陳希敏，汪雪雁，尹雁，葉夢(mèng)玲，秦勝芳，席娜

(四川省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，四川 成都 610045)

0 引言

由于國家二胎政策的放開，高齡孕產(chǎn)婦的數(shù)目也隨之大大增加。高齡孕婦是指孕婦年齡或其孕產(chǎn)年齡≥35歲[1]。染色體疾病是遺傳性疾病的常見類型，是出生缺陷的常見病因。有文獻(xiàn)報(bào)道，在我國新生兒中，染色體疾病大約占6%左右，此外，高齡孕婦所懷胎兒的染色體異常率會(huì)有所增高，而且隨著孕婦的年齡的增長(zhǎng)，其染色體異常率會(huì)明顯地增高[2-4]。胎兒超聲軟指標(biāo)是指孕婦在接受超聲檢查時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一大類非特異性的胎兒的結(jié)構(gòu)的微小變化，大多為一過性的，并且在正常胎兒中也可見，但是其在具有染色體異常的胎兒中的發(fā)生率會(huì)明顯增高，因此，其在評(píng)估胎兒是否存在染色體異常上具有重大價(jià)值[5]。隨著超聲技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，胎兒超聲軟指標(biāo)檢出率也逐漸增高，因此，越來越多的醫(yī)生將其納入產(chǎn)前診斷的指征。

目前，運(yùn)用于臨床上產(chǎn)前診斷的方法種類較多，常見的有細(xì)胞遺傳學(xué)的染色體核型分析技術(shù)，分子遺傳學(xué)的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QF-PCR)，細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-微球鑒別/分離法(BoBs)，染色體微陣列分析(CMA)等[3，6-8]，然而傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)的細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)依舊是作為產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[9]，但其存在分辨率有限，發(fā)放報(bào)告周期長(zhǎng)，經(jīng)驗(yàn)要求高，可能出現(xiàn)培養(yǎng)失敗等缺點(diǎn)。FISH需要設(shè)計(jì)特定的探針，通量低。QF-PCR無法檢測(cè)診斷染色體的嵌合體情況以及染色體的微缺失/微重復(fù)。而CMA的檢測(cè)費(fèi)用較昂貴，并且對(duì)于臨床意義未知(VOUS)的拷貝數(shù)變異(CNV)的臨床解釋有一定困難，增加孕婦的心理負(fù)擔(dān)。近些年新出的BoBs技術(shù)，不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)周期短，檢測(cè)通量較高，而且可以同時(shí)檢測(cè)常見的染色體的非整倍體異常以及九種常見的微缺失綜合征[8,10]。本研究運(yùn)用BoBs檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)對(duì)225例羊水細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行產(chǎn)前診斷，探索分析BoBs技術(shù)對(duì)有超聲軟指標(biāo)的高齡孕婦產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年1月至2020年10月于我院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科就診的225例有超聲軟指標(biāo)的高齡孕婦且拒絕染色體微陣列分析檢測(cè)的作為研究對(duì)象，孕周為18+2-32+1周，年齡為34-44歲，并且均為單胎妊娠。所有孕婦術(shù)前均簽署了產(chǎn)前診斷相關(guān)的知情同意書。

1.2 研究方法

羊膜腔穿刺常規(guī)腹部消毒鋪巾后，臨床醫(yī)生在超聲引導(dǎo)下，經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取30mL羊水，分別置于4支無菌離心管內(nèi)，其中20mL羊水分兩線獨(dú)立操作進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)用作染色體核型分析，另外5mL羊水用作產(chǎn)前BoBs檢測(cè)分析，最后5mL羊水經(jīng)離心后，將其細(xì)胞沉淀置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

染色體核型分析將2支15mL無菌離心管內(nèi)的羊水于1500rpm離心6min，然后由兩名實(shí)驗(yàn)室人員分兩線分別將羊水細(xì)胞沉淀接種于2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后依次經(jīng)過換液、秋水仙素作用、胰酶消化處理細(xì)胞、滴片制備、G顯帶染色，每個(gè)羊水標(biāo)本計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞分裂象，分析其中的3-5個(gè)細(xì)胞染色體核型，若分析到染色體異?；蛘叽嬖诙鄳B(tài)性，則增加計(jì)數(shù)至50個(gè)細(xì)胞分裂象，并且要增加細(xì)胞染色體核型分析數(shù)量。按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名標(biāo)準(zhǔn)2009(ISCN2009)進(jìn)行結(jié)果描述、出具報(bào)告。

BoBs檢測(cè)取5mL羊水于2000rpm離心10min，棄上清液，留取細(xì)胞沉淀，按照DNA提取試劑盒(Qiagen，美國)說明書操作步驟提取羊水細(xì)胞基因組DNA，用Nanodrop(Thermo，美國)檢測(cè)所提取DNA的濃度和純度，然后按照BACs-on-BeadsTM Assay試劑盒(Perkin Elmer，芬蘭)說明書操作步驟進(jìn)行BoBs檢測(cè)，依次包括DNA標(biāo)記，純化，雜交，洗滌，報(bào)告分子結(jié)合，Luminex 200(Luminex，美國)讀取數(shù)據(jù)，最后使用BoBsoft軟件分析結(jié)果。BoBs技術(shù)檢測(cè)范圍及探針分布見表1。

表1 BoBs技術(shù)檢測(cè)范圍及其探針設(shè)計(jì)分布

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 觀察指標(biāo)

隨訪對(duì)本研究中所有研究對(duì)象運(yùn)用門診聯(lián)合電話溝通的方法進(jìn)行隨訪妊娠結(jié)局，以便掌握孕婦以及胎兒的具體情況。

2 結(jié)果

2.1 胎兒超聲軟指標(biāo)異常情況

225例孕婦共檢查出10種胎兒超聲軟指標(biāo)異常，并且均為單項(xiàng)超聲軟指標(biāo)異常，具體見表2。

表2 胎兒超聲軟指標(biāo)異常情況

2.2 染色體核型分析

225例羊水標(biāo)本中，出現(xiàn)1例培養(yǎng)失敗(孕32+1周)，成功率為99.56%(224/225)。共檢測(cè)出染色體異常12例(5.36%，12/224)，其中染色體數(shù)目異常5例(41.67%，5/12)，染色體結(jié)構(gòu)異常5例(41.67%，5/12)，嵌合體2例(16.66%，2/12)。檢測(cè)到的染色體數(shù)目異常包括21-三體2例(40.00%，2/5)，性染色體數(shù)目異常3例(1例47，XXY，2例47，XYY)(60.00%，3/5)。檢測(cè)到的染色體結(jié)構(gòu)異常包括1例(20.00%，1/5)羅伯遜易位，核型為45，XN，rob(13；14)(q10；q10)，3例(60.00%，3/5)平衡易位，核型分別為46，XN，t(1；13)(q12；q14)、46，XN，t(5；8)(p13；p23)和46，XN，t(4；15) (q35；q12)，1例(20.00%，1/5)倒位，核型為46，XN，inv(20) (p13q13.1)。檢測(cè)到的2例染色體嵌合體核型分別為46，XN(45)/47，XN，+21(5)和45，X(7)/46，XY(43)。此外，還檢出染色體多態(tài)性2例(0.89%，2/224)，核型分別為46，XN，1qh+和46，XN，22ps+。不同超聲軟指標(biāo)，胎兒染色體核型異常檢出率不同，其中以NT增厚為穿刺指征的胎兒染色體核型異常檢出率最高(5例)，然后依次為鼻骨缺失、側(cè)腦室增寬及單臍動(dòng)脈(2例)，腎盂分離(1例)。見表3。

表3 不同超聲軟指標(biāo)異常與染色體異常結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況

2.3 BoBs檢測(cè)

225例羊水標(biāo)本均成功完成檢測(cè)，成功率為100%。BoBs檢測(cè)技術(shù)共檢測(cè)出染色體異常6例(2.67%，6/225)，其中染色體數(shù)目異常5例(83.33%，5/6)，染色體結(jié)構(gòu)異常1例(16.67%，1/6)。染色體數(shù)目異常包括21-三體2例(40.00%，2/5)，性染色體數(shù)目異常3例(1例XXY，2例XYY) (60.00%，3/5)。染色體結(jié)構(gòu)異常為1例微缺失綜合征，即DiGeorge綜合征Ⅰ型(22q11.2微缺失)。見圖1。不同超聲軟指標(biāo)，BoBs異常檢出率也不同，其中以NT增厚、鼻骨缺失異常檢出率最高(2例)，其次為三尖瓣輕度返流、單臍動(dòng)脈(1例)。見表3。

圖1 BoBs檢測(cè)異常結(jié)果A,B,C,D分別為XXY，XYY，21-三體和DiGeorge綜合征Ⅰ型

2.4 BoBs檢測(cè)技術(shù)和細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)的結(jié)果對(duì)比

在本研究中，BoBs檢測(cè)漏診了染色體平衡易位3例、羅伯遜易位1例、染色體倒位1例、染色體嵌合體2例及染色體多態(tài)性2例。染色體核型分析漏診了1例微缺失綜合征(DiGeorge綜合征Ⅰ型)。對(duì)比胎兒染色體異常檢出率，BoBs檢測(cè)(2.67%，6/225)要低于染色體核型分析(5.36%，12/224)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.754，P＜0.0005)。見表4。

表4 兩種檢測(cè)方法異常結(jié)果對(duì)比及妊娠結(jié)局

2.5 隨訪

在孕婦領(lǐng)取檢測(cè)報(bào)告后，對(duì)所有孕婦采取電話和門診相結(jié)合的方法隨訪其妊娠結(jié)局，其中2例21-三體綜合征、1例克氏綜合征、2例染色體嵌合體以及1例染色體微缺失胎兒隨即終止妊娠，其他孕婦均繼續(xù)妊娠。見表4。

3 討論

通過中國出生缺陷防治報(bào)告(2012)報(bào)道表明，目前我國的出生缺陷總的發(fā)生率大概在5.6%左右，而且每年新增加的出生缺陷數(shù)目大約有九十萬例左右，并且有研究表明染色體異常可能是導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的較常見原因之一[11]。隨著社會(huì)發(fā)展，現(xiàn)代女性推遲生育，加之國家“全面二孩”政策的調(diào)整，高齡孕婦比例激增，高齡孕婦由于配子質(zhì)量下降，發(fā)生出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)也增大[12]。胎兒超聲軟指標(biāo)是超聲檢查時(shí)常見的胎兒結(jié)構(gòu)細(xì)微改變，上世紀(jì)便開始用于臨床，且在染色體異常胎兒中出現(xiàn)率較高[13]。本研究顯示，不同超聲軟指標(biāo)，不同產(chǎn)前診斷檢測(cè)方法，胎兒染色體異常檢出率存在差異。

本研究中共有225例孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，其中染色體核型分析出現(xiàn)1例培養(yǎng)失敗，原因是由于孕婦孕周過大(孕32+1周)，導(dǎo)致羊水細(xì)胞無法貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)成功率為99.56%，共檢測(cè)出染色體異常12例，異常檢出率為5.36%。與BoBs檢測(cè)對(duì)比，漏檢1例微缺失綜合征，是由于染色體核型分析分辨率有限，難以檢出小于5-10 Mb的染色體異常[14]。BoBs檢測(cè)成功率為100%，共計(jì)檢測(cè)出染色體異常6例，異常檢出率為2.67%，與其他研究者的研究結(jié)果吻合[15]。與染色體核型分析對(duì)比，對(duì)于5對(duì)常見的染色體(13、18、21、X和Y)的非整倍體診斷，二者結(jié)果一致，但是未能檢出染色體平衡易位、羅伯遜易位、倒位及染色體多態(tài)性，是由于BoBs技術(shù)無法檢測(cè)染色體平衡性重排，超出其檢測(cè)范圍導(dǎo)致。對(duì)于染色體嵌合體的診斷，BoBs檢測(cè)漏檢2例。有研究報(bào)道，產(chǎn)前BoBs檢測(cè)可檢出嵌合比例低至20%-40%的樣本[16]。本研究中，由于染色體嵌合比例較低，導(dǎo)致漏檢，可見BoBs技術(shù)對(duì)嵌合體診斷能力有限。此外，本研究中，BoBs技術(shù)檢出1例微缺失綜合征，檢出率低于李怡梅等[14]研究結(jié)果，可能和樣本量少有一定關(guān)系。BoBs檢測(cè)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)，可以較好地提高染色體的異常檢出率，和國內(nèi)其他研究者的研究結(jié)果一致[17,18]。

本研究中，2例21-三體綜合征、1例克氏綜合征、2例染色體嵌合體以及1例染色體微缺失胎兒，經(jīng)遺傳咨詢后，隨即終止妊娠。而染色體平衡易位、羅伯遜易位、倒位及染色體多態(tài)性的胎兒，通過夫妻雙方染色體驗(yàn)證分析，其均遺傳自臨床表型正常的父母，經(jīng)過臨床遺傳咨詢后，這些孕婦均選擇繼續(xù)妊娠。此外，2例超雄綜合征胎兒，經(jīng)遺傳咨詢，慎重考慮后，選擇繼續(xù)妊娠。其他未檢出染色體異常胎兒均繼續(xù)妊娠。

與產(chǎn)前診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”染色體核型分析相比，BoBs技術(shù)具有快速診斷、通量高、無需細(xì)胞培養(yǎng)、結(jié)果易于判讀及可檢測(cè)染色體微缺失/微重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在其局限性，如無法檢測(cè)到探針未覆蓋的區(qū)域、倍性變化、甲基化、點(diǎn)突變、平衡性重排、單親二倍體及某些染色體嵌合體等。二者具有一定的互補(bǔ)作用，BoBs檢測(cè)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)，能夠使得產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性得到提高，避免醫(yī)療糾紛，降低出生缺陷，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得推廣。