藥理活性，在抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗皰疹病毒、影響造血功能等方面優(yōu)勢(shì)突出[4]；灰樹花多糖具有腫瘤增殖抑制、免疫調(diào)節(jié)作用，較好的降糖和抑菌、抗病毒作用[5]；蛹蟲草多糖具有保肝抗肝炎、抗氧化、抗癌等生物活性，是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑[6]。研究表明，單一活性多糖按優(yōu)化的組合比例組合，其生物活性更強(qiáng)。本研究的復(fù)合多糖由姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖根據(jù)多糖含量按1：1：1比例組成，以免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能為主要指標(biāo)探究比較姬松茸-灰樹花-蛹蟲草的復(fù)合多糖與各單一多糖對(duì)免疫低下小鼠免疫調(diào)節(jié)功能影響的差別，從而為復(fù)合多糖在增強(qiáng)免疫功能方面是否有相互協(xié)同作用提供思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 食用菌復(fù)合多糖（姬松茸-灰樹花-蛹蟲草）、姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖均由我機(jī)構(gòu)提供；4通道AccuriC6流式細(xì)胞儀、流式抗體CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PerCP熒光抗體及同型對(duì)照抗體、校準(zhǔn)微球、紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)于美國(guó)BD公司；小鼠免疫球蛋白檢測(cè)IgG、IgA、IgM試劑盒購(gòu)于美國(guó)ICLLAB公司；刀豆蛋白（ConA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK8由我機(jī)構(gòu)提供，環(huán)磷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：C3250000），為山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；Sysmex XT-2000iv血液分析儀專用試劑購(gòu)自日本Sysmex公司。

1.2供試動(dòng)物 健康雌雄小鼠120只，8～10周齡，雌雄各半，體重為（20±2）g，由我機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（京）2018-0010。晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～22℃。

1.3試驗(yàn)方法 ①動(dòng)物分組及處理[7]：將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)合多糖組及姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖3個(gè)單一多糖組，每組20只小鼠，雌雄各10只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，灌胃蒸餾水，體積為10mL/kg；各多糖組分別相應(yīng)等體積多糖成品灌胃，連續(xù)31d；除正常對(duì)照組外，其他各組在灌胃后第24d開始注射環(huán)磷酰胺（CTX）（40mg/kg/d，ip），連續(xù)3d。次注射后第5d，脫頸椎處死，取胸腺和脾臟精密稱取。②血液學(xué)檢測(cè)：給藥第31d解剖小鼠，摘眼球采血，用XT-2000iv血液分析儀測(cè)定血RT、WBC總數(shù)及分類計(jì)數(shù)、Rtc比例等。③脾細(xì)胞制備：無(wú)菌取出脾臟，剪碎，過(guò)篩，輕輕吹開脾臟細(xì)胞，在4℃下1100r/min離心10min，棄上清液，再懸浮細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液，攪拌均勻，裂解約5min，加入5mL PBS，終止裂解，在轉(zhuǎn)速1100r/min，4℃環(huán)境下，離心10min，棄上清液，清洗，在RPMI-1640中培養(yǎng)，重懸浮細(xì)胞，稀釋，計(jì)數(shù)脾細(xì)胞。④血液淋巴細(xì)胞CD3/CD4/CD8、脾淋巴細(xì)胞分群：在50μL小鼠靜脈全血中，加入按比例CD3/CD4/CD8混合抗體8μL；同樣體積加入制備好的脾細(xì)胞（5×106/mL）50μL，以及CD3/ CD4/CD8/CD69按比例混合抗體13μL。上述兩組管內(nèi)環(huán)境均室溫下避光，孵育30min；裂解紅細(xì)胞，清洗2次；加細(xì)胞固定液100μL/管進(jìn)行流式分析。⑤血清IgA、IgG、IgM含量測(cè)定，按試劑盒要求用夾心ELISA法檢測(cè)。⑥腸黏液采集與處理檢測(cè)sIgA：取回盲部小腸，縱切，輕輕刮腸腔，除去糞便，載玻片輕刮去腸黏膜表面黏液，放入埃彭多夫微量離心管中，用0.9%氯化鈉注射液3mL反復(fù)沖洗整個(gè)小腸腔，用5mL無(wú)菌離心管收集沖洗液，充分震蕩混勻，在4℃、1500r/min環(huán)境下，離心5min，收集上清液，測(cè)定sIgA。⑦脾淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)：使用96型號(hào)板孔，并設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入90μL脾細(xì)胞（5×106/mL）和10μL刀豆蛋白ConA（50μg/mL）孵育40h，分別加入CCK8試劑，采用450納米波長(zhǎng)檢測(cè)，計(jì)算增殖率。

1.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較，經(jīng)方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料描述以率、百分比等一般性描述，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行比較，以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1復(fù)合多糖對(duì)CTX致免疫低下小鼠體質(zhì)量的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，給藥第31d，對(duì)照組及各多糖組同性別小鼠，各組組間小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但同性別比較，姬松茸-灰樹花-蛹蟲草的復(fù)合多糖組小鼠的體質(zhì)量明顯高于高于其他單一多糖組（姬松茸多糖組、灰樹花多糖組、蛹蟲草多糖組）（P<0.05），詳見表1。

2.2復(fù)合多糖對(duì)CTX致免疫低下小鼠胸腺系數(shù)的影響

結(jié)果如圖1所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠胸腺系數(shù)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。其他多糖組別小鼠胸腺系數(shù)較免疫低下小鼠的模型對(duì)照組均有一定程度的升高，升高幅度以復(fù)合多糖組最高（P<0.05）。

2.3復(fù)合多糖對(duì)CTX致免疫低下小鼠體液免疫的影響結(jié)果 如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與免疫低下小鼠的模型對(duì)照組比較，其他多糖組別小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平都呈現(xiàn)出不同程度的增加，增加幅度以復(fù)合多糖組最高（P<0.05）。

2.4復(fù)合多糖對(duì)CTX致免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞分化成熟的影響結(jié)果 如圖2～圖4所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組在血液CD4/CD8、脾臟CD4/CD8均顯著升高，血液CD4-CD8+均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。其他多糖組小鼠較單純免疫低下小鼠的模型對(duì)照組，其血液CD4-CD8+均呈現(xiàn)一定程度的升高，血液及脾臟CD4/CD8均出現(xiàn)不同程度降低，效果以復(fù)合多糖組最優(yōu)（P<0.05）。

2.5復(fù)合多糖對(duì)CTX致免疫低下小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響結(jié)果 如圖5所示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.05）。其他多糖組與模型對(duì)照組比較，復(fù)合多糖組的T淋巴細(xì)胞增殖率升高效果高于單一多糖組。

3 討論

現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏快，工作壓力大，人體免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病率隨之上升，目前調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力藥物主要以化學(xué)合成藥物為主，但其副作用明顯，療效持續(xù)較短、藥物殘留體內(nèi)、用藥時(shí)間成本過(guò)長(zhǎng)等。而中草藥成為近年研究熱點(diǎn)，因其具有藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)機(jī)體藥物殘留、對(duì)機(jī)體影響小等優(yōu)點(diǎn)。目前已開發(fā)有一百種以上的中藥多糖類化合物均發(fā)現(xiàn)具有免疫促進(jìn)作用。姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖等真菌類多糖大多具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等生物活性，是一種非特異性免疫增強(qiáng)劑。本研究通過(guò)CTX導(dǎo)致的免疫低下模型造模方法，使實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)減緩，胸腺系數(shù)降低，血清免疫球蛋白水平降低，探討給予小鼠以上按一定比例組成的復(fù)合多糖，是否對(duì)免疫低下小鼠的免疫力具有增強(qiáng)的作用。

免疫球蛋白分泌的量，反映了體液免疫的功能[8]。CD4和CD8是T淋巴細(xì)胞重要的表面抗原，輔助性T細(xì)胞（Th）屬于CD4+T細(xì)胞亞群，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞（Ts）屬于CD8+T細(xì)胞。各亞群數(shù)量和功能產(chǎn)生異常時(shí)，細(xì)胞免疫應(yīng)答及遲發(fā)型超敏反應(yīng)、細(xì)胞毒作用均受到抑制，機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂并發(fā)生病理變化。ConA是促細(xì)胞有絲分裂素，可使大量T細(xì)胞克隆活化[9]，當(dāng)T淋巴細(xì)胞功能增強(qiáng)時(shí)，ConA能激發(fā)其更快增殖，從而提高小鼠細(xì)胞免疫水平。

綜上所述，本研究等劑量姬松茸多糖-灰樹花多糖-蛹蟲草多糖的復(fù)合多糖，對(duì)于提高小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫，以及增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能均有更好的作用，可顯著改善免疫抑制小鼠免疫功能，說(shuō)明這三種多糖的復(fù)合多糖在增強(qiáng)免疫功能方面有相互協(xié)同作用，值得臨床推廣，研究其更好地混合比例，以期取得更精確的增強(qiáng)免疫功能效果。

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作者簡(jiǎn)介：馬傳貴（1985-），男，高級(jí)菌類園藝工，中藥師，主要從事食藥用菌的科學(xué)研究、開發(fā)應(yīng)用和科普教育工作。E-mail：lingzhichina@126.com

*通信作者：李紅芳（1974-），女，講師，理學(xué)博士，主要從事天然藥物化學(xué)分析。E-mail：625584065@qq.cocm