丁易鈐，盧 清

（江蘇省南通市婦幼保健院婦科，南通 226018)

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，患病率為5%～10%[1]，PCOS 能?chē)?yán)重影響患者的生殖功能，以及增加雌激素依賴(lài)性腫瘤、2 型糖尿病、代謝綜合征等相關(guān)代謝失調(diào)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。對(duì)于臨床上缺乏典型癥狀、體征及實(shí)驗(yàn)室依據(jù)及青春期的患者缺乏較為精準(zhǔn)的診斷方法，對(duì)于各種不同的亞型缺乏相應(yīng)的精準(zhǔn)治療策略及個(gè)體化的診療標(biāo)準(zhǔn)，臨床效果欠佳。PCOS 的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，其相關(guān)分子機(jī)制的研究是當(dāng)今女性生殖內(nèi)分泌的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。G.A.BURGHEN 等[3]首次報(bào)道了高胰島素血癥與PCOS 有關(guān)。研究[4]發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗與高胰島素血癥在PCOS的發(fā)病中起著關(guān)鍵和早期的作用。胰島素對(duì)卵巢的作用主要通過(guò)胰島素受體來(lái)調(diào)節(jié)，胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS)是一種細(xì)胞內(nèi)糖蛋白。IRS1 作為胰島素受體后的主要船塢蛋白，其蛋白的表達(dá)和磷酸化異常是選擇性胰島素抵抗的主要機(jī)制。K.K.ALHARBI 等[5]也發(fā)現(xiàn)IRS1（rs1801278)與胰島素受損相關(guān)。近年來(lái)，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的不斷實(shí)踐和發(fā)展，對(duì)一種疾病不同狀態(tài)和過(guò)程進(jìn)行精確分類(lèi)，以便精確尋找到疾病的原因和治療的靶點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)觀察PCOS 患者的IRS1 基因多態(tài)性與藥物治療效應(yīng)的關(guān)系，從而為今后PCOS 精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年7 月—2018 年7 月在南通市婦幼保健院就診的PCOS 患者240 例，年齡20～30 歲，平均（26.31±23.61)歲，納入標(biāo)準(zhǔn):（1)符合PCOS 診斷標(biāo)準(zhǔn):2003 年歐洲人類(lèi)生殖和胚胎與美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)的（ESHRE/ASRM)鹿特丹專(zhuān)家會(huì)議推薦的標(biāo)準(zhǔn)[6]，以下3 項(xiàng)中符合2 項(xiàng):①稀發(fā)排卵和（或)無(wú)排卵（月經(jīng)周期＞35 d)；②臨床高雄激素表現(xiàn)和（或)生化高雄激素血癥；③卵巢呈多囊樣改變，即超聲檢查見(jiàn)到:一側(cè)或兩側(cè)卵巢有≥12 個(gè)、直徑＜10 mm的小卵泡，或（和)卵巢體積增大＞10 mL。（2)既往未接受過(guò)治療的患者。（3)知情同意，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):（1)對(duì)藥物過(guò)敏者；（2)患有其他內(nèi)分泌疾病患者；（3)近3 個(gè)月來(lái)服用激素類(lèi)藥物；（4)肝腎等重要臟器衰竭；（5)合并有高血壓心臟病等病史；（6)臨床資料收集不全者。選取同期240 名體檢正常者作為正常對(duì)照組，年齡20～30 歲，平均（25.31±24.83)歲，納入標(biāo)準(zhǔn):（1)正常排卵（月經(jīng)周期規(guī)律)；（2)激素水平提示均在正常范圍內(nèi)；（3)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):（1)患有內(nèi)分泌疾病患者；（2)近3 個(gè)月來(lái)服用激素類(lèi)藥物；（3)肝腎等重要臟器衰竭；（4)臨床資料收集不全者。本研究經(jīng)南通市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 檢測(cè)與治療

1.2.1 胰島素代謝相關(guān)基因IRS1 檢測(cè) 抽取患者外周靜脈血4 mL。血樣經(jīng)離心后于4 ℃保存。根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)資料，選擇漢族人群中IRS1 代謝酶雜合度＞10%，且與代謝酶活性密切相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。結(jié)合文獻(xiàn)[5]報(bào)道，本研究選擇rs1801278位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。利用引物設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0，設(shè)計(jì)rs1801278 位點(diǎn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)引物，上游:5′-TCACCTCCTCTGCAGCAATG-3′；下游:5′-CCTTCCACATCCCCACCATC-3′，DNA 在20 μL 的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠（EB 染色)，110 V 直流電壓下電泳30 min，以DNA marker DL600 為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，利用紫外線(xiàn)熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增目的片段的結(jié)果。PCR 產(chǎn)物經(jīng)紫外線(xiàn)熒光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)后一部分產(chǎn)物由上海赫貝公司測(cè)序，采用一代測(cè)序及變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC) 技術(shù)篩查多態(tài)位點(diǎn)分析rs1801278 位點(diǎn)基因型。

1.2.2 治療方法 PCOS 患者不同基因型基礎(chǔ)上分3 組，均予改善飲食并加強(qiáng)體格鍛煉。空白組不服用藥物；二甲雙胍組服用二甲雙胍緩釋片（天津中新，國(guó)藥準(zhǔn)字J20120010，0.5 g/片)，0.5 g/（次·d-1)；口服避孕藥+二甲雙胍組在二甲雙胍基礎(chǔ)上加用達(dá)英-35（拜耳醫(yī)藥廣州，國(guó)藥準(zhǔn)字J20100003，醋酸環(huán)丙孕酮2 mg 和炔雌醇0.035 mg，1 片/d，連服21 d，停藥7 d后開(kāi)始下一周期；共治療6 個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 性激素水平 患者均抽取清晨空腹靜脈血5 mL，12 000 r/min 離心10 min，獲得血清，采用貝克曼DXI800 型化學(xué)免疫發(fā)光分析儀測(cè)定卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素（luteinizing hormone，LH)、雌二醇（estradiol，E2)、睪酮（testosterone，T)，試劑盒由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供，并進(jìn)行質(zhì)控。

1.3.2 胰島功能 采用胰島素化學(xué)發(fā)光法試劑盒（深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)測(cè)定空腹胰島素。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR)=空腹胰島素×空腹血糖/22.5。

1.3.3 血脂水平 采用酶循環(huán)法測(cè)定三酰甘油（triglyceride，TG)、總膽固醇（total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL)及高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL)，試劑盒由深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司提供。

1.3.4 監(jiān)測(cè)排卵情況 將飛利浦iU Elite C8-4V 型超聲診斷儀陰道探頭頻率設(shè)置為7.5 MHz，未婚者行經(jīng)腹部B 超檢查，對(duì)卵巢行連續(xù)斷層的縱切、橫切掃查。進(jìn)行卵泡監(jiān)測(cè)，觀察是否恢復(fù)排卵及進(jìn)行優(yōu)勢(shì)卵泡監(jiān)測(cè)。月經(jīng)周期第11～12 天進(jìn)行初次監(jiān)測(cè)，以最大三維徑線(xiàn)對(duì)卵泡直徑進(jìn)行計(jì)算，一般將直徑＞10 mm的卵泡作為優(yōu)勢(shì)卵泡。根據(jù)優(yōu)勢(shì)卵泡的大小確定下一次監(jiān)測(cè)時(shí)間，若最大卵泡直徑＜10 mm，監(jiān)測(cè)時(shí)間間隔6～7 d；若最大卵泡直徑10～12 mm，監(jiān)測(cè)時(shí)間間隔3～4 d，最大卵泡直徑13～15 mm，監(jiān)測(cè)時(shí)間間隔2～3 d。若最大卵泡直徑16 mm，監(jiān)測(cè)時(shí)間間隔1～2 d，B 超監(jiān)測(cè)卵泡消失或塌陷，表明已排卵，記錄排卵情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%)表示，采用χ2檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)檢測(cè)基因型是否符合Hardy-Weinberg 平衡定律。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs1801278 位點(diǎn)基因型分析結(jié)果 PCOS 組rs1801278 位點(diǎn)的CC 基因型頻率低于正常對(duì)照組（P＜0.05)，TT 基因型頻率顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05)；CT 基因型頻率兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)。PCOS 組T 等位基因頻率顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05)，均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，見(jiàn)圖1、表1。

圖1 rs1801278 基因型測(cè)序結(jié)果

表1 PCOS 組與正常對(duì)照組rs1801278 位點(diǎn)基因分析型結(jié)果（n，%)

2.2 不同基因型治療后性激素水平比較 CC 基因型采用二甲雙胍+達(dá)英-35治療的性激素改善最明顯，明顯優(yōu)于CT 和TT 型（P＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同基因型治療后性激素水平比較（)

表2 不同基因型治療后性激素水平比較（)

注:與空白組相比，aP＜0.05；與二甲雙胍組相比，bP＜0.05；與CC 型相比，cP＜0.05。

2.3 不同基因型治療后胰島功能及血脂水平比較CC 基因型采用二甲雙胍+達(dá)英-35治療的胰島素水平、HOMA-IR 及血脂改善均明顯優(yōu)于CT 和TT 型（均P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同基因型治療后胰島功能及血脂水平比較（)

表3 不同基因型治療后胰島功能及血脂水平比較（)

注:與空白組相比，aP＜0.05；與二甲雙胍組相比，bP＜0.05；與CC 型相比，cP＜0.05。

2.4 不同基因型卵泡監(jiān)測(cè)結(jié)果 CC 基因型采用二甲雙胍+達(dá)英-35治療恢復(fù)自發(fā)排卵率達(dá)78.62%，明顯優(yōu)于CT 型（67.23%)和TT 型（61.62%)（P＜0.05)。

3 討論

PCOS 是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)疾病，常導(dǎo)致不孕和自然流產(chǎn)等，嚴(yán)重危害女性身心健康，目前已認(rèn)識(shí)到PCOS 的發(fā)病通常與激素、遺傳及環(huán)境有關(guān)，但尚不完全清楚其發(fā)病機(jī)制[7-8]。國(guó)內(nèi)外研究[9-10]顯示胰島素抵抗在PCOS 的發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是PCOS 發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)。胰島素抵抗引發(fā)的高胰島素血癥促進(jìn)雄激素大量分泌，從而導(dǎo)致無(wú)排卵及閉經(jīng)等生殖功能障礙[11]。IRS1 是胰島素受體的酪氨酸激酶底物，參與介導(dǎo)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，與胰島素抵抗關(guān)系密切[12]。

既往研究[13]表明，PCOS 是一種多基因遺傳疾病，有較強(qiáng)的家族聚集性。IRS1 基因的rs1801278（C＞T)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可使細(xì)胞胰島素刺激信號(hào)下降32%，通過(guò)PI3K 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，使IRS1 表達(dá)下降，正常人群及糖尿病人群產(chǎn)生胰島素抵抗。國(guó)外學(xué)者[14-15]報(bào)道rs1801278（C＞T)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性有較高的突變頻率，對(duì)指導(dǎo)2 型糖尿病和妊娠期糖尿病選擇藥物具有重要意義。研究[16]發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照中IRS1 基因突變率為16.6%，存在胰島素抵抗的PCOS 患者IRS1 基因的等位突變率達(dá)39.3%，同時(shí)rs1801278 基因多態(tài)性是PCOS 患者發(fā)病的重要影響因素，因此推斷基因的多態(tài)性對(duì)PCOS 患者的胰島素抵抗起著重要作用。但關(guān)于PCOS 患者rs1801278（C＞T)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的國(guó)內(nèi)研究則相對(duì)較少。本研究通過(guò)對(duì)IRS1rs1801278 進(jìn)行DHPLC 及測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)3 種基因型分別為純合子CC型、雜合子CT 型和純合子TT 型。繼而發(fā)現(xiàn)PCOS 患者與正常人群相比，發(fā)生TT 突變的頻率明顯增加，表明PCOS 患者T 等位基因可能是它的發(fā)病基因。為進(jìn)一步研究基因型對(duì)藥物的敏感性，故對(duì)所有基因型采用3 種干預(yù)措施，分別從性激素、胰島功能、血脂及優(yōu)勢(shì)卵泡等方面觀察藥物療效，結(jié)果顯示CC基因型采用二甲雙胍及二甲雙胍+達(dá)英-35治療的性激素水平、胰島功能及血脂改善優(yōu)勢(shì)卵泡有效率明顯優(yōu)于CT 和TT 型，TT 型療效最差（P＜0.05)。提示二甲雙胍對(duì)CC 基因型患者療效較好，同時(shí)聯(lián)合達(dá)英-35 的療效更為突出，一方面表明二甲雙胍治療rs1801278 位點(diǎn)野生型患者更具針對(duì)性、療效更優(yōu)、體現(xiàn)了個(gè)體化用藥原則，但具體的藥物基因組學(xué)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究；另一方面從藥物種類(lèi)選擇上，無(wú)論是哪種基因型，二甲雙胍+達(dá)英-35治療的效果明顯優(yōu)于二甲雙胍單獨(dú)治療，表明達(dá)英-35 協(xié)同二甲雙胍明顯增加了CC 基因型患者的療效，達(dá)英-35通過(guò)與雙氫睪酮競(jìng)爭(zhēng)受體，抑制5-α 還原酶活性，降低雄激素水平療效[17]，二甲雙胍增強(qiáng)胰島素敏感性，減緩PCOS 胰島素抵抗，從而打破高雄激素和胰島素抵抗之間的惡性循環(huán)，協(xié)同達(dá)英-35 降低雄激素水平[18]。

綜上所述，二甲雙胍聯(lián)合達(dá)英-35治療CC 基因型PCOS 患者療效最優(yōu)，TT 基因型最差，檢測(cè)rs1801278 位點(diǎn)有助于選擇個(gè)體化藥物治療以達(dá)到最佳療效。因本研究樣本量較小，存在一定偏倚，故需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。