梁文鵬，王 潔，張 琦*

（南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD)是一種常見(jiàn)于老年人的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，我國(guó)65 歲以上老年人患病率可達(dá)1.7%，且患病率隨年齡的升高而增加。PD 的主要臨床特征包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和自主神經(jīng)功能障礙等，主要病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元大量變性丟失以及路易小體（Lewy bodies)的出現(xiàn)。由于PD 病因不明，病理機(jī)制復(fù)雜，目前對(duì)于PD 的治療只能改善和減輕癥狀，但不能有效地阻止病情進(jìn)展[1]。

線(xiàn)粒體功能障礙在PD 的病理過(guò)程中具有重要的作用，線(xiàn)粒體功能的許多方面，包括活性氧產(chǎn)生、線(xiàn)粒體生物發(fā)生、線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)等都成為PD治療的潛在靶點(diǎn)[2]。吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine，PQQ)是一種具有鄰苯醌結(jié)構(gòu)的氧化還原酶輔基，參與氧化還原酶的酶促反應(yīng)，以往研究[3]發(fā)現(xiàn)PQQ 在體內(nèi)能發(fā)揮清除自由基、保護(hù)神經(jīng)元等作用。本課題組前期研究[4-5]也發(fā)現(xiàn)PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用，能促進(jìn)線(xiàn)粒體生物發(fā)生，提示PQQ可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能發(fā)揮作用，在PD 的防治中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

線(xiàn)粒體分裂融合是維持線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)平衡的主要因素，分裂融合紊亂導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異常線(xiàn)粒體聚集，這是導(dǎo)致包括PD 在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病理機(jī)制之一[6]。線(xiàn)粒體的分裂融合是由動(dòng)力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1)、線(xiàn)粒體分裂蛋白（fission 1，F(xiàn)is1)和線(xiàn)粒體融合蛋白1/2（mitofusin 1/2，Mfn1/2)、視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy 1，OPA1)等共同介導(dǎo)的[7]。魚(yú)藤酮是線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，能選擇性引起黑質(zhì)多巴胺系統(tǒng)變性，被廣泛用于PD模型的制備。魚(yú)藤酮損傷抑制了線(xiàn)粒體分裂基因Drp1 和融合基因Mfn2 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷[8-9]。慢性魚(yú)藤酮損傷早期，線(xiàn)粒體分裂融合代償性增加，損傷晚期分裂融合下降，而線(xiàn)粒體形態(tài)沒(méi)有顯著改變[10]。目前對(duì)于PQQ 如何影響線(xiàn)粒體分裂融合尚不清楚。

本研究采用魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞模型，通過(guò)線(xiàn)粒體分裂融合相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的檢測(cè)以及形態(tài)學(xué)觀(guān)察，分析PQQ 對(duì)線(xiàn)粒體分裂融合的調(diào)節(jié)，探討PQQ 如何調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)對(duì)魚(yú)藤酮損傷模型發(fā)揮保護(hù)作用，為將其開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于PD 的臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞模型構(gòu)建 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y)細(xì)胞采用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM 培養(yǎng)基，放于37 ℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞密度達(dá)90%以上即可進(jìn)行傳代。采用1、10、100 μmol/L PQQ（Sigma 公司)預(yù)處理細(xì)胞24 h 后，加入100 μmol/L 魚(yú)藤酮（Sigma公司)損傷細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。分為正常對(duì)照組（Control)、單獨(dú)PQQ 處理組（PQQ 100 μmol/L)、魚(yú)藤酮損傷組（Rot 100 μmol/L)、PQQ 低劑量組（Rot+PQQ 1 μmol/L)、PQQ 中劑量組（Rot+PQQ 10 μmol/L)、PQQ 高劑量組（Rot+PQQ 100 μmol/L)。

1.2 總RNA 提取及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)采用Trizol 法提取SH-SY5Y 細(xì)胞總RNA 并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)Drp1 和Mfn2 的引物，分別為Drp1-F-gagtaagccctgaaccaa，Drp1-R-tgatgaaccgaagaatgag，Mfn2-F-accgccacatagaggaag，Mfn2-R-gcacagacacaggaagga。以18SrRNA 作為內(nèi)參，引物序列18S-F-tagagggacaagtggcgttc，18S-R-cgctgagccagtcagtgt。定量PCR 反應(yīng)體系為:SYBR green MIX 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL，每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔，生物學(xué)重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算Drp1 和Mfn2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 線(xiàn)粒體和胞質(zhì)蛋白分離 采用線(xiàn)粒體分離試劑盒（碧云天公司)分離線(xiàn)粒體和胞質(zhì)蛋白。細(xì)胞處理后用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS)重懸、沉淀，加入1 mL 線(xiàn)粒體分離試劑進(jìn)行懸浮、勻漿、離心等，獲得的沉淀為線(xiàn)粒體，上清為胞質(zhì)蛋白。

1.4 Western Blot 將上述收集獲得的線(xiàn)粒體和胞漿蛋白采用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA)試劑盒（碧云天公司)進(jìn)行濃度測(cè)定，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為1 μg/μL 后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF)膜后封閉，分別加入抗Drp1（1∶500)、Mfn2（1∶500)抗體4 ℃孵育過(guò)夜，二抗辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP)-羊抗兔IgG（1∶5 000)、HRP-羊抗鼠IgG（1∶5 000)（Abcam 公司)室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL)顯色、掃描，測(cè)量灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別采用電壓依賴(lài)陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC)和β-actin（Sigma 公司)作為線(xiàn)粒體和胞漿蛋白的內(nèi)參。

1.5 電鏡檢測(cè) 將上述處理的細(xì)胞置于4%戊二醛中于4 ℃固定2 h 以上，采用鋨酸水溶液進(jìn)行后固定2 h，乙醇梯度脫水后采用環(huán)氧丙烷和包埋劑包埋，半薄切片后用1%甲苯胺藍(lán)溶液進(jìn)行染色，在光鏡下觀(guān)察定位后進(jìn)行超薄切片，厚度約70 nm，采用0.5%醋酸雙氧鈾染色2～3 min，檸檬酸鉛復(fù)染2～3 min，最后在透射電子顯微鏡（Hitachi 公司)下觀(guān)察線(xiàn)粒體形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析，并通過(guò)Tukey′s Multiple Comparison Test 進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Drp1 和Mfn2 基因表達(dá)的影響 在不同濃度PQQ 預(yù)保護(hù)SH-SY5Y 細(xì)胞后，加入100 μmol/L 魚(yú)藤酮損傷24 h，提取細(xì)胞總RNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR 分析線(xiàn)粒體分裂和融合相關(guān)基因Drp1 和Mfn2 的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純PQQ 作用不影響以上兩個(gè)基因的表達(dá)，魚(yú)藤酮損傷顯著降低細(xì)胞中Drp1 和Mfn2 基因的表達(dá)，中（10 μmol/L)、高（100 μmol/L)劑量組PQQ 預(yù)保護(hù)均能拮抗魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的Drp1 和Mfn2 表達(dá)降低（圖1A～B)。

圖1 定量PCR 檢測(cè)PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Drp1 和Mfn2 基因表達(dá)的影響

2.2 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Drp1 蛋白表達(dá)的影響 不同濃度PQQ 預(yù)處理魚(yú)藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞后，分離胞質(zhì)和線(xiàn)粒體蛋白，采用Western Blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤酮損傷細(xì)胞的胞質(zhì)中Drp1 表達(dá)增加，而在線(xiàn)粒體中表達(dá)顯著下降（圖2)。低、中、高濃度PQQ 預(yù)保護(hù)24 h 均能增加胞質(zhì)中Drp1 的表達(dá)（圖2A、C)，高濃度PQQ 能同時(shí)顯著增加線(xiàn)粒體中Drp1 的表達(dá)（圖2B、D)。

圖2 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Drp1 蛋白表達(dá)的影響

2.3 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Mfn2 蛋白表達(dá)的影響 不同濃度PQQ 預(yù)處理魚(yú)藤酮損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞后，分離胞質(zhì)和線(xiàn)粒體蛋白，采用Western Blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤酮損傷細(xì)胞的胞質(zhì)中Mfn2表達(dá)沒(méi)有顯著變化，而在線(xiàn)粒體中表達(dá)顯著下降（圖3)。低、中、高濃度PQQ 預(yù)保護(hù)24 h 均能增加胞質(zhì)（圖3A、C)和線(xiàn)粒體（圖3B、D)中Mfn2 的表達(dá)。

圖3 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞Mfn2 蛋白表達(dá)的影響

2.4 PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)的影響 采用透射電鏡檢測(cè)線(xiàn)粒體的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組線(xiàn)粒體數(shù)量較多，膜結(jié)構(gòu)完整，線(xiàn)粒體大小在正常范圍以?xún)?nèi)，單獨(dú)使用PQQ 對(duì)細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)無(wú)顯著影響，而魚(yú)藤酮損傷組線(xiàn)粒體數(shù)量減少，可見(jiàn)異常腫脹和增大的線(xiàn)粒體，呈現(xiàn)病理性表型；不同濃度PQQ 處理后能減少病理性線(xiàn)粒體的發(fā)生（圖4)。以上結(jié)果提示PQQ 能改善魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y細(xì)胞線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)紊亂。

圖4 透射電鏡檢測(cè)PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮損傷SH-SY5Y 細(xì)胞線(xiàn)粒體形態(tài)的影響

3 討論

PD 是發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的一種神經(jīng)退行性疾病，其病因可能與環(huán)境、遺傳、氧化應(yīng)激等相關(guān)。盡管目前臨床上PD 的治療方法不斷進(jìn)步，但由于發(fā)病機(jī)制不清，仍無(wú)法根治，開(kāi)發(fā)能針對(duì)PD 發(fā)病機(jī)制的治療方法迫在眉睫。

線(xiàn)粒體是一種處于融合與分裂動(dòng)態(tài)平衡中的細(xì)胞器，是線(xiàn)粒體重要的質(zhì)量控制機(jī)制，通過(guò)融合保留膜電位較高、質(zhì)量相對(duì)較好的線(xiàn)粒體，通過(guò)裂解及自噬清除膜電位較低、質(zhì)量相對(duì)較差的線(xiàn)粒體，細(xì)胞存活和分化過(guò)程中通過(guò)線(xiàn)粒體這種適應(yīng)性改變?cè)诰S持細(xì)胞功能和細(xì)胞活力方面起著重要作用[6]。家族性PD相關(guān)基因的致病性突變通常會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)異常，在PD 動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中存在腫脹和增大的線(xiàn)粒體，提示PD 的發(fā)病機(jī)制可能與線(xiàn)粒體分裂融合紊亂有關(guān)[11-12]。因此，線(xiàn)粒體動(dòng)態(tài)失衡可能作為PD治療的一個(gè)新靶點(diǎn)[13]。

研究[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠多巴胺能神經(jīng)元中敲除Drp1導(dǎo)致尾狀殼核多巴胺能神經(jīng)終末消失，中腦神經(jīng)元胞體退行性改變，同時(shí)線(xiàn)粒體含量顯著下降，尤其在軸突中線(xiàn)粒體動(dòng)態(tài)失衡。本研究發(fā)現(xiàn)在魚(yú)藤酮損傷細(xì)胞模型中Drp1 表達(dá)下降，并發(fā)生了從線(xiàn)粒體到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位，推測(cè)其不能及時(shí)有效分裂受損線(xiàn)粒體，而PQQ 預(yù)保護(hù)則能顯著增加Drp1 的表達(dá)，尤其在線(xiàn)粒體中發(fā)揮清除損傷線(xiàn)粒體的功能。

研究[11]表明，過(guò)表達(dá)Mfn2 能阻斷線(xiàn)粒體斷裂，在體外保護(hù)神經(jīng)元免受百草枯誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙，抑制黑質(zhì)和紋狀體軸突終末多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失。在不同細(xì)胞系中降低Mfn2 可導(dǎo)致線(xiàn)粒體增大和管狀網(wǎng)絡(luò)的破壞[15]，Mfn2 可通過(guò)改善細(xì)胞凋亡來(lái)阻止魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用[16]。本研究也表明，PQQ 可顯著增加Mfn2 的表達(dá)，并由此調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

此外，促進(jìn)線(xiàn)粒體生物合成也能調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體分裂融合，對(duì)魚(yú)藤酮引起的神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用[9]。以往研究[4]發(fā)現(xiàn)PQQ 可以促進(jìn)線(xiàn)粒體生物發(fā)生，并由此拮抗魚(yú)藤酮損傷，可見(jiàn)線(xiàn)粒體生物發(fā)生和分裂融合之間的相互作用也參與了神經(jīng)系統(tǒng)退行性變的發(fā)生。PQQ 有可能通過(guò)促進(jìn)線(xiàn)粒體生物發(fā)生影響線(xiàn)粒體分裂融合過(guò)程，從多方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究在體外采用魚(yú)藤酮損傷SHSY5Y 細(xì)胞模型，初步探究了PQQ 對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)PD模型中線(xiàn)粒體分裂融合的調(diào)控，提示PQQ 有可能通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體動(dòng)態(tài)平衡對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD 模型發(fā)揮保護(hù)作用，為進(jìn)一步將PQQ 用于臨床治療提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，也使線(xiàn)粒體分裂融合成為PD治療新的靶點(diǎn)。