管徒晨，滕 龍，郭貝貝，劉 炎*

（南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS)的軸突損傷后大多不能再生，CNS 損傷后軸突再生障礙常導(dǎo)致永久性功能障礙。因此，神經(jīng)元再生受損軸突的能力對功能的恢復(fù)至關(guān)重要。目前對于CNS 損傷的治療手段包括藥物治療、手術(shù)治療、物理及康復(fù)治療等[1-2]，然而想要完全恢復(fù)卻十分困難，同時高昂的治療費用給家庭和社會帶來沉重負擔(dān)，發(fā)現(xiàn)可以用于臨床治療CNS 損傷的藥物顯得尤為重要。

二甲雙胍（metformin，MET)是世界上最古老、最廣泛使用的降血糖藥物之一。它的醫(yī)學(xué)使用史最早可以追溯到山茱萸提取物的使用，起初被用于治療口臭和多尿，直到20 世紀(jì)30 年代，MET 才被報道用于治療糖尿病癥狀[3]。多年來，除了改善血糖，MET已被證明對健康有越來越廣泛的積極作用。MET 被發(fā)現(xiàn)對長期胰島素血癥的神經(jīng)細胞中淀粉樣蛋白β積聚和tau 蛋白過度磷酸化有保護作用[4]。此外，它還能減輕體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的非誘導(dǎo)性凋亡[5]，但是對神經(jīng)元生長及再生能力的研究比較罕見。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，探討了MET 對神經(jīng)元軸突生長的效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher 公司)；研究級體視顯微鏡（Olympus 公司)；細胞操作超凈臺（安泰公司)；熒光倒置顯微鏡（ZEISS 公司)；多功能酶標(biāo)儀（Biotek 公司)。

1.2 動物和試劑 懷孕18 d（E18)的SD 大鼠（南通大學(xué)實驗動物中心)；鹽酸MET（MCE 公司)；DMEM/F12 培養(yǎng)基、Neurobasal 培養(yǎng)基、B27 Supplement（Gibco 公司)；青霉素和鏈霉素、Hank′s 解剖液、谷氨酰胺（碧云天公司)；硫酸軟骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)、多聚賴氨酸、Hoechst 33342（Sigma 公司)；兔抗β-微管蛋白Ⅲ（Tuj1)抗體（Abcam 公司)；Alexa fluor@488/Cy3 標(biāo)記親和純化山羊抗兔IgG（H+L)（Jackson immunology 公司)；細胞計數(shù)試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8)（Dojindo 公司)。本實驗方案經(jīng)南通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 原代皮層神經(jīng)元的來源和培養(yǎng) SD 孕鼠（E18)采用乙醚麻醉，處死后置入75%乙醇中完全浸泡1 min，將大鼠置于手術(shù)臺，用手術(shù)剪剖開腹腔取出胎鼠并剪下頭部，置于Hank′s 解剖液中清洗2～3 遍；在體視顯微鏡下分離出大腦皮層最頂端區(qū)域，放入15 mL 離心管中，用0.25%胰酶37 ℃消化12 min，每3 min 震蕩1 次，充分消化后，500 r/min離心1 min，棄胰酶，用F12 完全培養(yǎng)基結(jié)束消化，并吹打5～10 次，分離出神經(jīng)元；吸取上層液體，過篩網(wǎng)（400 目)，1 000 r/min 離心5 min，棄上層液體，加5 mL DMEM/F12 完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，待混勻后計算數(shù)量；以2×106/mL 細胞密度種入多聚賴氨酸預(yù)先包被好的大皿或以1×105/mL 密度種在24 孔板中包被有多聚賴氨酸的玻片上，4～6 h 后換液，用Neurobasal 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 藥物處理 原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元更換Neurobasal 培養(yǎng)基同時加入指定濃度MET，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察對軸突生長的影響。原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元24 h 后使用0.125%胰酶消化構(gòu)建損傷模型，1 000 r/min 離心5 min，去除胰酶，用F12 完全培養(yǎng)基結(jié)束消化，以1×105/mL 密度將細胞種在24孔板中包被有多聚賴氨酸的玻片上，加入100 μmol/L MET繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察對神經(jīng)元生長的影響，CSPGs 處理組在檢測前12 h 加入10 μg/mL CSPGs。

1.5 細胞免疫熒光 將12 mm 小圓玻片放入24 孔板，加多聚賴氨酸包被，細胞計數(shù)后接種至24 孔板并進行加藥處理；棄培養(yǎng)基，加入37 ℃預(yù)溫的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS)輕洗1次，加入200 μL 固定液，室溫固定30 min，吸掉固定液，用0.01 mol/L PBS 室溫洗滌3 次，5 min/次；每孔加入200 μL 細胞封閉液，37 ℃封閉60 min，棄封閉液；孵育一抗4 ℃過夜。次日，室溫復(fù)溫20 min，PBS輕輕洗滌3 次，10 min/次；避光條件下室溫孵育1 h 45 min，棄二抗，并加入Hoechst 33342（5 μg/mL)室溫孵育15 min，0.01 mol/L PBS 洗3 次，5 min/次，熒光封片劑封片保存于暗盒內(nèi)；熒光顯微鏡拍攝，實驗重復(fù)3 次。

1.6 細胞活力檢測 使用CCK-8 試劑盒檢測細胞活性，按照說明書進行實驗，將神經(jīng)元以3×104/孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)12 h 后加入100 μmol/L MET 刺激24 h 或48 h，收樣前2 h 每孔加入10 μL CCK-8 溶液孵育細胞，酶標(biāo)儀檢測OD450，實驗重復(fù)3 次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用Imageproplus 軟件統(tǒng)計細胞熒光強度，采用GraphPad Prism8 對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MET對皮層神經(jīng)元軸突生長的影響 原代皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)加入不同濃度MET（10、100、500 μmol/L，1、5 mmol/L)處理24 h 后固定神經(jīng)元，免疫熒光結(jié)果顯示，100 μmol/L 濃度的MET 能夠有效促進皮層神經(jīng)元軸突的生長（P＜0.05)（圖1，見封二)。

圖1 不同濃度MET 對皮層神經(jīng)元軸突生長的影響

2.2 MET 對皮層神經(jīng)元軸突再生的影響 體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，運用低濃度胰酶進行二次消化構(gòu)建體外神經(jīng)元損傷模型。加入MET 刺激神經(jīng)元，36 h后固定神經(jīng)元進行細胞免疫熒光染色并對軸突長度進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，100 μmol/L 的MET 能夠有效促進皮層神經(jīng)元軸突再生（圖2，見封二)。

圖2 MET 對皮層神經(jīng)元軸突再生的影響

2.3 MET 有效提升細胞活力 體外培養(yǎng)E18 皮層神經(jīng)元，加入100 μmol/L MET 分別處理24 h 和48 h，使用CCK-8 檢測細胞活力，結(jié)果顯示MET 可有效提升皮層神經(jīng)元的細胞活力（圖3)。

圖3 MET 刺激神經(jīng)元后CCK-8 統(tǒng)計圖

2.4 MET 有效緩解CSPGs 對軸突生長的抑制作用CSPGs 可在CNS 損傷后顯著上調(diào)并抑制軸突生長，因此在培養(yǎng)皿中加入CSPGs 模擬CNS 損傷環(huán)境，可以看出CSPGs 能夠有效抑制皮層神經(jīng)元軸突的生長，而MET 則能緩解這種抑制作用（圖4，見封二)。

圖4 MET 有效緩解CSPGs 對軸突生長的抑制作用

3 討論

MET 作為2 型糖尿病的一線治療藥物能夠有效降低血糖[6]，主要通過有機陽離子轉(zhuǎn)運蛋白（organic cation transpoters，OCTs)轉(zhuǎn)運至多種細胞中[7]。多年來，除了具有改善血糖的作用外，MET 已被證明對治療肥胖、代謝綜合征、心血管疾病等有積極作用[8]。文獻[9-10]提示MET 有助于改善外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)性疼痛，并能促進缺血性腦損傷等CNS 疾病恢復(fù)。MET 能改善CNS 損傷后的功能恢復(fù)，部分原因是通過抑制神經(jīng)元凋亡[11]。而本研究發(fā)現(xiàn)MET 能夠促進皮層神經(jīng)元的軸突生長及損傷后再生，這為MET 的應(yīng)用提供了新的方向。

眾所周知，CNS 損傷后神經(jīng)元的再生能力較差。因此，探索促進軸突再生的途徑具有重要意義。近年來，各種神經(jīng)再生研究集中于提高神經(jīng)元再生能力，以改善CNS 損傷后的功能恢復(fù)[12]。本研究表明，MET能夠有效提升神經(jīng)元活力，為神經(jīng)元軸突生長提供支持。

軸突生長抑制因子是成年哺乳動物CNS 損傷后再生失敗的重要因素[13]，損傷部位胞外基質(zhì)（如蛋白多糖)的表達抑制了軸突再生，CSPGs 家族是其中研究最廣泛的家族之一[14]。本課題組以往研究[15]顯示，軸突能夠橫跨CSPGs 環(huán)境的生長，往往是CNS再生的關(guān)鍵。這一現(xiàn)象提示，通過藥物治療研究CSPGs 存在的情況下對神經(jīng)元生長的影響具有重要意義。因此在體外加入CSPGs 來模擬CNS 損傷后的抑制環(huán)境，并且發(fā)現(xiàn)CSPGs 對神經(jīng)元軸突生長的抑制作用在MET 的影響下得到有效緩解。提示MET可能是CNS 損傷修復(fù)的潛在候選藥物。MET 安全性高，輕微的胃腸道問題是常見的不良反應(yīng)，僅有極少數(shù)的乳酸酸中毒報道[16]，同時有研究[17]發(fā)現(xiàn)MET 能夠穿過血腦屏障，而這使得它成為了CNS 損傷用藥的有力競爭者。

MET 促進神經(jīng)元軸突生長的效應(yīng)是明確的，那么可能的作用機制是什么？研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，MET 能夠強烈影響細胞代謝，如通過激活A(yù)MPK、抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和甘油磷酸穿梭刺激糖酵解，通過抑制線粒體甘油磷酸脫氫酶調(diào)整細胞氧化還原狀態(tài)，降低內(nèi)源性葡萄糖生成[19]。文獻[20-22]提示，MET 可以降低多種細胞系三羧酸循環(huán)活性和線粒體呼吸。對于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，MET 能夠增加糖酵解而降低氧化磷酸化通量[23-24]。因此，MET能夠調(diào)整神經(jīng)元的代謝狀態(tài)。研究[25-26]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)祖細胞與分化后的神經(jīng)元相比對氧化磷酸化的依賴性更小，并且從糖酵解到氧化磷酸化的轉(zhuǎn)變與神經(jīng)元分化密切相關(guān)。突觸活動作為神經(jīng)元軸突生長的重要誘因之一，通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運體3 以及糖酵解限速酶的表達以提高葡萄糖攝取和代謝從而促進軸突的生長[27]，糖酵解超過氧化磷酸化提供了神經(jīng)元對增長的能量需求的快速響應(yīng)[28]。這提示神經(jīng)元供能由氧化磷酸化轉(zhuǎn)向糖酵解對其軸突生長及再生具有重要作用。MET 可能通過調(diào)控神經(jīng)元的代謝狀態(tài)，為軸突的生長及再生提供能量支持和生物合成前體進而促進軸突的生長。

本研究發(fā)現(xiàn)MET 能夠有效促進原代皮層神經(jīng)元軸突生長及損傷軸突的再生，并顯示了神經(jīng)保護作用，體外實驗也證實了MET 處理能有效緩解CSPGs 對皮層神經(jīng)元生長的抑制作用。希望MET 刺激神經(jīng)元軸突生長及再生的研究可以促進對神經(jīng)元內(nèi)在再生機制的進一步了解，為改善神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生提供理論依據(jù)及潛在靶點。